Padronização microfluídica e rastreamento baseado em fluorescência do crescimento bacteriano de célula única

Comece com uma cultura bacteriana marcada com fluorescência adicionada a um tampão livre de carbono.

Centrifugue para pellet as bactérias e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um tampão fresco sem carbono contendo um detergente neutro.

A falta de uma fonte de carbono interrompe o crescimento, enquanto o detergente evita a aglomeração e mantém as células suspensas.

Carregue a suspensão bacteriana em uma seringa e conecte-a a uma bomba.

Injete a suspensão na entrada de um chip microfluídico contendo um canal com armadilhas embutidas no piso.

Retire lentamente o líquido da saída do canal.

À medida que o líquido recua, as forças capilares guiam as bactérias em direção à saída.

Nesse processo, células bacterianas individuais se instalam nas armadilhas, resultando em padrões bacterianos.

Lave o canal com um caldo pré-aquecido e rico em nutrientes continuamente.

As bactérias retomam o crescimento e formam microcolônias dentro das armadilhas.

Use microscopia de fluorescência para capturar imagens de lapso de tempo e analisar o crescimento bacteriano em um ambiente controlado.

Pipete um mililitro de meio MOPS em um frasco de centrífuga e adicione 10 microlitros de fosfato de potássio 0,132 molar.

Alíquota de 100 microlitros da cultura durante a noite no frasco da centrífuga e centrifugue a cultura a 2.300 vezes g por dois minutos. Descarte suavemente o sobrenadante para ressuspender o pellet em um mililitro de meio MOPS fresco com 0,015% de Tween 20 e 0,01% de fosfato de potássio e carregue a suspensão bacteriana em uma seringa de um mililitro. Para prender a seringa e a conexão do tubo, insira diretamente uma agulha no tubo.

Agora monte a seringa na bomba da seringa e injete a suspensão no chip microfluídico através da entrada localizada na parte a montante do canal até que a suspensão cubra a região do gabarito com armadilhas. Defina a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto para retirar a suspensão bacteriana e monitorar o processo de padronização por meio do software do microscópio. Uma vez que o molde tenha sido padronizado com células, aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluídico e lave-o com LB fresco que foi previamente desgaseificado por pelo menos 30 minutos e pré-aquecido a 30 graus Celsius.

Agora defina a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de dois microlitros por minuto para lavar suavemente o canal. Uma vez que o canal tenha sido preenchido, aumente novamente a taxa de fluxo. Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação e intervalo de tempo desejados.