Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos
28 de julho de 2016
Este protocolo descreve o rápido enriquecimento de leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma subsequente determinação específica da atividade da peroxidase halogenante dentro das células. O método pode ser aplicado a material humano e não humano e pode contribuir para a avaliação de novos marcadores inflamatórios.
O objetivo geral deste método de esgotamento de eritrócitos é obter um enriquecimento rápido e simples de leucócitos a partir de uma pequena amostra de sangue. Muitas vantagens desta técnica são seu baixo custo, confiabilidade e rapidez. Além disso, pode ser aplicada a amostras de sangue humano e não humano.
Antes de iniciar o procedimento de lise, ajuste a pipeta para administração de água em dois mililitros e a pipeta para PBS em cinco mililitros. Em seguida, coloque frascos abertos de água e PBS sob uma capela de fluxo laminar à temperatura ambiente. Como a lise hipotônica é um processo crítico no tempo, tudo deve ser preparado previamente.
Além disso, o procedimento de lise deve sempre ser realizado da mesma maneira, para se obterem resultados comparáveis. Em seguida, transfira 100 microlitros de cada amostra de sangue para um tubo cônico de 15 mililitros. E adicione dois mililitros de água destilada a cada amostra, agitando em vórtex na velocidade média.
Deixe as células em repouso por 60 segundos, depois adicione cinco mililitros de PBS. E misture as amostras por vortex. Agora, recolha as células por centrifugação e despreze os sobrenadantes.
Inverta os tubos e bata nas aberturas sobre uma toalha de papel para remover o máximo de líquido possível. Em seguida, repita o procedimento de lise hipotônica conforme acabou de ser demonstrado. Após obter um pellet seco pela segunda vez, re-suspenda cada amostra em 500 microlitros de HBSS, até obter uma solução homogênea.
E transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro em gelo. Para verificar a especificidade da peroxidase nas amostras após a coloração com amino fenol fluoresceína, ou APF, adicione primeiro cinco microlitros do inibidor de peroxidase hêmica, 4-ABAH, às amostras apropriadas para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco microlitros da solução de trabalho de APF a cada tubo e vortexe suavemente as células na velocidade média.
Incube todas as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros da solução de trabalho de peróxido de hidrogênio a cada amostra e vortexe suavemente os tubos. Após 60 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue as células e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os pellets.
Por fim, re-suspenda as células em 250 microlitros de HBSS e armazene as amostras no escuro até a análise, para evitar o desbotamento fotográfico. Aqui, é apresentado um exemplo representativo das populações de leucócitos após a lise hipotônica e coloração com APF, conforme acabou de ser demonstrado. Ao representar graficamente o tamanho celular versus a granularidade, pode-se observar a acentuada redução dos eritrócitos, com a população de hemácias e detritos correspondendo a apenas 22% dos eventos.
Além disso, a distribuição da intensidade da fluorescência derivada do APF facilita uma clara discriminação entre eritrócitos e linfócitos negativos para peroxidase, com oxidação moderada de APF observada em monócitos e eosinófilos positivos para peroxidase, e uma oxidação robusta de peroxidase exibida pelos neutrófilos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser aplicada a até 50 amostras de sangue em paralelo, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como coloração com anticorpos, podem ser realizados para identificar os subconjuntos celulares de interesse.
Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de estudos com pequenos animais explorarem o papel da atividade halogenante da MPO e da EPO em modelos animais de doenças inflamatórias crônicas.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método rápido e simples para enriquecer leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue, aplicável a materiais tanto humanos quanto não humanos. A técnica é econômica e confiável, facilitando a avaliação de novos marcadores inflamatórios.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Biologia Celular
Contexto
- O enriquecimento de leucócitos é essencial para o estudo das respostas imunes.
- Os métodos tradicionais podem ser demorados e complexos.
- Este método tem como objetivo simplificar o processo.
- Pode ser utilizado tanto para amostras de sangue humano quanto não humano.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo rápido de enriquecimento de leucócitos.
- Avaliar a atividade de peroxidase halogenante em leucócitos.
- Contribuir para a identificação de marcadores inflamatórios.
Métodos Utilizados
- Preparação de pipetas para administração de água e PBS.
- Uso de capela de fluxo laminar para o processamento de amostras.
- Lise hipotônica para esgotamento de eritrócitos.
- Execução do procedimento de lise com sensibilidade ao tempo.
Resultados Principais
- Enriquecimento bem-sucedido de leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue.
- Avaliação confiável da atividade de peroxidase.
- Viabilidade para amostras humanas e não humanas.
- Potencial para avaliar novos marcadores inflamatórios.
Conclusões
- O método é eficiente e econômico.
- Ele aprimora o estudo das respostas imunológicas.
- Pesquisas futuras podem se basear neste protocolo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o enriquecimento rápido e padronizado de leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue, apoiando esforços iniciais de descoberta na pesquisa de doenças inflamatórias. Ao quantificar a atividade peroxidase halogenante da MPO e da EPO, fornece uma leitura mecanicista para validação de alvos e redução de riscos de vias. A compatibilidade do método com citometria de fluxo e coloração com anticorpos facilita sua integração em fluxos de trabalho de triagem e tradução clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da atividade de peroxidase específica de leucócitos para validar MPO e EPO como alvos terapêuticos na inflamação crônica.
- Valor Operacional: Utiliza volume mínimo de amostra (50–100 µL), permitindo amostragens repetidas em modelos animais pequenos para estudos longitudinais de engajamento de alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Combina a coloração com APF com citometria de fluxo para gerar leituras quantitativas baseadas em fluorescência da produção de HOCl/HOBr para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite o processamento em alto rendimento de até 50 amostras em paralelo, apoiando campanhas escaláveis de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a atividade da peroxidase de leucócitos com processos inflamatórios relevantes para doenças, apoiando o alinhamento de biomarcadores em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Funciona com sangue humano e de roedores, permitindo continuidade translacional entre espécies na validação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, especialmente em programas de imunologia e doenças inflamatórias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da atividade peroxidásica específica em populações purificadas de leucócitos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis por meio da fluorescência APF e citometria de fluxo, permitindo a avaliação do efeito de compostos sobre a atividade peroxidásica.
- Análises: Gera dados mensuráveis de intensidade de fluorescência que permitem comparar subpopulações de células positivas para peroxidase (neutrófilos, monócitos, eosinófilos) em condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a atividade peroxidásica aos mecanismos das doenças inflamatórias, apoiando a continuidade pré-clínica quando combinada à marcação de marcadores de superfície celular.
- Reutilização Corporativa: O enriquecimento padronizado de leucócitos e a detecção baseada em APF formam uma plataforma reutilizável para múltiplos programas com alvos inflamatórios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao isolar a atividade de peroxidase em linhagens específicas de leucócitos.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo de baixo custo e rápido, exigindo instrumentação mínima (centrífuga, vórtex, citômetro de fluxo).
- Valor Estratégico: Reduz os prazos de desvio biológico ao permitir avaliação rápida e iterativa da modulação de alvos em amostras de leucócitos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de inibidores de MPO/EPO ao fornecer dados precoces de atividade funcional obtidos de células fisiologicamente relevantes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de leucócitos, citometria de fluxo e química de sondas fluorescentes.
- Depende do acesso a centrífugas, vórtex, capelas de fluxo laminar e citômetros de fluxo com canais de fluorescência apropriados.
- Necessita padronização das soluções de trabalho de APF e peróxido de hidrogênio entre laboratórios para resultados reprodutíveis.
- A adaptação a espécies não humanas exige validação da expressão de peroxidase e da eficiência da coloração com APF em subpopulações-alvo de leucócitos.
- Limita-se à detecção de atividade de peroxidase halogenante; não mede outras funções de leucócitos, a menos que combinada com ensaios adicionais.
