Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos

O objetivo geral deste método de depleção de eritrócitos é obter um enriquecimento de leucócitos rápido e simples a partir de uma pequena amostra de sangue. Muitas vantagens dessa técnica são que ela é barata, confiável e rápida. Além disso, pode ser aplicado a amostras de sangue humano e não humano.

Antes de iniciar o procedimento de lise, ajuste a pipeta para administração de água para dois mililitros e a pipeta para PBS para cinco mililitros. Em seguida, coloque frascos abertos de água e PBS sob uma capela de fluxo laminar à temperatura ambiente. Como a lise hipotônica é um processo de tempo crítico, tudo deve ser preparado previamente.

Além disso, o processo de lise deve ser sempre feito da mesma forma, para ter resultados compatíveis. Em seguida, transfira 100 microlitros de cada amostra de sangue para um tubo cônico de 15 mililitros. E adicione dois mililitros de água destilada a cada amostra com vórtice na configuração média.

Descanse as células por 60 segundos e, em seguida, adicione cinco mililitros de PBS. E misture as amostras por vórtice. Agora, colete as células por centrifugação e decanta os sobrenadantes.

Inverta os tubos e bata nas aberturas em uma toalha de papel para remover o máximo de líquido possível. Em seguida, repita o procedimento de lise hipotônica como acabamos de demonstrar. Após obter um pellet seco pela segunda vez, ressuspender cada amostra em 500 microlitros de HBSS, até obter uma solução homogênea.

E transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo. Para verificar a especificidade da peroxidase das amostras após a coloração com aminofenol fluoresceína, ou APF, primeiro adicione cinco microlitros do inibidor da heme peroxidase, 4-ABAH, às amostras apropriadas para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco microlitros de solução de trabalho APF a cada tubo e subtraia suavemente as células na configuração média.

Incube todas as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros de solução de trabalho de peróxido de hidrogênio a cada amostra e subtraia suavemente os tubos. Após 60 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue as células e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os pellets.

Por fim, ressuspenda as células em 250 microlitros de HBSS e armazene as amostras no escuro até sua análise, para evitar o fotobranqueamento. Aqui, é mostrado um exemplo representativo das populações de leucócitos após lise hipotônica e coloração de APF, como acabamos de demonstrar. Ao traçar o tamanho da célula versus a granularidade, a depleção robusta dos eritrócitos pode ser observada, com a população de glóbulos vermelhos e detritos respondendo por apenas 22% dos eventos.

Além disso, a distribuição de intensidade da fluorescência derivada de APF facilita uma discriminação clara dos eritrócitos e linfócitos negativos para peroxidase, com uma oxidação moderada de APF observada, para os monócitos e eosinófilos positivos para peroxidase, e uma oxidação robusta da peroxidase exibida pelos neutrófilos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser aplicada a até 50 amostras de sangue em paralelo, se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como coloração de anticorpos, podem ser realizados para identificar os subconjuntos de células de interesse.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de estudos de pequenos animais explorarem o papel da atividade halogenante de MPO e EPO em modelos animais para doenças inflamatórias crônicas.