Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

O objetivo geral deste protocolo é usar ferramentas de análise digital para fazer rapidamente contagens precisas de células em uma suspensão ou em uma migração em uma membrana de ensaio de invasão. Este protocolo pode ajudar os pesquisadores a quantificar o número de células necessárias para técnicas comuns e ensaios de motilidade celular in vitro. A principal vantagem desse método é que ele fornece contagens de células rápidas e precisas, incluindo vários filtros e ferramentas de análise.

Para começar, defina a iluminação do microscópio para o máximo. Mude para a objetiva 4x e certifique-se de que os filtros de contraste de fase estejam em uso. Em seguida, no software do microscópio, defina as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.

Agora coloque um hemocitômetro padrão no microscópio stage e capture uma imagem para a etapa de calibração do volume da imagem. Ajuste o tempo de exposição conforme necessário. No ImageJ, na calculadora de concentração de células, abra a imagem e clique no botão Obter dimensão da imagem.

Esta ação preenche as caixas de texto de largura e altura da imagem com a resolução da imagem em pixels. Em seguida, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha reta em todo o comprimento do quadrado p primário do hemocitômetro clicando e arrastando o cursor. Em seguida, pressione a tecla M para exibir a janela de resultados.

Agora, digite o valor da coluna de comprimento na caixa de texto comprimento p-quadrado na calculadora de concentração de células. Em seguida, clique no botão Calcular volume da imagem para exibir o volume da imagem na caixa de texto do volume da imagem. Por fim, clique no botão Salvar para concluir a calibração do plug-in.

Para análise de amostra, carregue 10 microlitros de células em ambas as câmaras de uma lâmina de hemocitômetro e ajuste o foco para que o interior das células fique mais escuro que a membrana celular para fornecer foco dentro da seção transversal central da célula e não nos pólos. Em seguida, ajuste ainda mais a exposição para que as células não fiquem superexpostas. Linhas de hemocitômetro levemente visíveis são aceitáveis.

Agora, capture de cinco a dez imagens não sobrepostas da região central do hemocitômetro. A resolução e a ampliação de cada imagem devem ser as mesmas da imagem de calibração de volume. Em seguida, na calculadora de concentração de células, clique em Contar células e, na janela pop-up, selecione uma pasta a ser contada.

Em seguida, na caixa de entrada do número da amostra, insira o número de imagens tiradas por câmara e clique em OK. O plug-in agora coletará os dados. Veja o texto para mais detalhes. Para começar, no software do microscópio, defina as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.

Para o estágio do escopo de dissecação, use um fundo branco sólido e use uma fonte de luz acima do palco, de preferência duas luzes LED flexíveis. Agora, coloque uma lâmina de membrana de ensaio de migração completa no palco. Olhando para a imagem em tempo real exibida pelo software, ajuste manualmente a ampliação para que as bordas de uma única membrana fiquem dentro do campo de visão da câmera.

Em seguida, ajuste as posições da fonte de luz e os tempos de exposição para reproduzir, o mais próximo possível, a imagem ideal. Que tem cor de fundo mínima e uma membrana uniformemente iluminada. A precisão da contagem de células depende da aquisição de imagens de alta qualidade.

Portanto, é importante capturar a melhor imagem possível pela câmera do usuário para o uso mais eficiente dos plug-ins. Agora, remova a lâmina e equilibre a imagem no software do microscópio para concluir a calibração. Imediatamente antes de obter imagens, alise cada membrana aplicando pressão na lamínula para remover o maior número possível de bolhas presas.

Agora, dentro do software, defina o local da pasta de captura. Em seguida, capture uma imagem por membrana, salvando os arquivos de imagem como TIFs usando a convenção de nomenclatura da amostra 001 com aumentos incrementais no número de cada imagem. Essa convenção de nomenclatura é necessária para que o plug-in encontre os arquivos.

Se a correção de campo plano for desejada, para cada slide, encontre uma área vazia e tire uma imagem em branco. Salve o arquivo como nome de exemplo em branco. Em seguida, no ImageJ, abra o plug-in TC.

No TC, clique no botão Flatfield e, na caixa de diálogo Choose Directory, selecione a pasta onde as imagens de membrana foram salvas. Agora, abra uma imagem de membrana de ensaio de migração e selecione Limite de cor. Na janela, defina o método como Shanbhag.

Defina a cor do limite como branco. Defina o espaço de cores para RGB e desmarque a opção de fundo escuro. Em seguida, ajuste os controles deslizantes superiores para zero e os controles deslizantes inferiores para 255 para tornar a imagem totalmente branca.

Quando estiver branco, ajuste os controles deslizantes verde e vermelho até que apenas os núcleos fiquem visíveis. No plug-in TC, copie os valores dos controles deslizantes RGB nas caixas de texto de limite RGB de definições de configuração associadas. Em seguida, clique no botão Adicionar/Modificar e substitua a configuração.

No painel de definições de configuração, clique em Salvar para gravar as configurações no disco rígido. Agora, para contar as imagens com o plugin TC, clique em Count Folder e selecione a pasta a ser contada. O programa processará as imagens e adicionará automaticamente os dados à tabela principal.

Agora, na tabela principal, haverá uma marca de seleção no menu Calibrar? A coluna se na imagem for sinalizada para calibração com base em sua semelhança com as métricas ideais. Selecione todas as amostras sinalizadas para calibração.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Recontagem e tamanho sugerido. Isso recontará as imagens com a área mínima de partícula sugerida. Em seguida, clique com o botão direito do mouse novamente e selecione Mostrar plotagem.

Uma imagem ideal terá um gráfico semelhante a uma longa distribuição normal de cauda direita. Se necessário, ajuste a faixa de tamanho inferior ou as configurações de limite RGB selecionando a amostra, clicando com o botão direito do mouse e selecionando Recontagem e configurações manuais. Em seguida, insira as configurações desejadas e clique em Contagem para recontar a imagem.

Para ajustar as contagens manualmente, selecione as amostras, clique com o botão direito do mouse na tabela e selecione Abrir imagem com contagens. A imagem original será aberta com marcas vermelhas que representam cada partícula contada pelo plugin. Além disso, a opção Mostrar imagem binária contada pode ser usada para verificar o quão bem as células individuais estão sendo resolvidas pelo limite de cores.

Para adicionar manualmente uma contagem, mantenha a tecla control pressionada e clique com o botão esquerdo. Isso adicionará um marcador no local do cursor que é adicionado à contagem total. Para remover manualmente um marcador, clique com o botão direito do mouse na imagem e o plug-in removerá o marcador mais próximo do cursor.

Para remover um grupo de marcadores, selecione uma região de interesse e clique com o botão direito do mouse na região enquanto mantém pressionada a tecla de controle. O processo da calculadora de concentração de células depende da imagem de calibração do p-quadrado e do cálculo do comprimento e pixels do p-quadrado. O quadrado p de um hemocitômetro tem um volume de 100 nanolitros e, dada essa constante, o volume total da imagem pode ser calculado após a conversão de pixels em milímetros.

Uma comparação de contagens manuais e automatizadas em 57 imagens de vários experimentos e tipos de células mostra que há uma correlação muito estreita entre os dois métodos. Concentrações entre cinco milhões e 2.000 células por mililitro foram contadas com precisão usando o processo automatizado. A métrica Q representa a clareza geral das imagens com base na distribuição de tamanhos de partículas distintos.

Um Q adequado é maior que 0,5. Aplicando esses qualificadores a uma seleção de imagens modestas a excelentes em relação ao brilho e ruído de fundo, as contagens de imagens calibradas estavam significativamente mais próximas das contagens manuais do que as contagens de imagens não calibradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como contar com precisão e eficiência as células em suspensão e a partir de ensaios de motilidade celular usando os plug-ins CCC e TC ImageJ.

Uma vez que o plug-in TC é dominado, em que a aquisição, quantificação e ajuste de contagens de células podem ser feitas em menos de uma hora. Ambos os plug-ins contam com o recurso de contagem de partículas do ImageJ e podem ser modificados editando as macros usadas pelo ImageJ. Isso oferece maior flexibilidade para o usuário expandir o escopo dos plug-ins para outras partículas.