Name: Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar células automaticamente usando plugins do ImageJ para análise de hemocitômetro e ensaios de migração. Este método open-source oferece contagens rápidas e precisas para pesquisa em biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde para CP (OR 142730 e OR 89931). Gostaríamos de agradecer a Jelena Brkic por sua ideia inicial de análise de partículas binárias no ImageJ.

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas críticas, solução de problemas e limitações A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. Por isso, é da maior...

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e 1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens 3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coulter tirar vantagem das células de resistência elétrica para determinar o número e tamanho das células. Eles são rápidos, precisos e mais baratos do que citómetros de fluxo. No entanto, eles raramente são usados apenas para contagem de células devido ao seu custo considerável em comparação com a contagem manual 3. Fluxo citómetros, por outro lado, são caros, mas eles têm muitas aplicações, tais como a contagem celular, análise da forma de células, rructure e célula de medição interna marcadores de 4,5. As máquinas que utilizam qualquer um destes dois princípios estão disponíveis de vários fabricantes. Contagem manual é acessível, mas demorado e sujeito a polarização, enquanto os métodos automáticos vêm com uma fracção do tempo requerido para a contagem manual, mas utilizando máquinas caras 6. Outros procedimentos de cultura de células são comum em ensaios de motilidade das células in vitro, isto é, a migração celular e invasão 7. Os ensaios de migração e invasão são comumente utilizados para investigar a mobilidade celular e capacidade invasiva, em resposta a uma resposta quimiotáctica. Além disso, eles são amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário, a diferenciação, a resposta inflamatória, e a metástase de vários tipos de células 7-11. As células que migraram ou invadem através da membrana porosa de um ensaio de migração pode ser quantificada de duas formas diferentes. Em primeiro lugar, por coloração das células com um corante fluorescente, de dissociação from a membrana, e a quantificação utilizando um leitor fluorescente 12. Uma limitação deste método de quantificação é que nenhuma ficha pode ser retida de membranas e não há nenhuma possibilidade para análise posterior 13. O segundo método de quantificação é de migraram / células a serem fixadas e coradas com corante fluorescente ou, mais comumente, com corantes citológicos como cristal violeta, toluidine corante azul ou hematoxilina invadidos; em seguida, as células são quantificados usando manualmente imagens microscópicas invertidos destas membranas que é uma tarefa demorada muito 12,13. Para ultrapassar os inconvenientes da contagem manual de células, foram desenvolvidos dois contadores de células automatizado fiáveis ​​e precisos para a concentração de células e para o ensaio de migração. Estes contra algoritmos celulares automatizados foram desenvolvidos para ImageJ como um plug-in utilizando a linguagem de programação Java da Oracle. ImageJ é uma ferramenta de processamento de imagem pública e amplamente utilizado, desenvolvido pelo Instituto Nacional de HeaLTH (NIH) 14,15; Assim, escrever esses plugins para ImageJ facilita a fácil integração com a comunidade biológica. Automatização de contagem de células garante alto rendimento e reprodutibilidade em relação à contagem manual. Embora outro software disponível e encaixes podem ser utilizados para calcular a concentração de células por meio de análise de imagem 5,16,17, celular Concentração de encaixe calculadora é rápido e pode também lidar com diluições de células e tratamentos. Além disso, todos os resultados e cálculos destes dois contadores podem ser salvos e exportados. Os dois encaixes descritos no presente documento são optimizados para o uso de um microscópio de contraste de fase para imagens de células vivas e grande campo de visão (toda a captura de membrana) de imagiologia para membranas ensaio de migração através do uso de um escopo de dissecação. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Mídia Líquida Clássica: RPMI 1640 - Com L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Mídia de cultura celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Fornecimento de mídia</td></tr><tr><td>Linha celular de trofoblasto HTR8/SVneo</td><td>As células foram obtidas do Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)</td><td></td><td>O software foi projetado para funcionar com qualquer linhagem celular.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Preparado como 0,20% (p/v) em 10 &micro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 10 cm</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Qualquer placa tratada com cultura de tecidos será adequada</td></tr><tr><td>Inserções de Membrana de Poliéster Transwell - 8.0&nbsp; &micro; m Tamanho dos poros</td><td>Costar 3422 encomendado à Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>Para placas de 24 poços; Tamanho do poro: 8.0 &micro; m; 6,5 mm de diâmetro; 0,33 cm2 área de crescimento</td></tr><tr><td>HARLECO Corantes e reagentes de hematologia, EMD Millipore - Soluções 1, 2 e 3</td><td>EMD Millipore e encomendado de VWR</td><td>65044A, B, & O</td><td>conjunto de corantes C Hemacolor consiste em três frascos de polietileno de 500 ml (16,9 oz.) e inclui um fixador de metanol (Solução 1), um corante de eosina ou ácido (Solução 2) e um corante azul de metileno ou básico (Solução 3)</td></tr><tr><td>Aplicador com ponta de algodão</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear industriais de borda única</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Espessura: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio - Pré-limpas/Simples</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimensões: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Retângulos no. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Espessura: 0.13 a 0.17 mm; Tamanho: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscópio de dissecação estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>O microsope está equipado com a câmera de microscópio Leica Modelo MC170 HD e o software da câmera é Leica App. Suite (LAS E2) Versão 3.1.1 [Compilação: 490]. Peças de microscópio:&nbsp; LED3000 Iluminação de Luz de Spot Modelo: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90&nbsp; mm Modelo: MOB306 & Objetiva acromática 0.32X, WD=303&nbsp; mm Modelo: MOB315, Objetiva de Vídeo 0.5X Modelo: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Assistant Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>0,100 mm Profundidade - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Olympus microscópio de luz invertida</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>O microsope está equipado com Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & software da câmera é Infinity analyze Versão 6.5.2</td></tr><tr><td>Gabinete de fluxo laminar 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 1375</td><td>Qualquer gabinete de fluxo laminar para trabalho de cultura de células será adequado&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura celular</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 370</td><td>Qualquer incubadora de cultura de células será adequada - As células foram cultivadas em ambiente umidificado, 5% CO2, 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Versão 1.50e</td><td>Versão mínima necessária</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Versão 1.8.0_66</td><td>Versão mínima necessária</td></tr></tbody></table>

automated quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Calculadora celular Concentração A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54719...

Este artigo descreve a quantificação de hemocitômetro e micrografias de migração/invasão por meio de dois novos plug-ins ImageJ de código aberto: Cell Concentration Calculator e migration assay Counter. Além disso, descreve os protocolos de aquisição e calibração de imagens, bem como discute em detalhes os requisitos de entrada dos plug-ins.

Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar ferramentas de análise digital para realizar rapidamente contagens precisas de células em uma suspensão ou em uma membrana de ensaio de migração e invasão. Este protocolo pode ajudar pesquisadores a quantificar o número de células necessário para técnicas comuns e ensaios de motilidade celular in vitro. A principal vantagem deste método é que ele fornece contagens rápidas e precisas de células, incluindo múltiplos filtros e ferramentas de análise.Para começar, ajuste a iluminação do microscópio ao máximo. Alterne para a objetiva de 4x e certifique-se de que os filtros de contraste de fase estão em uso. Em seguida, no software do microscópio, defina as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.Agora, coloque um hemocitômetro padrão sobre a platina do microscópio e capture uma imagem para a etapa de calibração do volume da imagem. Ajuste o tempo de exposição conforme necessário. No ImageJ, no menu do calculador de concentração celular, abra a imagem e clique no botão Obter Dimensão da Imagem.Esta ação preenche as caixas de texto de largura e altura da imagem com a resolução da imagem em pixels. Em seguida, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha reta ao longo de todo o comprimento do quadrado primário p do hemocitômetro, clicando e arrastando o cursor. Depois, pressione a tecla M para exibir a janela de resultados.Agora, digite o valor da coluna de comprimento na caixa de texto comprimento do p-quadrado na calculadora de concentração celular. Em seguida, clique no botão Calcular Volume da Imagem para exibir o volume da imagem na caixa de texto volume da imagem. Por fim, clique no botão Salvar para concluir a calibração do plugin.Para a análise da amostra, carregue 10 microlitros de células em ambas as câmaras de uma lâmina de hemocitômetro e ajuste o foco para que o interior das células fique mais escuro que a membrana celular, proporcionando foco na seção transversal central da célula e não nos polos. Em seguida, ajuste ainda mais a exposição para que as células não fiquem superexpostas. Linhas ligeiramente visíveis do hemocitômetro são aceitáveis.Agora, capture cinco a dez imagens não sobrepostas da região central do hemocitômetro. A resolução e a ampliação de cada imagem devem ser as mesmas utilizadas na imagem de calibração de volume. Em seguida, no calculador de concentração celular, clique em Contar Células e, na janela pop-up, selecione uma pasta para ser contada.Em seguida, no campo de entrada de número de amostras, insira o número de imagens capturadas por câmara e clique em OK. O plugin agora coletará os dados. Veja o texto para obter mais detalhes. Para começar, dentro do software do microscópio, configure as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.Para o estágio do microscópio de dissecação, utilize um fundo branco sólido e uma fonte de luz acima do estágio, preferencialmente duas luzes LED flexíveis. Agora, coloque uma lâmina com membrana de ensaio de migração concluída sobre o estágio. Observando a imagem em tempo real exibida pelo software, ajuste manualmente a ampliação de modo que as bordas de uma única membrana fiquem exatamente dentro do campo de visão da câmera.Em seguida, ajuste as posições das fontes de luz e os tempos de exposição para reproduzir, o mais fielmente possível, a imagem ideal, que apresenta cor de fundo mínima e uma membrana uniformemente iluminada. A precisão da contagem de células depende da aquisição de imagens de alta qualidade.Portanto, é importante capturar a melhor imagem possível alcançada pela câmera do usuário para o uso mais eficiente dos plugins. Agora, remova a lâmina e faça o balanceamento de branco da imagem no software do microscópio para concluir a calibração. Imediatamente antes da aquisição de imagens, aplainar cada membrana aplicando pressão sobre a lamínula para remover o maior número possível de bolhas aprisionadas.Agora, dentro do software, defina o local da pasta de captura. Em seguida, capture uma imagem por membrana, salvando os arquivos de imagem como TIFs usando a convenção de nomenclatura da amostra 001, com incrementos numéricos sucessivos para cada imagem. Essa convenção de nomenclatura é necessária para que o plugin localize os arquivos.Se a correção de planicampo for desejada, para cada lâmina localize uma área vazia e capture uma imagem em branco. Salve o arquivo como nome_da_amostra_em_branco. Em seguida, no ImageJ, abra o plugin TC.Dentro do TC, clique no botão Flatfield e, na caixa de diálogo Escolher Diretório, selecione a pasta onde as imagens da membrana foram salvas. Agora, abra uma imagem da membrana de ensaio de migração e selecione Limite de Cor. Na janela, defina o método como Shanbhag.Defina a cor do limiar como branca. Defina o espaço de cor como RGB e desmarque a opção de fundo escuro. Em seguida, ajuste os controles deslizantes superiores para zero e os inferiores para 255 para tornar a imagem completamente branca.Uma vez branca, ajuste os controles deslizantes verde e vermelho até que apenas os núcleos sejam visíveis. No plugin TC, copie os valores dos controles deslizantes RGB para as caixas de texto correspondentes nas configurações de limiar RGB. Em seguida, clique no botão Adicionar/Modificar e sobrescreva a configuração.No painel de configurações, clique em Salvar para gravar as configurações no disco rígido. Agora, para contar as imagens com o plugin TC, clique em Contar Pasta e selecione a pasta a ser contada. O programa processará então as imagens e adicionará automaticamente os dados à tabela principal.Agora, na tabela principal, haverá uma marca de seleção na coluna Calibrar? se a imagem for marcada para calibração com base na semelhança com as métricas ideais. Selecione todas as amostras marcadas para calibração.Em seguida, clique com o botão direito e selecione Recalcular e Tamanho Sugerido. Isso recalcula as imagens com a área mínima sugerida de partículas. Depois, clique novamente com o botão direito e selecione Mostrar Gráfico.Uma imagem ideal apresentará um gráfico semelhante a uma distribuição normal com cauda longa à direita. Se necessário, ajuste a faixa inferior de tamanho ou as configurações de limite RGB selecionando a amostra, clicando com o botão direito e escolhendo Recontar e Configurações Manuais. Em seguida, insira as configurações desejadas e clique em Contar para recontar a imagem.Para ajustar as contagens manualmente, selecione as amostras, clique com o botão direito na tabela e selecione Abrir imagem com contagens. A imagem original será aberta com marcas vermelhas que representam cada partícula contada pelo plugin. Além disso, a opção Mostrar imagem binária contada pode ser usada para verificar quão bem as células individuais estão sendo resolvidas pelo limiar de cor.Para adicionar manualmente uma contagem, mantenha a tecla control pressionada e clique com o botão esquerdo. Isso adicionará uma marcação na posição do cursor, que será incluída na contagem total. Para remover manualmente uma marcação, clique com o botão direito na imagem e o plugin removerá a marcação mais próxima do cursor.Para remover um grupo de marcadores, selecione uma região de interesse e clique com o botão direito na região enquanto mantém pressionada a tecla controle. O processo do calculador de concentração celular depende da imagem de calibração do p-quadrado e do cálculo do comprimento e dos pixels do p-quadrado. O p-quadrado de um hemocitômetro possui um volume de 100 nanolitros, e, dado essa constante, o volume total da imagem pode ser calculado após a conversão de pixels para milímetros.Uma comparação entre contagens manuais e automatizadas em 57 imagens provenientes de diversos experimentos e tipos celulares mostra que há uma correlação muito estreita entre ambos os métodos. Concentrações entre cinco milhões e 2.000 células por mililitro foram contadas com precisão utilizando o processo automatizado. A métrica Q representa a clareza geral das imagens com base na distribuição de tamanhos de partículas distintas.Um Q adequado é maior que 0,5. Aplicando esses critérios a uma seleção de imagens de qualidade moderada a excelente em relação ao brilho e ao ruído de fundo, as contagens de imagens calibradas foram significativamente mais próximas das contagens manuais do que as contagens de imagens não calibradas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como contar com precisão e eficiência células em suspensão e provenientes de ensaios de motilidade celular utilizando os plugins CCC e TC do ImageJ.Uma vez dominado o plugin TC, no qual a aquisição, quantificação e ajuste das contagens celulares podem ser realizados em menos de uma hora. Ambos os plugins dependem da função de contagem de partículas do ImageJ e podem ser modificados pela edição das macros utilizadas pelo ImageJ. Isso oferece maior flexibilidade ao usuário para expandir o escopo dos plugins a outras partículas.

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Biologia

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Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.

Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Este método quantifica a abundância microbiana usando um formato de placa de 96 poços para unidades formadoras de colônias de placas (UFCs) e é aplicado ao microbioma Drosophila em amostras inteiras de homogeneização de moscas. As CFUs são contadas com um software automatizado de análise de imagens fornecido aqui.

Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila

Este artigo descreve métodos passo a passo para automatizar a quantificação de núcleos baseada em imagem usando um programa executável de código aberto validado em uma variedade de densidades de células. Este programa fornece uma alternativa que aborda as barreiras relacionadas ao custo, acessibilidade para usuários com habilidades tecnológicas limitadas e validação específica do aplicativo que pode limitar a utilidade das tecnologias existentes.

Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

Aprenda a quantificar células automaticamente usando plugins do ImageJ para análise de hemocitômetro e ensaios de migração. Este método open-source oferece contagens rápidas e precisas para pesquisa em biologia celular.

Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

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