Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

O objetivo geral deste protocolo é utilizar ferramentas de análise digital para realizar rapidamente contagens precisas de células em uma suspensão ou em uma membrana de ensaio de migração e invasão. Este protocolo pode ajudar pesquisadores a quantificar o número de células necessário para técnicas comuns e ensaios de motilidade celular in vitro. A principal vantagem deste método é que ele fornece contagens rápidas e precisas de células, incluindo múltiplos filtros e ferramentas de análise.

Para começar, ajuste a iluminação do microscópio ao máximo. Alterne para a objetiva de 4x e certifique-se de que os filtros de contraste de fase estão em uso. Em seguida, no software do microscópio, defina as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.

Agora, coloque um hemocitômetro padrão sobre a platina do microscópio e capture uma imagem para a etapa de calibração do volume da imagem. Ajuste o tempo de exposição conforme necessário. No ImageJ, no menu do calculador de concentração celular, abra a imagem e clique no botão Obter Dimensão da Imagem.

Esta ação preenche as caixas de texto de largura e altura da imagem com a resolução da imagem em pixels. Em seguida, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha reta ao longo de todo o comprimento do quadrado primário p do hemocitômetro, clicando e arrastando o cursor. Depois, pressione a tecla M para exibir a janela de resultados.

Agora, digite o valor da coluna de comprimento na caixa de texto comprimento do p-quadrado na calculadora de concentração celular. Em seguida, clique no botão Calcular Volume da Imagem para exibir o volume da imagem na caixa de texto volume da imagem. Por fim, clique no botão Salvar para concluir a calibração do plugin.

Para a análise da amostra, carregue 10 microlitros de células em ambas as câmaras de uma lâmina de hemocitômetro e ajuste o foco para que o interior das células fique mais escuro que a membrana celular, proporcionando foco na seção transversal central da célula e não nos polos. Em seguida, ajuste ainda mais a exposição para que as células não fiquem superexpostas. Linhas ligeiramente visíveis do hemocitômetro são aceitáveis.

Agora, capture cinco a dez imagens não sobrepostas da região central do hemocitômetro. A resolução e a ampliação de cada imagem devem ser as mesmas utilizadas na imagem de calibração de volume. Em seguida, no calculador de concentração celular, clique em Contar Células e, na janela pop-up, selecione uma pasta para ser contada.

Em seguida, no campo de entrada de número de amostras, insira o número de imagens capturadas por câmara e clique em OK. O plugin agora coletará os dados. Veja o texto para obter mais detalhes. Para começar, dentro do software do microscópio, configure as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.

Para o estágio do microscópio de dissecação, utilize um fundo branco sólido e uma fonte de luz acima do estágio, preferencialmente duas luzes LED flexíveis. Agora, coloque uma lâmina com membrana de ensaio de migração concluída sobre o estágio. Observando a imagem em tempo real exibida pelo software, ajuste manualmente a ampliação de modo que as bordas de uma única membrana fiquem exatamente dentro do campo de visão da câmera.

Em seguida, ajuste as posições das fontes de luz e os tempos de exposição para reproduzir, o mais fielmente possível, a imagem ideal, que apresenta cor de fundo mínima e uma membrana uniformemente iluminada. A precisão da contagem de células depende da aquisição de imagens de alta qualidade.

Portanto, é importante capturar a melhor imagem possível alcançada pela câmera do usuário para o uso mais eficiente dos plugins. Agora, remova a lâmina e faça o balanceamento de branco da imagem no software do microscópio para concluir a calibração. Imediatamente antes da aquisição de imagens, aplainar cada membrana aplicando pressão sobre a lamínula para remover o maior número possível de bolhas aprisionadas.

Agora, dentro do software, defina o local da pasta de captura. Em seguida, capture uma imagem por membrana, salvando os arquivos de imagem como TIFs usando a convenção de nomenclatura da amostra 001, com incrementos numéricos sucessivos para cada imagem. Essa convenção de nomenclatura é necessária para que o plugin localize os arquivos.

Se a correção de planicampo for desejada, para cada lâmina localize uma área vazia e capture uma imagem em branco. Salve o arquivo como nome_da_amostra_em_branco. Em seguida, no ImageJ, abra o plugin TC.

Dentro do TC, clique no botão Flatfield e, na caixa de diálogo Escolher Diretório, selecione a pasta onde as imagens da membrana foram salvas. Agora, abra uma imagem da membrana de ensaio de migração e selecione Limite de Cor. Na janela, defina o método como Shanbhag.

Defina a cor do limiar como branca. Defina o espaço de cor como RGB e desmarque a opção de fundo escuro. Em seguida, ajuste os controles deslizantes superiores para zero e os inferiores para 255 para tornar a imagem completamente branca.

Uma vez branca, ajuste os controles deslizantes verde e vermelho até que apenas os núcleos sejam visíveis. No plugin TC, copie os valores dos controles deslizantes RGB para as caixas de texto correspondentes nas configurações de limiar RGB. Em seguida, clique no botão Adicionar/Modificar e sobrescreva a configuração.

No painel de configurações, clique em Salvar para gravar as configurações no disco rígido. Agora, para contar as imagens com o plugin TC, clique em Contar Pasta e selecione a pasta a ser contada. O programa processará então as imagens e adicionará automaticamente os dados à tabela principal.

Agora, na tabela principal, haverá uma marca de seleção na coluna Calibrar? se a imagem for marcada para calibração com base na semelhança com as métricas ideais. Selecione todas as amostras marcadas para calibração.

Em seguida, clique com o botão direito e selecione Recalcular e Tamanho Sugerido. Isso recalcula as imagens com a área mínima sugerida de partículas. Depois, clique novamente com o botão direito e selecione Mostrar Gráfico.

Uma imagem ideal apresentará um gráfico semelhante a uma distribuição normal com cauda longa à direita. Se necessário, ajuste a faixa inferior de tamanho ou as configurações de limite RGB selecionando a amostra, clicando com o botão direito e escolhendo Recontar e Configurações Manuais. Em seguida, insira as configurações desejadas e clique em Contar para recontar a imagem.

Para ajustar as contagens manualmente, selecione as amostras, clique com o botão direito na tabela e selecione Abrir imagem com contagens. A imagem original será aberta com marcas vermelhas que representam cada partícula contada pelo plugin. Além disso, a opção Mostrar imagem binária contada pode ser usada para verificar quão bem as células individuais estão sendo resolvidas pelo limiar de cor.

Para adicionar manualmente uma contagem, mantenha a tecla control pressionada e clique com o botão esquerdo. Isso adicionará uma marcação na posição do cursor, que será incluída na contagem total. Para remover manualmente uma marcação, clique com o botão direito na imagem e o plugin removerá a marcação mais próxima do cursor.

Para remover um grupo de marcadores, selecione uma região de interesse e clique com o botão direito na região enquanto mantém pressionada a tecla controle. O processo do calculador de concentração celular depende da imagem de calibração do p-quadrado e do cálculo do comprimento e dos pixels do p-quadrado. O p-quadrado de um hemocitômetro possui um volume de 100 nanolitros, e, dado essa constante, o volume total da imagem pode ser calculado após a conversão de pixels para milímetros.

Uma comparação entre contagens manuais e automatizadas em 57 imagens provenientes de diversos experimentos e tipos celulares mostra que há uma correlação muito estreita entre ambos os métodos. Concentrações entre cinco milhões e 2.000 células por mililitro foram contadas com precisão utilizando o processo automatizado. A métrica Q representa a clareza geral das imagens com base na distribuição de tamanhos de partículas distintas.

Um Q adequado é maior que 0,5. Aplicando esses critérios a uma seleção de imagens de qualidade moderada a excelente em relação ao brilho e ao ruído de fundo, as contagens de imagens calibradas foram significativamente mais próximas das contagens manuais do que as contagens de imagens não calibradas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como contar com precisão e eficiência células em suspensão e provenientes de ensaios de motilidade celular utilizando os plugins CCC e TC do ImageJ.

Uma vez dominado o plugin TC, no qual a aquisição, quantificação e ajuste das contagens celulares podem ser realizados em menos de uma hora. Ambos os plugins dependem da função de contagem de partículas do ImageJ e podem ser modificados pela edição das macros utilizadas pelo ImageJ. Isso oferece maior flexibilidade ao usuário para expandir o escopo dos plugins a outras partículas.