Name: Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar células automaticamente usando plugins do ImageJ para análise de hemocitômetro e ensaios de migração. Este método open-source oferece contagens rápidas e precisas para pesquisa em biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde para CP (OR 142730 e OR 89931). Gostaríamos de agradecer a Jelena Brkic por sua ideia inicial de análise de partículas binárias no ImageJ.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas críticas, solução de problemas e limitações A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. Por isso, é da maior...

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e 1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens 3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coulter tirar vantagem das células de resistência elétrica para determinar o número e tamanho das células. Eles são rápidos, precisos e mais baratos do que citómetros de fluxo. No entanto, eles raramente são usados apenas para contagem de células devido ao seu custo considerável em comparação com a contagem manual 3. Fluxo citómetros, por outro lado, são caros, mas eles têm muitas aplicações, tais como a contagem celular, análise da forma de células, rructure e célula de medição interna marcadores de 4,5. As máquinas que utilizam qualquer um destes dois princípios estão disponíveis de vários fabricantes. Contagem manual é acessível, mas demorado e sujeito a polarização, enquanto os métodos automáticos vêm com uma fracção do tempo requerido para a contagem manual, mas utilizando máquinas caras 6. Outros procedimentos de cultura de células são comum em ensaios de motilidade das células in vitro, isto é, a migração celular e invasão 7. Os ensaios de migração e invasão são comumente utilizados para investigar a mobilidade celular e capacidade invasiva, em resposta a uma resposta quimiotáctica. Além disso, eles são amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário, a diferenciação, a resposta inflamatória, e a metástase de vários tipos de células 7-11. As células que migraram ou invadem através da membrana porosa de um ensaio de migração pode ser quantificada de duas formas diferentes. Em primeiro lugar, por coloração das células com um corante fluorescente, de dissociação from a membrana, e a quantificação utilizando um leitor fluorescente 12. Uma limitação deste método de quantificação é que nenhuma ficha pode ser retida de membranas e não há nenhuma possibilidade para análise posterior 13. O segundo método de quantificação é de migraram / células a serem fixadas e coradas com corante fluorescente ou, mais comumente, com corantes citológicos como cristal violeta, toluidine corante azul ou hematoxilina invadidos; em seguida, as células são quantificados usando manualmente imagens microscópicas invertidos destas membranas que é uma tarefa demorada muito 12,13. Para ultrapassar os inconvenientes da contagem manual de células, foram desenvolvidos dois contadores de células automatizado fiáveis ​​e precisos para a concentração de células e para o ensaio de migração. Estes contra algoritmos celulares automatizados foram desenvolvidos para ImageJ como um plug-in utilizando a linguagem de programação Java da Oracle. ImageJ é uma ferramenta de processamento de imagem pública e amplamente utilizado, desenvolvido pelo Instituto Nacional de HeaLTH (NIH) 14,15; Assim, escrever esses plugins para ImageJ facilita a fácil integração com a comunidade biológica. Automatização de contagem de células garante alto rendimento e reprodutibilidade em relação à contagem manual. Embora outro software disponível e encaixes podem ser utilizados para calcular a concentração de células por meio de análise de imagem 5,16,17, celular Concentração de encaixe calculadora é rápido e pode também lidar com diluições de células e tratamentos. Além disso, todos os resultados e cálculos destes dois contadores podem ser salvos e exportados. Os dois encaixes descritos no presente documento são optimizados para o uso de um microscópio de contraste de fase para imagens de células vivas e grande campo de visão (toda a captura de membrana) de imagiologia para membranas ensaio de migração através do uso de um escopo de dissecação. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Mídia Líquida Clássica: RPMI 1640 - Com L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Mídia de cultura celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Fornecimento de mídia</td></tr><tr><td>Linha celular de trofoblasto HTR8/SVneo</td><td>As células foram obtidas do Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)</td><td></td><td>O software foi projetado para funcionar com qualquer linhagem celular.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Preparado como 0,20% (p/v) em 10 &micro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 10 cm</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Qualquer placa tratada com cultura de tecidos será adequada</td></tr><tr><td>Inserções de Membrana de Poliéster Transwell - 8.0&nbsp; &micro; m Tamanho dos poros</td><td>Costar 3422 encomendado à Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>Para placas de 24 poços; Tamanho do poro: 8.0 &micro; m; 6,5 mm de diâmetro; 0,33 cm2 área de crescimento</td></tr><tr><td>HARLECO Corantes e reagentes de hematologia, EMD Millipore - Soluções 1, 2 e 3</td><td>EMD Millipore e encomendado de VWR</td><td>65044A, B, & O</td><td>conjunto de corantes C Hemacolor consiste em três frascos de polietileno de 500 ml (16,9 oz.) e inclui um fixador de metanol (Solução 1), um corante de eosina ou ácido (Solução 2) e um corante azul de metileno ou básico (Solução 3)</td></tr><tr><td>Aplicador com ponta de algodão</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear industriais de borda única</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Espessura: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio - Pré-limpas/Simples</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimensões: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Retângulos no. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Espessura: 0.13 a 0.17 mm; Tamanho: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscópio de dissecação estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>O microsope está equipado com a câmera de microscópio Leica Modelo MC170 HD e o software da câmera é Leica App. Suite (LAS E2) Versão 3.1.1 [Compilação: 490]. Peças de microscópio:&nbsp; LED3000 Iluminação de Luz de Spot Modelo: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90&nbsp; mm Modelo: MOB306 & Objetiva acromática 0.32X, WD=303&nbsp; mm Modelo: MOB315, Objetiva de Vídeo 0.5X Modelo: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Assistant Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>0,100 mm Profundidade - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Olympus microscópio de luz invertida</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>O microsope está equipado com Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & software da câmera é Infinity analyze Versão 6.5.2</td></tr><tr><td>Gabinete de fluxo laminar 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 1375</td><td>Qualquer gabinete de fluxo laminar para trabalho de cultura de células será adequado&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura celular</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 370</td><td>Qualquer incubadora de cultura de células será adequada - As células foram cultivadas em ambiente umidificado, 5% CO2, 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Versão 1.50e</td><td>Versão mínima necessária</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Versão 1.8.0_66</td><td>Versão mínima necessária</td></tr></tbody></table>

automated quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Calculadora celular Concentração A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54719...

Este artigo descreve a quantificação de hemocitômetro e micrografias de migração/invasão por meio de dois novos plug-ins ImageJ de código aberto: Cell Concentration Calculator e migration assay Counter. Além disso, descreve os protocolos de aquisição e calibração de imagens, bem como discute em detalhes os requisitos de entrada dos plug-ins.

Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar ferramentas de análise digital para realizar rapidamente contagens precisas de células em uma suspensão ou em uma membrana de ensaio de migração e invasão. Este protocolo pode ajudar pesquisadores a quantificar o número de células necessário para técnicas comuns e ensaios de motilidade celular in vitro. A principal vantagem deste método é que ele fornece contagens rápidas e precisas de células, incluindo múltiplos filtros e ferramentas de análise.Para começar, ajuste a iluminação do microscópio ao máximo. Alterne para a objetiva de 4x e certifique-se de que os filtros de contraste de fase estão em uso. Em seguida, no software do microscópio, defina as configurações de captura de imagem para seus valores padrão.Agora, coloque um hemocitômetro padrão sobre a platina do microscópio e capture uma imagem para a etapa de calibração do volume da imagem. Ajuste o tempo de exposição conforme necessário. No ImageJ, no menu do calculador de concentração celular, abra a imagem e clique no botão Obter Dimensão da Imagem.Esta ação preenche as caixas de texto de largura e altura da imagem com a resolução da imagem em pixels. Em seguida, selecione a ferr

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Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Este protocolo descreve a funcionalização de superfície personalizável do sistema de destiobiotina, estreptavidina e APTES para isolar tipos específicos de células de interesse. Além disso, este manuscrito cobre as aplicações, otimização e verificação desse processo.

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Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

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Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

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A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

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Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

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