Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de
2 de dezembro de 2016
As amebas sociais Dictyostelium discoideum foram recentemente estabelecidas como um sistema para estudar o desdobramento de proteínas e a proteostase. Aqui, descrevemos uma nova metodologia baseada em imagens para estudar a agregação de proteínas induzida pela temperatura e a resposta ao estresse celular em D. discoideum.
O objetivo geral dessa técnica de imagem é observar perturbações celulares induzidas por estresse térmico em células de Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a compreender os mecanismos de resposta ao estresse térmico e ao controle de qualidade de proteínas na ameba Dictyostelium discoideum. A principal vantagem dessa técnica é o controle rigoroso e preciso da temperatura aplicada às células durante a aquisição de imagens.
Para iniciar o procedimento, prepare as células de Dictyostelium conforme detalhado no protocolo textual. No dia anterior à microscopia, divida as células em meio de baixa fluorescência até atingir 10.000 células por mililitro. Antes da microscopia, colete as células da placa de tecido em LFM e, em seguida, transfira um número adequado de células para placas de fundo de vidro.
Deixe as células sedimentarem por 20 minutos e, em seguida, substitua cuidadosamente o meio usado por meio fresco, para remover as células não sedimentadas. Obtenha imagens das células em condições não estressantes a 23 graus Celsius, adquirindo no mínimo seis campos de visão. Adquira Z-stacks com um máximo de sete micrômetros em etapas de um a 0,25 micrômetro para capturar todo o volume da célula.
Em seguida, adquira uma imagem de referência em campo claro para avaliar o número total de células. A seguir, ajuste a temperatura da câmara de refrigeração para 30 graus Celsius. Após o visor de temperatura atingir o valor desejado, refocalize manualmente no canal de campo claro.
Verifique todos os campos de visão gravados antes de iniciar o intervalo de tempo, então inicie um intervalo de tempo de quatro horas de estresse térmico com um intervalo de cinco a dez minutos entre os pontos temporais. Verifique se a focalização está correta durante a aquisição dos dois primeiros pontos temporais. Após a conclusão do estresse térmico, reduza a temperatura de volta para 23 graus Celsius.
Aguarde o ajuste da exibição da temperatura e refocuse manualmente. Em seguida, grave filmes em lapso de tempo na fase de recuperação por oito a 10 horas em intervalos de 10 a 20 minutos. Verifique se o foco está correto durante a aquisição do primeiro ponto temporal.
Inicie abrindo o pacote de processamento de imagens equipado com o plugin Contador de Células. Carregue a pilha de imagens de campo claro clicando em Arquivo, depois em Abrir. Em seguida, abra o plugin Contador de Células e carregue a pilha de imagens clicando em Inicializar.
Escolha o tipo de contadores clicando na caixa apropriada. Em seguida, conte o número total de células e salve os marcadores clicando em Salvar Marcadores. Uma vez que os marcadores forem salvos, carregue a projeção máxima do hiperempilhamento de imagem de fluorescência.
Abra o plugin Cell Counter e carregue os marcadores clicando em Carregar Marcadores. Em seguida, escolha o tipo de marcador para focos citosólicos e conte as células. Os marcadores existentes podem ser usados como orientação para a posição das células individuais.
Recupere o número de contagens por fatia clicando em Resultados e, em seguida, salve as contagens em outro local para cálculos posteriores. Neste estudo, observou-se a distribuição da proteína poliglutamina marcada com GFP, Q103, em células de Dictyostelium. Em condições normais de crescimento, Q103-GFP está distribuída difusamente no citoplasma.
Durante o estresse térmico, o marcador Q103-GFP se agrega em estruturas pontilhadas. Após a remoção do estresse e o crescimento em condições normais, essas estruturas se dissolvem. A redistribuição do Q103-GFP e a formação de focos citoplasmáticos induzidos pelo estresse térmico são quantificadas por meio de análise de imagem.
Os resultados representativos da resposta ao estresse térmico podem ser vistos aqui. O número de células com focos citoplasmáticos de Q103-GFP aumenta com a continuação do estresse térmico. Durante o estresse térmico, o sistema de controle de qualidade de proteínas fica sobrecarregado, de modo que proteínas propensas à agregação não podem ser mantidas em estado solúvel.
Após o estresse térmico, o número de células com focos citoplasmáticos diminui, sugerindo que as proteínas agregadas se dissolvem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar perturbações induzidas por estresse térmico na ameba Dictyostelium discoideum. Durante a aquisição de imagens, é importante lembrar-se de garantir que o foco esteja adequadamente ajustado, caso seu microscópio não possua autofoco por hardware.
O controle de temperatura mostrado neste protocolo pode ser usado além do campo da resposta ao estresse térmico. A aquisição de imagens sob condições normais de crescimento utilizando controle de temperatura pode reduzir notavelmente os efeitos fototóxicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma metodologia de imagem inovadora para investigar a agregação proteica induzida por temperatura e as respostas celulares ao estresse no ameba social Dictyostelium discoideum. A técnica permite um controle preciso da temperatura, possibilitando aos pesquisadores observar os efeitos do estresse térmico sobre o controle de qualidade proteica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Agregação de proteínas
Contexto
- Dictyostelium discoideum atua como organismo modelo para o estudo das respostas celulares ao estresse.
- Compreender a desnaturalização proteica é essencial para obter insights sobre diversas doenças.
- O estresse térmico pode levar à agregação proteica, afetando a função celular.
- Técnicas de imagem são fundamentais para a observação em tempo real de processos celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para observar perturbações celulares induzidas por estresse térmico.
- Elucidar os mecanismos de resposta ao estresse térmico em D. discoideum.
- Avaliar a eficácia do controle de qualidade de proteínas sob condições de estresse.
Métodos Utilizados
- Preparação de células de Dictyostelium em meio de baixa fluorescência.
- Obtenção de imagens sob temperaturas controladas (23°C e 30°C).
- Obtenção de imagens com lapso de tempo para monitorar as respostas celulares ao longo de várias horas.
- Análise de imagens para quantificar a agregação proteica e a recuperação.
Resultados Principais
- A proteína Q103-GFP apresentou distribuição difusa em condições normais.
- Durante o estresse térmico, a Q103-GFP formou estruturas pontuadas, indicando agregação.
- Após o estresse, o número de células com agregados diminuiu, sugerindo recuperação.
- O método demonstrou com sucesso a dinâmica da agregação e dissolução de proteínas.
Conclusões
- A técnica de imagem fornece informações sobre as respostas celulares ao estresse.
- O controle de temperatura é essencial para a observação precisa da dinâmica proteica.
- Essa metodologia pode ser aplicada a outras áreas da pesquisa sobre estresse celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de células vivas com controle de temperatura em Dictyostelium discoideum permite a investigação precisa dos mecanismos de controle de qualidade proteica sob estresse, apoiando a validação precoce de alvos em vias de agregação proteica. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas relevantes para neurodegeneração e proteostase. A capacidade do método de reduzir a fototoxicidade e quantificar a agregação proteica dinâmica fornece insights acionáveis para triagem de portfólios em biologia de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a observação direta da dinâmica de agregação proteica em um modelo vivo e sensível ao estresse.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao quantificar as respostas celulares ao estresse proteotóxico induzido por calor.
- Facilita a validação funcional de alvos do controle de qualidade proteica relevantes para distúrbios associados à agregação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um protocolo de imagem validado para quantificar eventos de agregação e dissolução de proteínas.
- Reduz a fototoxicidade, permitindo intensidades de imagem mais altas para proteínas de baixa expressão.
- Suporta leituras quantitativas e reprodutíveis, adequadas para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se aos mecanismos relevantes para a doença de desdobramento incorreto e agregação de proteínas.
- Permite a continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas direcionadas à agregação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de imagem se integra ao continuum de descoberta, desde estudos mecanicistas iniciais até a validação pré-clínica de alvos de agregação proteica.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a agregação proteica induzida por estresse térmico, elucidando as vias de proteostase.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas e reprodutíveis de agregação para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Oferece contagens em nível celular de eventos de agregação e dinâmicas de recuperação.
- Pesquisa Translacional: Modela respostas ao estresse relevantes para doenças, visando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e adaptável para diversos estudos de controle de qualidade proteica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos em vias de agregação proteica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de imageamento e análise padronizados.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao fornecer dados quantitativos e mecanicistas sobre a proteostase.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas direcionados à agregação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de células vivas e análise quantitativa de imagens.
- Requer microscopia com controle de temperatura e software analítico compatível.
- Necessita padronização entre equipes para parâmetros de imagem e interpretação de dados.
- Adaptável a outros modelos de proteínas com tendência à agregação mediante otimização do protocolo.
- A alta motilidade celular e a sensibilidade à fototoxicidade exigem um planejamento experimental cuidadoso.
