Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de D. discoideum Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular
2 de dezembro de 2016
As amebas sociais Dictyostelium discoideum foram recentemente estabelecidas como um sistema para estudar o desdobramento de proteínas e a proteostase. Aqui, descrevemos uma nova metodologia baseada em imagens para estudar a agregação de proteínas induzida pela temperatura e a resposta ao estresse celular em D. discoideum.
O objetivo geral desta técnica de imagem é observar perturbações celulares induzidas por estresse térmico em células de Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a entender os mecanismos de resposta ao estresse térmico e controle de qualidade de proteínas na ameba Dictyostelium discoideum. A principal vantagem desta técnica é o controle rigoroso e preciso da temperatura aplicada à imagem do arquivo das células.
Para iniciar o procedimento, prepare as células de Dictyostelium conforme detalhado no protocolo de texto. No dia anterior à imagem, divida as células em meio de baixa fluorescência para 10.000 células por mililitro. Antes de fazer a imagem, colha as células da placa de tecido em LFM e, em seguida, transfira um número adequado de células para placas de fundo de vidro.
Deixe as células assentarem por 20 minutos e, em seguida, substitua cuidadosamente o meio usado por meio novo, para remover as células não sedimentadas. As células de imagem sob condições não estressadas a 23 graus Celsius adquirem um mínimo de seis campos de visão. Adquira pilhas Z de no máximo sete micrômetros em etapas de um a 0,25 micrômetro para capturar todo o volume da célula.
Em seguida, adquira uma imagem de campo claro de referência para avaliar o número total de células. Em seguida, ajuste a temperatura da câmara de resfriamento para 30 graus Celsius. Depois que a exibição de temperatura atingir o valor desejado, refoque manualmente no canal de campo claro.
Verifique todos os FOVs registrados antes de iniciar o lapso de tempo e, em seguida, inicie um lapso de tempo para quatro horas de estresse térmico com um intervalo de tempo de cinco a 10 minutos entre os pontos de tempo. Verifique se o foco está correto durante a aquisição dos dois primeiros pontos de tempo. Após a conclusão do estresse térmico, reduza a temperatura de volta para 23 graus Celsius.
Aguarde até que o visor de temperatura se ajuste e volte a focar manualmente. Em seguida, grave filmes time-lapse na fase de recuperação durante oito a 10 horas em intervalos de tempo de 10 a 20 minutos. Verifique se o foco está correto durante a aquisição do primeiro ponto de tempo.
Comece abrindo o pacote de processamento de imagem equipado com o plug-in Cell Counter. Carregue a pilha de imagens de campo claro clicando em Arquivo e, em seguida, em Abrir. Em seguida, abra o plug-in Cell Counter, carregue a pilha de imagens clicando em Inicializar.
Escolha o tipo de contadores clicando na caixa apropriada. Depois disso, conte o número total de células, salve os marcadores clicando em Salvar marcadores. Depois que os marcadores forem salvos, carregue a projeção máxima da hiperpilha de imagens de fluorescência.
Abra o plug-in Cell Counter e carregue os marcadores clicando em Carregar marcadores. Em seguida, escolha o tipo de marcador para focos citosólicos e conte as células. Os marcadores existentes podem ser usados como orientação para a posição de células individuais.
Recupere o número de contagens por fatia clicando em Resultados e salve as contagens em outro lugar para cálculos adicionais. Neste estudo, a distribuição da proteína poliglutamina Q103 marcada com GFP foi observada em células de Dictyotelium. Em condições normais de crescimento, Q103-GFP é difusamente distribuído no citoplasma.
Durante o estresse térmico, o marcador Q103-GFP coalesce em estruturas pontilhadas. Após a liberação do estresse e o crescimento em condições normais de crescimento, essas estruturas se dissolvem. A redistribuição de Q103-GFP e a formação de focos citosólicos induzidos por estresse térmico são quantificadas usando análise de imagem.
Os resultados representativos da resposta ao estresse térmico podem ser vistos aqui. O número de células com focos citosólicos de Q103-GFP aumenta em número com o estresse térmico contínuo. Durante o estresse térmico, o sistema de controle de qualidade da proteína é sobrecarregado, portanto, as proteínas propensas à agregação não podem ser mantidas em um estado solúvel.
Após o estresse térmico, o número de células com focos citosólicos diminui, sugerindo que as proteínas agregadas se dissolvem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar perturbações induzidas por estresse térmico na ameba Dictyostelium discoideum. Ao longo da imagem, é importante lembrar de garantir que o foco esteja ajustado corretamente, se o seu microscópio não possuir um foco automático de hardware.
O controle de temperatura mostrado neste protocolo pode ser usado além do campo de resposta ao estresse térmico. A imagem em condições normais de crescimento usando controle de temperatura pode reduzir notavelmente os efeitos fototóxicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma nova metodologia de imagem para investigar a agregação de proteínas induzida por temperatura e respostas celulares ao estresse na ameba social Dictyostelium discoideum. A técnica permite um controle preciso da temperatura, permitindo que os pesquisadores observem os efeitos do estresse térmico no controle de qualidade das proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Agregação de proteínas
Fundamentos
- Dictyostelium discoideum serve como um organismo modelo para estudar respostas celulares ao estresse.
- Entender o equívoco de proteínas é crucial para insights em várias doenças.
- O estresse térmico pode levar à agregação de proteínas, afetando a função celular.
- Técnicas de imagem são essenciais para observação em tempo real de processos celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para observar perturbações celulares induzidas por estresse térmico.
- Elucidar os mecanismos de resposta ao estresse térmico em D. discoideum.
- Avaliar a eficácia do controle de qualidade de proteínas sob condições de estresse.
Métodos Utilizados
- Preparação de células Dictyostelium em meio de baixa fluorescência.
- Imageamento sob temperaturas controladas (23°C e 30°C).
- Imageamento em lapso de tempo para monitorar respostas celulares ao longo de várias horas.
- Análise de imagem para quantificar agregação e recuperação de proteínas.
Principais Resultados
- A proteína Q103-GFP mostrou distribuição difusa sob condições normais.
- Durante o estresse térmico, Q103-GFP formou estruturas punctadas indicando agregação.
- Após o estresse, o número de células com agregados diminuiu, sugerindo recuperação.
- O método demonstrou com sucesso a dinâmica de agregação e dissolução de proteínas.
Conclusões
- A técnica de imagem fornece insights sobre respostas celulares ao estresse.
- O controle de temperatura é crítico para observação precisa da dinâmica das proteínas.
- Esta metodologia pode ser aplicada a outras áreas de pesquisa em estresse celular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
