Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de D. discoideum Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

O objetivo geral desta técnica de imagem é observar perturbações celulares induzidas por estresse térmico em células de Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a entender os mecanismos de resposta ao estresse térmico e controle de qualidade de proteínas na ameba Dictyostelium discoideum. A principal vantagem desta técnica é o controle rigoroso e preciso da temperatura aplicada à imagem do arquivo das células.

Para iniciar o procedimento, prepare as células de Dictyostelium conforme detalhado no protocolo de texto. No dia anterior à imagem, divida as células em meio de baixa fluorescência para 10.000 células por mililitro. Antes de fazer a imagem, colha as células da placa de tecido em LFM e, em seguida, transfira um número adequado de células para placas de fundo de vidro.

Deixe as células assentarem por 20 minutos e, em seguida, substitua cuidadosamente o meio usado por meio novo, para remover as células não sedimentadas. As células de imagem sob condições não estressadas a 23 graus Celsius adquirem um mínimo de seis campos de visão. Adquira pilhas Z de no máximo sete micrômetros em etapas de um a 0,25 micrômetro para capturar todo o volume da célula.

Em seguida, adquira uma imagem de campo claro de referência para avaliar o número total de células. Em seguida, ajuste a temperatura da câmara de resfriamento para 30 graus Celsius. Depois que a exibição de temperatura atingir o valor desejado, refoque manualmente no canal de campo claro.

Verifique todos os FOVs registrados antes de iniciar o lapso de tempo e, em seguida, inicie um lapso de tempo para quatro horas de estresse térmico com um intervalo de tempo de cinco a 10 minutos entre os pontos de tempo. Verifique se o foco está correto durante a aquisição dos dois primeiros pontos de tempo. Após a conclusão do estresse térmico, reduza a temperatura de volta para 23 graus Celsius.

Aguarde até que o visor de temperatura se ajuste e volte a focar manualmente. Em seguida, grave filmes time-lapse na fase de recuperação durante oito a 10 horas em intervalos de tempo de 10 a 20 minutos. Verifique se o foco está correto durante a aquisição do primeiro ponto de tempo.

Comece abrindo o pacote de processamento de imagem equipado com o plug-in Cell Counter. Carregue a pilha de imagens de campo claro clicando em Arquivo e, em seguida, em Abrir. Em seguida, abra o plug-in Cell Counter, carregue a pilha de imagens clicando em Inicializar.

Escolha o tipo de contadores clicando na caixa apropriada. Depois disso, conte o número total de células, salve os marcadores clicando em Salvar marcadores. Depois que os marcadores forem salvos, carregue a projeção máxima da hiperpilha de imagens de fluorescência.

Abra o plug-in Cell Counter e carregue os marcadores clicando em Carregar marcadores. Em seguida, escolha o tipo de marcador para focos citosólicos e conte as células. Os marcadores existentes podem ser usados como orientação para a posição de células individuais.

Recupere o número de contagens por fatia clicando em Resultados e salve as contagens em outro lugar para cálculos adicionais. Neste estudo, a distribuição da proteína poliglutamina Q103 marcada com GFP foi observada em células de Dictyotelium. Em condições normais de crescimento, Q103-GFP é difusamente distribuído no citoplasma.

Durante o estresse térmico, o marcador Q103-GFP coalesce em estruturas pontilhadas. Após a liberação do estresse e o crescimento em condições normais de crescimento, essas estruturas se dissolvem. A redistribuição de Q103-GFP e a formação de focos citosólicos induzidos por estresse térmico são quantificadas usando análise de imagem.

Os resultados representativos da resposta ao estresse térmico podem ser vistos aqui. O número de células com focos citosólicos de Q103-GFP aumenta em número com o estresse térmico contínuo. Durante o estresse térmico, o sistema de controle de qualidade da proteína é sobrecarregado, portanto, as proteínas propensas à agregação não podem ser mantidas em um estado solúvel.

Após o estresse térmico, o número de células com focos citosólicos diminui, sugerindo que as proteínas agregadas se dissolvem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar perturbações induzidas por estresse térmico na ameba Dictyostelium discoideum. Ao longo da imagem, é importante lembrar de garantir que o foco esteja ajustado corretamente, se o seu microscópio não possuir um foco automático de hardware.

O controle de temperatura mostrado neste protocolo pode ser usado além do campo de resposta ao estresse térmico. A imagem em condições normais de crescimento usando controle de temperatura pode reduzir notavelmente os efeitos fototóxicos.