Name: Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Aprenda a normalizar a arquitetura celular usando micropadrões adesivos para análise quantitativa de efeitos de drogas em células Hela. Este método automatiza a aquisição de imagens e melhora a detecção de doses baixas.

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1. Preparação de células e propagação em micropadrões <ol><li> Coloque 2 CYTOOchips em 2 poços independente de uma placa de 6 assim garantir que você lê "CYTOO" no canto inferior direito da CYTOOchip. Micropadrões pode ser fluorescente etiquetado com Cy3 Cy5 ou corantes. CYTOOChips utilizado para este experimento tem Cy3 fluorescente etiquetado micropadrões. CUIDADO: Mantenha fichas no escuro. </li><li> Coletar células HeLa (~ confluentes 80%) por tripsinização. Verificar sob um microscópio que as células são adequadamente dispersas pelo tratamento de tripsina. Coletar e centrifugar células em 300g por 4 min, em seguida, delicadamente ressuspender o pellet celular. Contagem de células e diluir para uma concentração de 15.000 células / mL em meio de cultura completou DMEM/F12. </li><li> Dispense 4 mL (60.000 células) em cada poço contendo um CYTOOchip. ATENÇÃO: A placa deve ser movido o menos possível para evitar a indução de qualquer movimento de rotação no meio como esse tendem a se concentrar células no centro. </li><li> Deixe o sedimento de células por 10 minutos sob o capô, em seguida, movê-los para a célula incubadora. Após 10-20 min, as células vão começar a aderir ao micropadrões. Após 10 min, verificar regularmente sob o microscópio. </li><li> Assim que as células têm ligado, mude o meio celular e lave suavemente a superfície lamela utilizando o seguinte procedimento: </li><li> Manter a placa plana, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta do lado do bem. CUIDADO: Nunca deixe o chip de fora seca, isso significa que nunca aspirado de fora todo o líquido, mas deixe o suficiente para cobrir o CYTOOchip em todos os momentos. </li><li> Adicionar 4 mL PBS e aspire novamente a primeira partida no centro do chip, em seguida, mudar-se para o lado do bem. Aspirar fora da PBS, conforme descrito sem expor o chip para o ar. Repita 3-4 vezes. </li><li> Verifique sob o microscópio para células flutuante: <ul><li> Se um grande número de células permanecem flutuando, repita o procedimento de lavagem. </li><li> Se você ver muito poucas células, aspirado de parte do PBS e substituí-lo com 2 ml de meio fresco. Aspirar e adicionar 4 mL de meio fresco duas vezes. </li></ul></li><li> Coloque a placa em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 para um mínimo de três horas para permitir que as células para alcançar a plena divulgação. NOTA: Usando este método entre 10-30% (2.000-6500) micropadrões será ocupado por uma única célula ou múltiplos. ATENÇÃO: O tempo necessário para que as células aderem antes da etapa de lavagem eo tempo necessário para a plena divulgação de células em micropadrões será específica para cada linhagem celular. </li></ol> 2. Tratamento Blebbistatin <ol><li> Dissolver o blebbistatin em DMSO 100% para obter uma solução estoque de 17 mM. Diluir a solução estoque ainda mais a 5 mM com DMSO 100%. Fazer uma diluição final no meio de cultura para obter uma concentração final de 5 mM em DMSO blebbistatin 0,1%. </li><li> Para condições de controle, prepare 4 mL de meio contendo DMSO 0,1% apenas. </li><li> Aspirar a mídia sobre as células e substituí-lo com o meio mL 4 preparado para as condições tratadas e controle. </li><li> Células incubar por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fixação de células e coloração de Actina <ol><li> Preparação da solução para a fixação das células Por favor, consulte a secção de reagentes para a preparação do citoesqueleto buffer (CB) e PFA 5%. CB é especialmente recomendado para a rotulagem de fluorescência de filamentos de actina e microtúbulos. <ul><li> Prepare 1xCB sacarose: adicionar 1 g de sacarose a 2 mL da CB. Inclusão de sacarose ajuda a preservar as estruturas celulares internas. </li><li> Prepare PFA 4% de sacarose-CB: Adicionar 1 mL de 1xCB sacarose para 4 mL de morno PFA 5%. ATENÇÃO: Esta solução pode ser mantido a 4 ° C por alguns dias apenas. </li></ul></li><li> Fixação PFA <ul><li> Use uma pinça para pegar o CYTOOchip no logotipo CYTOO e colocá-lo (sem lavar) em um poço de uma placa de 6 poços contendo 2 ml de solução 4% de sacarose PFA-CB- </li><li> Incubar por 10 min à temperatura ambiente </li><li> Remover PFA-CB-sacarose e lave uma vez com PBS </li><li> Fazer uma segunda lavagem com 2 mL de 100 mM NH 4 Cl por 10 min, a fim de saciar a atividade residual crosslinking PFA NOTA: slides PFA fixa podem ser armazenados em PBS durante vários dias a 4 ° C antes organela coloração para imagens fluorescentes. </li></ul></li><li> Permeabilização da membrana celular com Triton X-100 Permeabilização das células com detergente permite anticorpos ou outras sondas para penetrar a membrana celular e elimina algumas das piscina citosólico das proteínas do citoesqueleto que podem de alguma forma reduzir o contraste de polímeros do citoesqueleto tornando difícil analisar a sua localização. <ul><li> Remover NH 4 Cl e adicionar 2 mL / poço de 0,1% Triton X-100-CB por 3 min à temperatura ambiente </li><li> Lave duas vezes com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Coloração actina Fluorescente que phalloidinh se liga a actina nativa só é usado para manchar os filamentos de actina. <ul><li> Adicionar 2 mL de FITC-conjugado diluído 1:2000 phalloidin em PBS com BSA 1,5% </li><li> Incubar 1 hora a RT </li><li> Lavar uma vez com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Coloração núcleos <ul><li> Adicionar 2 mL de Hoechst (mancha com 1μg / mL em PBS) </li><li> Incubar 3 minutos à temperatura ambiente </li><li> Lavar 2 vezes com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Montagem de slides <ul><li> Pegue o CYTOOchips no logotipo CYTOO e CYTOOchip montagem em uma lâmina de microscópio padrão usando 25-30 mL de Mowiol ou qualquer outra solução de montagem. </li></ul></li></ol> 4. Setup microscópio e Aquisição de Imagem Automated Numerosos pacotes de software de imagem existem de que o controle do microscópio para aquisição de imagem rápida e automatizada e mostrar. Este exemplo usa Metamorph software de imagem automática e aquisições são realizadas em um microscópio Nikon Eclipse Ti equipado com uma câmera CCD e um Hamamatsu Intensilight iluminador de fibra de mercúrio. Imagens são adquiridas com ampliação de 20x em três comprimentos de onda correspondentes a DAPI (núcleos), Cy-3 (micropadrões) e FITC-faloidina (actina). O número de micropadrões visualizados por campo irá variar dependendo da câmera e configurações objetivo. Micropadrões CYTOO são posicionados em intervalos definidos entre si (100 ou 130 mm) através do chip facilitando bastante a aquisição. <ol><li> Selecione ampliação de 20x </li><li> Aquisição Multidimensional aberto (na barra de Menu: Apps / Multidimensional Aquisição) e configurar os parâmetros diferentes do experimento: <ul><li> Número de comprimentos de onda: 3 </li><li> Tipos de comprimento de onda: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Definir o tempo de exposição para cada comprimento de onda pela primeira foco em um campo de células </li><li> Autofoco pode ser executada em cada comprimento de onda </li><li> Selecione onde deseja salvar os dados </li></ul></li><li> Selecione Cy3 comprimento de onda e posicionar a câmera de modo que 12 micropadrões são visualizados e centrado no campo da câmara (4 colunas e 3 linhas de padrões). </li><li> Criar uma revista em execução Aquisição multidimensional. O procedimento para a criação de um jornal é descrito na Figura 1. </li><li> Função palco aberto Scan (na barra de Menu: Dispositivos / Estágio / Scan Stage). Para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micropadrões com ampliação de 20x, entre 6 colunas e 4 linhas com -400 M X tamanho do passo e 300 mm, tamanho do passo Y. No Jornal SET para executar, fazer o upload do MDA.JNL revista. Em seguida, pressione Digitalizar para iniciar a aquisição automatizada de todo o bloco nos três comprimentos de onda. NOTA: O X e Y tamanhos passo aqui indicado variará de acordo com o número de micropadrões presentes em um campo de câmera. Dependendo do seu palco montado, na direção X e / ou Y pode exigir valores negativos para o movimento na direção correta. </li></ol> 5. Processamento de Imagem e Análise automatizada Muitos pacotes de software de imagem de processamento e análise de existir. Os procedimentos descritos abaixo processamento de contorno da imagem e as etapas de análise realizada por 2 custom-made macros escritas para o open source programa ImageJ. O CellRef macro primeiro cria uma célula de referência, o segundo Hypotenuse medidas rigidez colapso / da membrana celular. Ambos estão disponíveis mediante solicitação através <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Criar pilhas de imagens para todos os três canais centrados em micropadrões (macro CellRef). Uso de células micropadrões evita agrupamento e agregação, simplificando enormemente o primeiro passo no processamento de imagem que é automatizado de localização e de segmentação de células individuais. As imagens fluorescente etiquetado micropattern são usados ​​para definir e delimitar as regiões centrado na micropadrões. Estas regiões são então transpostos para as imagens adquiridas em outros canais e cortadas. Correspondente imagens cortadas são então reunidos em pilhas para cada comprimento de onda. A RGB-pilha é também criada a partir da fusão dos três canais (Figura 2). </li><li> Aplicar única célula de seleção de filtro (macro CellRef) Como indicado acima, 10-30% (2.000-6.500) da micropadrões são ocupados por uma única célula ou várias células, enquanto o micropadrões restantes estão vazios. Para selecionar as imagens que mostram micropadrões ocupado por apenas uma única célula, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina de todos (RGB e diferentes comprimentos de onda) pilhas que contenham mais de um núcleo ou não núcleos (Figura 3). </li><li> Eliminar a não-normalizada e células que não são totalmente esticado em todo o micropattern usando cut-off área da célula de filtro (macro CellRef) Para remover células em divisão que teria escapado o filtro núcleos, outro filtro através do canal de FITC para actina é aplicada. Área da célula é calculado e aqueles abaixo de um off cortar certas (áreas de células cerca de 2 vezes menos de área celular interfase) são removidas todas as pilhas. A área envelope célula é determinada pelo tamanho do padrão. </li><li alinhar imagens das c cellref> Das etapas anteriores, as imagens que contenham células único micropatterned foram selecionados. Mesmo que essas imagens estão centradas na micropadrões, eles nunca estão todos perfeitamente alinhados uns aos outros. Para concluir o processamento de imagem, um plugin ImageJ (MultiStackReg) é aplicada para realinhar todas as imagens recolhidas e todos os canais com base na posição micropattern. Esta etapa gera pilhas alinhado de imagens individuais que agora pode ser usado para a análise única célula ou a criação de uma célula de referência (Figura 4) <li> Construção de uma célula de referência (macro CellRef) Células que crescem em micropadrões significa que todas as células têm formas semelhantes. Esta normalização permite um alinhamento preciso e sobreposição de imagens de células muitos. Resumindo o sinal em cada imagem sobre a pilha inteira permite visualizar e medir um "efeito de drogas média". A imagem final global ou célula de referência é uma ferramenta única e útil para a representação e análise de imagem e só pode ser obtido com células micropatterned (Figura 4). No ImageJ, a célula de referência é construída, fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhada a partir de uma pilha (Image&gt; Pilhas&gt; Z-projeto). Vários métodos de projeção pode ser aplicado como a intensidade média ou máxima, mas geralmente uma projeção mediana é escolhido o que elimina outliers principal da pilha de imagens. Para facilitar a análise dos resultados, uma LUT (Look Up Tables) converter a imagem monocolor em um mapa de freqüência com código de cores é aplicado. </li><li> Medir e quantificar os parâmetros de interesse (Hypotenuse macro) Neste artigo de vídeo, L-micropadrões são utilizadas porque a forma organiza o citoesqueleto de actina em uma fibra única grande estresse. Destacando actina, desta forma, o impacto blebbistatin sobre o citoesqueleto pode ser determinada de várias maneiras: medir as mudanças na curvatura da fibra estresse actina, coloração intensidade, duração ou a espessura da fibra stress, alterações nas características morfométricas dos filamentos de actina ou etc forma da célula Estes parâmetros podem ser medidos tanto em imagens de células individuais ou na célula de referência final em si. Aqui, o impacto de 5 blebbistatin mM foi caracterizado pela contagem do número de células usando um segundo colapso ImageJ macro chamado hipotenusa (Figura 7). Resumidamente, imagens thresholded da L-micropattern são usados ​​para definir uma hipotenusa teóricas da forma de triângulo celular. Em seguida, limiarização das imagens manchadas de actina é realizada, a fim de aproximar a forma da célula real. A área entre a hipotenusa do triângulo teórico celular e da membrana da célula real côncavo é, então, medido. Quando a célula entrou em colapso, uma área sob a hipotenusa teórica aparece. A porcentagem de células colapso é usado para comparar o controle e tratados condições. </li></ol> 6. Resultados representante Exemplos do que deve ser semelhante a células em micropadrões imediatamente e várias horas após as etapas de lavagem críticas descritas nos 1,6-1,8, são mostrados na Figura 5. Depois de 15 min em CYTOOchips, células redondas HeLa são observados a distâncias iguais, indicando que eles aderiram ao micropadrões fibronectina (Figura 5a). Adesão é completa quando as células permanecem imobilizados apesar agitação suave do recipiente de cultura. Para minimizar o número de micropadrões ocupada por várias células, os chips são então lavados com PBS para remover as células flutuando sobre as áreas cytophobic. Depois de várias horas, as células que são totalmente esticada sobre a micropadrões vai olhar como os mostrados na Figura 5b. Imagens típicas única célula obtida após incubação de células com fixação blebbistatin, e coloração de actina e núcleos são apresentados na Figura 6. Após a aquisição automatizada de várias imagens e processamento de imagens usando o ImageJ CellRef macro, um mapa de freqüência com código de cores é gerado, que retrata a intensidade da actina, calculados sobre todas as imagens de células (Figura 6c e 6f). A comparação da Célula de Referência para as condições não tratadas e tratadas mostra o potencial dessa abordagem para fácil observação do fenótipo em estudo e é especialmente útil para explorar os efeitos da droga celular. Um exemplo de uma possível análise do efeito da blebbistatin nas células é apresentado na Figura 7. O número de células fechada (ou seja, células com uma área em branco existentes sob a hipotenusa teórica) detectados em 50 células controle e 50 células tratadas com 5 mM blebbistatin detectado pelo macro Hypotenuse ImageJ é mostrado. O aumento do número de células colapso na população blebbistatin tratados reflete o relaxamento das fibras de estresse e, portanto, a tensão na membrana devido à inibição das forças blebbistatin actinomyosin contrátil dentro da célula. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Procedimento para criar uma nova revista com Metamorph. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura Fluxograma 2. Automática do procedimento de processamento de imagem. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Filtering para fora das células individuais. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A construção de uma célula de referência. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Semeadura Cell. A) células Hela adere a micropadrões após a etapa de lavagem (ampliação 4x) B) células HeLa após a completa divulgação sobre micropadrões L (10x). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Comparação de células nonpatterned e micropatterned no controle e condições de drogas tratados. Células HeLa foram semeadas durante 3 horas e tratados com 5 blebbistatin M para uma hora (painel inferior) ou não tratada (superior do painel). Em células controle nonpatterned (a), actina monta em fibras múltiplas que desmontar imperceptível sobre o tratamento com 5 blebbistatin mM (d). Em L-micropadrões, células controle adotar uma forma triangular (b) e desenvolver uma fibra de actina major (fibras de stress) entre os dois ápices da L. Comparado com células nonpatterned (d), blebbistatin induz uma grande mudança fenotípica em L-micropatterned células (e). Visualização direta dos efeitos de drogas ea comparação de controle e condições tratadas podem ser visualizadas rapidamente com a apresentação célula de referência construída a partir de 20 células. Semelhantes às células individuais, uma fibra estresse clara e intensa está presente na célula de referência de controle (c), enquanto blebbistatin células tratadas com o colapso ea fibra de estresse desaparece (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Exemplo de uma análise dos efeitos da blebbistatin sobre as células usando a hipotenusa macro. Enquanto 25% das células controle foram desabou, esta aumentou 3 vezes e 75% na 5 células M blebbistatin tratados refletindo o enfraquecimento actinomyosin contrátil rede (n = 50 células).

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</ol>

Todos os autores, exceto Anne Béghin são funcionários da CYTOO SA, que produz reagentes e instrumentação apresentado neste artigo.

Escolha de micropattern Embora os efeitos de 5 mM blebbistatin são pouco detectáveis ​​em suportes de cultura padrão, quantificação eficiente disponível no micropadrões que concentram actina em uma fibra única grande estresse. Isso melhora a visualização do citoesqueleto de actina auxiliando a quantificação precisa dos efeitos blebbistatin na célula. A escolha da forma micropattern é fundamental na concepção do ensaio e é projetado de acordo com a variação fenotípica a ser destacado no estudo. Conclusões Micropadrões facilitar a visualização e quantificação dos efeitos da droga, especialmente em baixas concentrações. A substituição de substratos homogêneos planar com micropadrões adesivo para celular baseado em ensaios melhora a precisão, sensibilidade e qualidade dos dados produzidos. Em conseqüência, menos células são necessários para análise a fim de alcançar os resultados estatísticos robustos 3. Micropadrões adesivo oferecer uma oportunidade real para melhorar a estudos funcionais e explorando alterações fenotípicas em concentrações mais baixas de drogas, a fim de evitar induzir efeitos tóxicos de drogas ou indireta. Se plataformas de triagem adequada são usados, micropadrões pode atender às demandas das empresas farmacêuticas para melhorar aplicações gene / drogas triagem. Alguns exemplos adicionais de publicações recentes que têm explorado micropadrões para analisar e quantificar fenômeno celulares são citados abaixo 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Cultura de células </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips estão disponíveis para a adsorção da proteína da sua escolha </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Câmara de contagem (slide Kova) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal soro bovino) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicilina e estreptomicina </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 poços-placa </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrifugador </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscópio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Drogas fixação e imunomarcação </td></tr><tr><td colspan="2" > Citoesqueleto tampão 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sacarose </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Misturar 10 mL de PFA 32% com 54 mL de CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Comprimidos PBS </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin albumina sérica (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Aquisição de imagem </td></tr><tr><td colspan="2"> Microscópio de epifluorescência </td><td> Nikon</td><td> Eclipse Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD Camera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Software ImageJ </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualização melhorada e análise quantitativa dos efeitos de drogas usando células micropatterned

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Até à data, a maioria dos HCA (análise de conteúdo de alta) são realizados estudos com linhagens de células aderentes cultivadas em um substrato homogêneo em cultura de tecidos tratados com micro-placas. Sob essas condições, as células se difundir e dividir em todas as direções, resultando em uma variabilidade inerente na forma celular, morfologia e comportamento. A variância célula a célula-alta da população em geral impede o sucesso do HCA, especialmente para o desenvolvimento de drogas. A capacidade de micropadrões para normalizar a forma ea polaridade interna de cada célula individual proporciona uma tremenda oportunidade para resolver esse gargalo crítico 1-2. Para facilitar o acesso e uso da tecnologia micropatterning, CYTOO desenvolveu uma gama de pronto para usar micropadrões, disponível nos formatos lamela e micropoços. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos protocolos detalhados de todos os procedimentos de semeadura de células em CYTOOchip micropadrões, tratamento da toxicodependência, fixação e coloração de aquisição automatizada, o processamento automático de imagem e análise de dados final. Com este exemplo, nós ilustrar como micropadrões pode facilitar baseada em células ensaios. Alterações do citoesqueleto das células são difíceis de quantificar em células cultivadas em substratos homogêneos, mas a cultura de células em micropadrões resulta em uma organização reprodutível de actina da malha devido ao posicionamento sistemático dos contatos de adesão celular em cada célula. Essa normalização da arquitetura intracelular permite a quantificação do mesmo pequenos efeitos sobre o citoesqueleto de actina como demonstrado nestes conjunto de protocolos usando blebbistatin, um inibidor da interação actina e miosina.

Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

Até o momento, a maioria dos estudos de HCA (Análise de Alto Conteúdo) é realizada com linhagens celulares aderentes cultivadas em um substrato homogêneo em plástico tratado para cultura de tecidos...

O objetivo geral do procedimento a seguir é demonstrar como a normalização da arquitetura celular e da posição, alcançada por meio de padrões microscópicos adesivos específicos, permite a automação fácil da aquisição de imagens e um processamento direto das imagens com quantificação sensível e robusta dos efeitos de fármacos, o que é inatingível em lâminas de vidro convencionais. Isso é conseguido ao semear células heli em chips SI dois que possuem padrões microscópicos em forma de L rotulados SI três. As células adotam uma forma triangular, formando uma fibra de estresse principal que se estende entre as duas extremidades do L. Em seguida, as células padronizadas são incubadas com lebos statina ou mantidas sem tratamento, fixadas e coradas para visualizar o citoesqueleto de actina e os núcleos.As imagens das células micropadronizadas são então adquiridas e processadas usando a macro cell ref para gerar uma pilha de imagens para análise e a macro hypotenuse para quantificar fenótipos. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram um efeito significativo de doses baixas de estatina BLEs em células HELOC micropadronizadas, o qual é indetectável em condições padrão de cultivo celular. Olá, seja bem-vindo.Estamos aqui hoje para guiá-lo pelo nosso protocolo experimental, explicando como utilizar padrões microscópicos adesivos para análise celular, além de mostrar dados experimentais que ilustram a fácil quantificação de doses muito baixas de fármacos nesses padrões microscópicos adesivos. Assim, ao observar pela primeira vez esses padrões microscópicos, você compreenderá imediatamente como eles podem resolver problemas de variabilidade na captura de imagens durante a análise celular. Pois, ao dispor de uma verdadeira matriz de células, semelhante a um microarranjo, é possível mover facilmente a platina do microscópio de uma célula para outra, permitindo capturar imagens de maneira sequencial.Mas essa é claro não é a única vantagem que os micropadrões oferecem. Eles proporcionam muitas outras melhorias, pois, de fato, em certos micropadrões típicos, como o cruzado ou o em Y, estamos normalizando a arquitetura interna da célula, ou seja, organelas, o fuso mitótico, o citoesqueleto e as diferentes redes proteicas estão todas nas mesmas localizações de célula para célula ou na mesma orientação de célula para célula, o que torna muito mais fácil prever e quantificar os efeitos de fármacos sobre esses padrões específicos. Isso pode parecer bastante contraintuitivo em comparação com o que normalmente é feito no clássico bico de Petri ou microplaca.Bem, porque você frequentemente observa, é claro, células se movendo e adotando diferentes morfologias. Enquanto que nos microdesenhos adesivos, todas as células começarão a se parecer, pois estão respondendo a esse microdesenho adesivo e organizando sua arquitetura da mesma maneira. Isso pode parecer, de fato, um pouco artificial, mas quando se analisa mais atentamente, o prato de Petri não é ainda mais artificial?Porque nos tecidos, as células são limitadas pelas células vizinhas, bem como pela matriz extracelular. Assim, recebem muita informação espacial, que orienta a arquitetura celular. E essa adaptação local a padrões microscópicos é o que estamos fazendo.Estamos restaurando essa informação espacial às células e todas as células estão respondendo a isso e se organizando da mesma maneira. E agora, como todas as células se parecem, podemos introduzir o conceito de célula de referência, o que significa que podemos fazer a média de todas as imagens e obter uma única imagem, que é realmente representativa da aparência da célula em uma condição específica. Em seguida, você pode adicionar uma droga e observar novamente a célula de referência para ver como a morfologia ou a organização celular foi modificada em resposta àquela droga.Coloque dois chips situ two individualmente em dois poços independentes de uma placa de seis poços, garantindo que o logotipo situ two esteja legível. Os chips situ two utilizados neste experimento possuem microdesenhos corados com FibroGen SI three e devem ser mantidos no escuro antes do uso. Colete células hela com aproximadamente 80% de confluência utilizando tripsina e verifique se estão adequadamente individualizadas ao microscópio. Centrifugue a 300 ×g durante quatro minutos e ressuspenda suavemente as células. Conte e dilua as células até uma concentração de 15.000 células por mililitro.Em meio de cultura D-M-E-M-F 12 incompleto, distribua 60.000 células por poço. A placa deve ser movida o mínimo possível para evitar introduzir movimentos de rotação no meio, o que tenderá a concentrar as células no centro. Deixe as células sedimentarem por 10 minutos sob a câmara de fluxo laminar e, em seguida, transfira-as para o incubador de células.Em 10 a 20 minutos no incubador celular, as células começarão a aderir após 10 minutos; verifique regularmente ao microscópio quando as células tiverem se fixado. Troque o meio celular e remova o excesso de células repetindo o seguinte procedimento quatro vezes. Mantendo a placa plana, aspire suavemente o meio do lado do poço.Tomar cuidado para manter quantidade suficiente de meio e evitar que o chip seque. Adicionar quatro mililitros de PBS e aspirar começando pelo centro do chip. Em seguida, mover para a lateral do poço para aspirar a maior parte do PBS como antes, e verificar ao microscópio a presença de células flutuantes.Se permanecer uma grande quantidade de células em suspensão, repita o procedimento de lavagem. Se houver muito poucas células, aspire parte do PBS e substitua por dois mililitros de meio fresco, aspire novamente e adicione quatro mililitros de meio fresco duas vezes. Incube as células por três horas em uma incubadora de células para permitir que as células se espalhem completamente.Utilizando este método, entre 10 e 30% dos microdesenhos estarão ocupados por uma única célula, enquanto outros desenhos estarão vazios ou ocupados por múltiplas células. Para tratar as células com a solução diluída de estatina BLEs, dilua a solução estoque do fármaco de 17 milimolar até uma concentração final de cinco micromolar com 0,1% de DMSO em quatro mililitros de meio. Para o controle, prepare o meio contendo apenas 0,1% de DMSO, aspire o meio celular e substitua-o rapidamente pelas soluções de estatina BLEs ou de controle para evitar que o chip seque.Incube as células por uma hora a 37 graus Celsius. Durante essa incubação, prepare o tampão de citoesqueleto. Adicione um grama de sacarose a dois mililitros de cb.Isso ajuda a preservar as estruturas celulares internas. Misture um mililitro de sacarose CB com quatro mililitros de PFA a 5%. Adicione dois mililitros de PFA na solução de sacarose CB.Em dois poços de uma placa fresca de seis poços. Para fixar as células, use pinças para pegar o chip CY2 e coloque-o na placa de seis poços contendo dois mililitros de PFA em solução de sacarose CB. Incube as células por 10 minutos à temperatura ambiente, remova o PFA e lave as células uma vez com PBS, depois lave as células com dois mililitros de cloreto de amônio 100 milimolar por 10 minutos.Para inibir a atividade residual de reticulação com PFA, permeabilize as células adicionando dois mililitros de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 por três minutos, lave duas vezes com PBS e marque os filamentos de actina com dois mililitros de fain conjugado com ZI na diluição de 1 para 2000 em PBS com 1,5% de BSA, incubando por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células uma vez com dois mililitros de PBS. A seguir, contraia os núcleos.Adicione dois mililitros de um miligrama por mililitro de hawked em PBS e incube por três minutos à temperatura ambiente. Lave duas vezes com dois mililitros de PBS. Monte os dois chips laterais em uma lâmina padrão usando de 25 a 30 microlitros de soluções de montagem, como al.Para adquirir imagens em três comprimentos de onda, utilizamos o software de imagem Metamorph e um microscópio NIK icon eclipse T. Equipado com a câmera CCD Hema Matsu e um iluminador de fibra de mercúrio Intens Lite. Primeiro, selecione a ampliação de 20x.A seguir, na barra de menu, abra a aquisição multidimensional para configurar os diferentes parâmetros do experimento. Primeiro, indique onde salvar seus dados.Defina o número de comprimentos de onda como três, selecione os três comprimentos de onda do SI e posicione a lâmina com lamínula de modo que 12 micro padrões fiquem centralizados no campo da câmera. O número de micro padrões visualizados por campo variará conforme as configurações da câmera e dos objetivos. Ajuste o tempo de exposição para cada comprimento de onda e o foco automático.Para o PS três, crie um jornal executando a aquisição multidimensional e salve-o como MDA jnl. Abra a função de varredura da platina para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micro padrões. Insira seis colunas e quatro linhas com tamanho de passo x de menos 400 mícrons e tamanho de passo y de 300 mícrons em definir jornal para executar, carregue o jornal MDA jnl e pressione varredura para iniciar a aquisição automatizada das 24 imagens nos três comprimentos de onda.Neste vídeo, padr&otilde;es microsc&oacute;picos em forma de L s&atilde;o utilizados para induzir a forma&ccedil;&atilde;o de uma &uacute;nica fibra principal de actina que sustenta a parte da c&eacute;lula n&atilde;o aderida, simplificando a visualiza&ccedil;&atilde;o e a mensura&ccedil;&atilde;o do impacto das estatinas sobre as c&eacute;lulas, em compara&ccedil;&atilde;o com c&eacute;lulas assentadas sobre fibronectina comum. Para o processamento e an&aacute;lise automatizados de imagens, descrevemos dois macros personalizados desenvolvidos para o programa de c&oacute;digo aberto ImageJ; a partir de uma pilha de imagens brutas, o primeiro macro extrai c&eacute;lulas individuais e cria uma c&eacute;lula de refer&ecirc;ncia. O segundo macro mede o colapso da membrana celular.O primeiro passo é a segmentação de células individuais a partir de imagens brutas. As imagens do micropadrão marcadas com fluorescência são utilizadas para delimitar regiões centradas nos micropadrões, que são recortadas nas imagens para cada comprimento de onda e novamente montadas em pilhas (stacks) para cada comprimento de onda. Para selecionar micropadrões com uma única célula, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina, em todas as pilhas, aquelas que contêm mais de um núcleo ou nenhum núcleo.Por fim, o plugin multi-stack reg do ImageJ é utilizado para realinhar todas as imagens coletadas e todos os canais com base na posição do micropadrão. Esta etapa gera pilhas de linhas de imagens individuais que agora podem ser usadas para análise de célula única ou para criar uma célula de referência. No ImageJ, a célula de referência é construída fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhadas a partir de uma pilha.Vários métodos de projeção podem ser aplicados, mas geralmente é escolhida uma projeção mediana para eliminar valores discrepantes da pilha de imagens. A célula de referência é uma ferramenta única e útil para representação e análise de imagens, obtida apenas com células de micropadrão. Para facilitar seu exame, é aplicada uma tabela de consulta ou LUT para converter a imagem monocromática em um mapa de frequência codificado.Para caracterizar o efeito da estatina nas BLEs, a rigidez e o colapso da célula foram analisados usando uma macro do Image J. Resumidamente, imagens com limiar definido do padrão micro L são usadas para definir uma hipotenusa teórica da forma triangular da célula. Em seguida, realiza-se o limiar nas imagens da marcação de actina para definir a forma da célula.A diferença na área entre a hipotenusa teórica e a membrana celular côncava real é então medida; as células que apresentam uma área abaixo da hipotenusa teórica são consideradas colapsadas. O impacto da estatina BLEs em cinco micromolar foi caracterizado comparando-se o número de células colapsadas nas condições tratadas e controle. Imagens típicas de células com micropadrão L tratadas com estatina BLEs ou deixadas sem tratamento são mostradas; as células foram fixadas e coradas em micropadrões.A actina e os núcleos são mostradas em vermelho, verde e azul, respectivamente. Observe o impacto do estatina BLEs na forma celular em comparação com as condições controle. Células representativas após incubação com estatina BLEs ou controles em fibronectina simples são mostradas aqui.As células foram fixadas e coradas, sendo o actina e os núcleos mostrados em verde e azul, respectivamente. Observe a semelhança entre as condições tratadas e controladas. São apresentadas imagens típicas de células de referência obtidas de células tratadas com estatina BLEs ou deixadas sem tratamento.Observe o potencial desta abordagem para a fácil observação do fenótipo em estudo. A seguir, temos um exemplo de análise dos efeitos do estatina BLEs sobre células utilizando a macro-hipotenusa. Enquanto 25% das células controle estavam colapsadas, esse valor triplicou para 75% nas células tratadas com estatina BLEs a cinco micromolar, refletindo a rede contrátil de actinina enfraquecida.Após assistir a isso, você agora deverá ter uma boa compreensão de como os padrões microadesivos resolvem vários gargalos na análise de alto conteúdo. Primeiro, o uso de padrões microadesivos tornou a captura de imagens, o processamento e a análise muito mais simples. Segundo, os padrões microestruturados permitem a detecção de efeitos muito sutis de fármacos em doses muito baixas, pois se reduz a variabilidade entre células ao normalizar sua morfologia e seu comportamento.E finalmente, em comparação com os milhares de células normalmente necessários para obter um bom resultado na análise celular, você precisa apenas de algumas dezenas de células para obter um resultado robusto e significativo utilizando nossa célula de referência.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Demonstramos um método simples para colocar as células em locais desejados sobre um substrato. Este método padrões células lançando um chip de silicone contendo micropoços preenchidos com células na superfície do substrato. Este método oferece uma nova forma de modular a sinalização difusíveis e juxtacrine entre as células.

Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

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Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

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Mapeando a organização espacial emergente de células de mamíferos usando Micropatterns e imagens quantitativas

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Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

Esta metodologia visa ilustrar os mecanismos pelos quais pistas de matriz extracelular, como rigidez do substrato, composição de proteínas e morfologia celular regulam o fenótipo de células schwann (SC).

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