Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

O objetivo geral do procedimento a seguir é mostrar como a normalização da arquitetura e posição celular alcançada em micropadrões adesivos específicos permite fácil automação da aquisição de imagens e processamento direto de imagens com quantificação sensível e robusta dos efeitos do medicamento, o que é inatingível em suportes convencionais de lamínula de vidro. Isso é conseguido semeando células heli em dois chips SI que carregam três micropadrões rotulados em forma de L SI. As células adotam a forma triangular, construindo uma grande fibra de estresse que abrange as duas extremidades do L. As células padrão são incubadas em seguida com estatina de lebos ou deixadas sem tratamento, depois fixadas e coradas para visualizar o citoesqueleto e os núcleos do acton.

As imagens das células do micropadrão são então adquiridas e processadas usando a macro ref da célula para gerar uma pilha de imagens para análise e a macro da hipotenusa para quantificar os fenótipos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um efeito significativo de baixas doses de estatina BLEs em células HELOC de micropadrão, o que é indetectável em condições padrão de cultura de células. Olá, seja bem-vindo.

Estamos aqui hoje para orientá-lo em nosso protocolo experimental explicando como usar micropadrões adesivos para análise celular, além de mostrar dados experimentais que ilustram a fácil quantificação de doses muito baixas de drogas nesses micropadrões adesivos. Portanto, ao ver esses micropadrões pela primeira vez, você entenderá imediatamente como ele pode resolver problemas de variabilidade na captura de imagens durante a análise celular. Porque, por ter uma matriz real de células, muito parecida com uma micro matriz, você pode facilmente mover o estágio do microscópio de célula para célula para poder capturar imagens de maneira gradual.

Mas isso, claro, não é a única vantagem dos micropadrões que ele oferece. Ele oferece muito mais melhorias porque, de fato, em certos micropadrões típicos, como o crossbo ou o Y, estamos de fato normalizando a arquitetura celular interna, o que significa que as organelas, o fuso mitótico, o citoesqueleto e diferentes redes de proteínas estão todos nos mesmos locais de célula para célula ou na mesma orientação de célula para célula, o que torna muito mais fácil prever e quantificar os efeitos das drogas nesses padrões específicos. Agora, isso pode parecer bastante contra-intuitivo em relação ao que normalmente é feito na placa de Petri clássica ou microplaca.

Bem, porque muitas vezes você vê, é claro, células se movendo e adotando morfologias diferentes. Considerando que nos micro padrões adesivos, todas as células começarão a se parecer porque estão respondendo a esse micro padrão adesivo e organizando sua arquitetura da mesma maneira. Isso pode parecer de fato um pouco artificial, mas quando você olha de perto, a placa de Petri não é ainda mais artificial?

Porque nos tecidos, as células são restringidas pelas células vizinhas, bem como pela matriz extracelular. Então, eles estão recebendo muita informação espacial, que está orientando a arquitetura da célula. E isso no local para anúncio de micro padrões é o que estamos fazendo.

Estamos restaurando essa informação espacial para as células e todas as células estão respondendo a isso e se organizando da mesma maneira. E agora, como as células são todas parecidas, podemos introduzir o conceito de célula de referência, o que significa que podemos calcular a média de todas as imagens e obter uma única imagem, que é realmente representativa da aparência da célula em uma determinada condição. Em seguida, você pode adicionar um medicamento e examinar novamente essa célula de referência e ver como ela modificou a morfologia ou a organização da célula em resposta a esse medicamento.

Coloque dois chips situ dois individualmente em dois poços independentes de uma placa de seis poços, garantindo que o logotipo situ dois seja legível. Os dois chips situ usados para este experimento têm micro padrões corados com FibroGen SI três e devem ser mantidos no escuro antes do uso. Colete células hela que são aproximadamente 80% confluentes por tripsina e verifique se elas estão devidamente individualizadas sob uma centrífuga microscópica a 300 G por quatro minutos e ressus, suspenda as células suavemente conte e dilua as células a uma concentração de 15.000 células por mililitro.

Em meios de cultura DMEF incompletos, 12 meios de cultura dispensam 60.000 células por poço. A placa deve ser movida o mínimo possível para evitar a introdução de movimentos rotativos no meio, que tenderão a concentrar as células no centro. Deixe as células sedimentarem por 10 minutos sob o capô e, em seguida, mova-as para a incubadora de células.

Dentro de 10 a 20 minutos na incubadora de células, as células começarão a aderir após 10 minutos, verifique regularmente ao microscópio quando as células estiverem conectadas. Troque o meio celular e remova o excesso de células repetindo o procedimento a seguir quatro vezes. Mantendo a placa plana, aspire suavemente o meio da lateral do poço.

Tenha cuidado para manter mídia suficiente para evitar que o chip seque. Adicione quatro mililitros de PBS e aspire começando no centro do chip. Em seguida, movendo-se para o lado do poço para aspirar a maior parte do PBS como antes, verifique ao microscópio se há células flutuantes.

Se restar uma grande quantidade de células flutuantes, repita o procedimento de lavagem. Se houver muito poucas células, aspire parte do PBS e substitua-o por dois mililitros de meio fresco, aspire e adicione quatro mililitros de meio fresco duas vezes. Incube as células por três horas em uma incubadora de células para permitir que as células se espalhem totalmente.

Usando este método, entre 10 e 30% dos micropadrões serão ocupados por uma única célula, enquanto outros padrões serão vazios ou ocupados por várias células. Para tratar as células com estatina BLEs, dilua a solução estoque de 17 milimolares do medicamento até uma concentração final de cinco micromolares com 0,1% de DMSO em quatro mililitros de meio. Para o controle, prepare o meio com 0,1% de DMSO, aspire apenas o meio celular e substitua-o rapidamente pela estatina BLEs ou pelas soluções de controle para evitar que o chip seque.

Incube as células por uma hora a 37 graus Celsius. Durante esta incubação, prepare o tampão do citoesqueleto. Adicione um grama de sacarose a dois mililitros de cb.

Isso ajuda a preservar as estruturas celulares internas. Misture um mililitro de sacarose CB com quatro mililitros de 5% de PFA. Adicione dois mililitros de PFA na solução de sacarose CB.

Em dois poços de uma placa fresca de seis poços. Para fixar as células, use uma pinça para pegar o chip CY dois e colocá-lo na placa de seis poços contendo dois mililitros de PFA em solução de sacarose CB. Incube as células por 10 minutos em temperatura ambiente, remova o PFA e lave as células uma vez com PBS e, em seguida, lave as células com dois mililitros de cloreto de amônio 100 milimolar por 10 minutos.

Para extinguir a atividade de reticulação residual do PFA, permeável as células adicionando dois mililitros de PBS contendo 0,1% tritton X 100 por três minutos, lavado duas vezes com filamentos de actina de coloração PBS com dois mililitros de ZI conjugado fain a um a 2000 em PBS com 1,5% BSA incubar por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células uma vez com dois mililitros de PBS. Em seguida, sustente os núcleos.

Adicione dois mililitros de um miligrama por mililitro vendido em PBS e incube por três minutos em temperatura ambiente. Lave duas vezes com dois mililitros de PBS. Monte os dois chips laterais em uma lâmina padrão usando 25 a 30 microlitros de soluções de montagem, como al.

Para adquirir imagens em três comprimentos de onda, usamos o software de imagem Metamorph e um microscópio T de eclipse de ícone NIK. Equipado com a câmera CCD Hema Matsu e um iluminador de fibra de mercúrio intens. Primeiro, selecione a ampliação de 20 x.

Em seguida, na barra de menus, abra a aquisição multidimensional. Para configurar os diferentes parâmetros do experimento. Primeiro, indique onde salvar seus dados.

Defina o número de comprimentos de onda para três, selecione o comprimento de onda SI três e posicione a lâmina de lamínula de forma que 12 micro padrões fiquem centralizados no campo da câmera. O número de micro padrões visualizados por campo varia de acordo com as configurações da câmera e da objetiva. Defina o tempo de exposição para cada comprimento de onda e foco automático.

Para o PS três, crie um diário executando a aquisição multidimensional e salve-o como MDA jnl. Abra a função de estágio de varredura para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micro padrões. Insira seis colunas e quatro linhas com menos 400 mícrons x tamanho do passo e 300 mícrons y tamanho do passo no diário definido para executar, carregue o diário MDA jnl pressione a varredura para iniciar a aquisição automatizada das 24 imagens nos três comprimentos de onda.

Neste vídeo, os micropadrões L são usados para desencadear a formação de uma única fibra de estresse de actina principal que sustenta a parte não anexada da célula e simplifica a visualização e medição do impacto da estatina BLEs nas células em comparação com as células assentadas na fibronectina simples. Para processamento e análise automatizados de imagens, descrevemos duas macros personalizadas escritas para a imagem J do programa de código aberto a partir de uma pilha de imagens brutas, a primeira macro extrai células individuais e cria uma célula de referência. A segunda macro mede o colapso da membrana celular.

O primeiro passo é a segmentação de células individuais a partir de imagens brutas. As imagens de micropadrão marcadas com fluorescência são usadas para delit regiões centradas nos micropadrões que são cortados em imagens para cada comprimento de onda e remontados em pilhas para cada comprimento de onda. Para selecionar micro padrões com células únicas, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina em todas as pilhas aquelas que contêm mais de um núcleo ou nenhum núcleo.

Finalmente, o registro de várias pilhas do plug-in Image J é usado para realinhar todas as imagens coletadas e todos os canais com base na posição do micropadrão. Esta etapa gera pilhas de linhas de imagens individuais que agora podem ser usadas para análise de célula única ou para criar uma célula de referência. Na imagem J, a célula de referência é construída fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhadas de uma pilha.

Vários métodos de projeção podem ser aplicados, mas geralmente uma projeção mediana é escolhida para eliminar valores discrepantes da pilha de imagens. A célula de referência é uma ferramenta única e útil para representação e análise de imagens obtidas apenas com células de micropadrão. Para facilitar seu exame, uma tabela de pesquisa ou LUT é aplicada para converter a imagem monocolorida em um mapa de frequência codificado.

Para caracterizar o efeito das estatinas dos BLEs, a rigidez e o colapso da célula foram analisados usando uma segunda macro J de imagem. Resumidamente, imagens de limiar do padrão L micro são usadas para definir uma hipotenusa teórica da forma do triângulo celular. Em seguida, o limiar das imagens da coloração de acton é realizado para definir a forma da célula.

A diferença de área entre a hipotenusa teórica e a membrana celular côncava real é então medida: as células que apresentam uma área abaixo da hipotenusa teórica são consideradas colapsadas. O impacto de cinco estatinas BLEs micromolares foi caracterizado comparando o número de células colapsadas em condições tratadas e controle. Imagens típicas de células de micropadrão L tratadas com estatina BLEs ou deixadas sem tratamento são mostradas células foram fixadas e micro padrões corados.

A actina e os núcleos são mostrados em vermelho, verde e azul, respectivamente. Observe o impacto das estatinas BLEs na forma da célula em comparação com as condições de controle. Células representativas após incubação com BLEs, estatina ou controles em fibronectina simples são mostradas aqui.

As células foram fixadas e coradas actina e os núcleos estão em verde e azul, respectivamente. Observe a semelhança entre as condições tratadas e controladas. Imagens típicas de células de referência obtidas de células tratadas com estatina BLEs ou não tratadas são mostradas.

Observe o potencial dessa abordagem para facilitar a observação do fenótipo em estudo. Aqui está um exemplo de uma análise dos efeitos das estatinas BLEs nas células usando a macro hipotenusa. Enquanto 25% das células de controle foram colapsadas, isso aumentou três vezes 75% nas cinco células tratadas com estatina BLEs micromolares, refletindo a rede contrátil de actinina enfraquecida.

Depois de assistir a isso, agora você deve ter uma boa compreensão de como os micropadrões adesivos resolvem vários gargalos na análise de alto conteúdo. Primeiro, o uso de micro padrões adesivos tornou a análise do processamento de captura de imagem muito mais direta. Em segundo lugar, os micropadrões permitem a detecção de efeitos muito sutis de drogas em doses muito baixas, porque você está reduzindo a variabilidade célula a célula, normalizando sua morfologia e seu comportamento.

E, finalmente, em comparação com as milhares de células que geralmente são necessárias para obter um bom resultado na análise celular, você só precisa de algumas dezenas de células para obter um resultado robusto e significativo usando nossa célula de referência.