Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido

O objetivo geral do sistema de posicionamento rápido de nano é fornecer informações estruturais em tempo real de biomoléculas, combinando experimentos de FRET de molécula única com análises estatísticas rigorosas. Este método responde a questões-chave no campo da biologia estrutural, como a localização de domínios flexíveis em macromoléculas, onde as ferramentas padrão de biologia estrutural não podem ser aplicadas. A principal melhoria do NPS rápido em comparação com outras ferramentas estruturais baseadas em FRET é que diferentes modelos de corantes podem ser comparados usando não apenas as posições mais prováveis, mas uma distribuição de probabilidade tridimensional.

A principal vantagem dessa técnica é que ela combina dados estruturais do banco de dados de proteínas com medições quantitativas de fluorescência de molécula única. Para iniciar o procedimento, monte uma câmara de fluxo e um porta-amostras. Para preparar os parafusos de entrada e saída, rosqueie o tubo de silicone nos parafusos de aba oca e corte o tubo reto em cada extremidade com uma lâmina de barbear.

Aparafuse os parafusos da aba no suporte de amostras. Alinhe os orifícios de quartzo da câmara de fluxo com as roscas do porta-amostras. Aperte suavemente os parafusos do suporte de vidro para fixar a câmara de fluxo no lugar.

Rosqueie pedaços de tubo de silicone de 20 centímetros de comprimento nos parafusos de entrada e saída. Lave a câmara de fluxo com 500 microlitros de PBS. Em seguida, lave a câmara de fluxo com 100 microlitros de solução de neutravidina em PBS, garantindo que uma gotícula se forme na extremidade do tubo de entrada para evitar que o ar entre na câmara de amostra.

Clamp a tubulação de entrada e saída fechada após cada manipulação para excluir o ar da câmara de fluxo. Incube a câmara por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave a solução de neutravidina com 500 microlitros de PBS.

Adicione uma gota de óleo de imersão no prisma e aparafuse o prisma na câmara de amostra. Os dados FRET de molécula única são adquiridos usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total. Inicie o software da câmera e o software do motor piezomotor do estágio.

Montar a câmara na fase micrométrica do microscópio TIRF horizontalmente, o mais reto possível, e de modo a cruzar os três lasers. Adicione líquido de imersão e focalize a objetiva do microscópio verificando as reflexões IR. Defina os parâmetros da câmera, o caminho do arquivo e os parâmetros de incremento automático.

Inicie a transmissão da câmera ao vivo e branqueie a fluorescência de fundo usando todos os três lasers com intensidades máximas. Em seguida, diminua as intensidades do laser. Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução de esferas fluorescentes na câmara.

Aguarde 10 minutos para que as contas se liguem à superfície da câmara. Grave um filme com um campo de visão de 50 a 100 esferas e execute uma análise em lote com um limite de detecção de pico alto. Carregue o arquivo de filme e escolha duas contas com centros distintos em cantos opostos do campo de visão.

Selecione os pixels de intensidade máxima nessas contas. Remova e limpe o prisma. Prepare uma segunda câmara de amostra e aparafuse o suporte do prisma na câmara.

Monte a câmara no micrômetro stage. Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução picomolar de 50 a 100 de amostra marcada com fluorescência biotinilada na câmara. Aguarde até que as moléculas se liguem à superfície da câmara.

Clique simultaneamente em Take Signal para iniciar a gravação e ligar o laser de excitação do doador. Ajuste a potência do laser para garantir que pelo menos 80% das moléculas no campo de visão sejam branqueadas, em seguida, mova a câmara para mostrar uma área não branqueada e grave o próximo filme. Branqueie o resto da câmara de amostra desta maneira.

Após as medições no microscópio TIRF, os dados de FRET de molécula única adquiridos precisam ser analisados para obter a eficiência média do FRET. Realize uma análise em lote dos filmes doadores e aceitadores da amostra. Em seguida, carregue os arquivos de filme em lote no software de análise de dados.

Clique no botão NÃO selecionado para indicar as fases individuais do FRET. Clique no início do período FRET, depois no momento em que a intensidade do aceptor diminui devido ao branqueamento e, finalmente, no momento em que a intensidade do doador diminui devido ao branqueamento. Na próxima janela, selecione Sim para manter o traço de eficiência FRET selecionado.

Uma vez que cada molécula tenha sido analisada, salve os traços e analise o próximo filme. Quando a análise estiver concluída, execute um script para combinar os resultados do FRET. Importe o arquivo FRET combinado em quadro para o software de análise de dados usando a opção de entrada padrão.

Plote os dados como um histograma e use a ferramenta de ajuste de curva não linear para ajustar a um gaussiano. O valor excedente é a principal eficiência do FRET. Use VIS UV e espectroscopia fluorescente para determinar o raio de Forster isotrópico e os valores de anisotropia no estado estacionário para cada corante.

O sistema de nano-posicionamento foi inspirado no conhecido GPS, pois localizamos uma posição desconhecida, a antena, com várias posições conhecidas, os satélites. Para iniciar a análise do NPS, inicie o software FastNPS e crie um novo arquivo de trabalho. Para definir os priores de posição das antenas e satélites rotulados, na janela ModelDyePrior, insira a resolução espacial da posição que está sendo definida.

Exclua o interior da macromolécula carregando o arquivo PDB centralizado correspondente. Insira o diâmetro do corante e a distância de esqueletização. Preencha as coordenadas de posição mínima e máxima do possível local do corante.

Se a posição que está sendo definida for um satélite, selecione a fixação do corante por meio do vinculador flexível e insira as coordenadas atômicas do arquivo PDB centralizado. Preencha o comprimento e o diâmetro do vinculante. Clique em calcular volume acessível, salve a posição anterior e exporte-a para visualização.

Repita esse processo para todos os satélites e antenas. Depois que as posições forem definidas, abra a janela Definir medição e crie uma nova molécula de corante. Carregue a posição anterior associada a esse corante.

Preencha a anisotropia de fluorescência, selecione um modelo de corante apropriado e ative o corante. Repita esse processo até que todos os corantes tenham sido definidos. Em seguida, crie uma nova medida.

Selecione um par FRET entre os corantes definidos. Insira a eficiência FRET de molécula única com erro e o raio de Forster isotrópico desse par de corantes e ative a medição. Repita isso para todos os pares de corantes.

Em seguida, abra a janela de cálculo. Se as tinturas tiverem sido atribuídas a modelos diferentes, selecione Definido pelo usuário. Caso contrário, selecione o modelo a ser usado para todos os corantes.

Execute o cálculo e abra a janela de resultados. Ao usar o FastNPS, é importante lembrar de adaptar os modelos para todos os corantes, a fim de minimizar os volumes confiáveis, mantendo-se, é claro, consistente. Se a consistência for inferior a 90%, clique em consistência detalhada e identifique os corantes comuns às entradas com menos de 90% de consistência.

Abra a janela Definir medição e altere o modelo do corante em questão. Execute novamente o cálculo no modo Definido pelo usuário. Exporte os volumes confiáveis dos corantes individualmente ou em lote.

Abra os arquivos de densidade no software de visualização e ajuste a credibilidade para o nível desejado. As eficiências de FRET de molécula única foram medidas entre moléculas de antena desconhecidas e várias moléculas satélites conhecidas dentro de um complexo promotor aberto de RNA polimerase archaea. A análise NPS desses dados determinou os volumes confiáveis dessas moléculas de corante em relação ao complexo promotor aberto da RNA polimerase archaea.

Cinco modelos diferentes onde as moléculas de corante foram usadas e os resultados foram comparados. Os volumes confiáveis foram consistentes com os dados medidos quando calculados com modelos que assumiram que o corante só pode girar livremente dentro de um cone de orientação desconhecida. O modelo clássico, em particular, é o mais conservador, pois pressupõe ainda que o corante está em um local fixo.

Isso cria um volume confiável relativamente grande, mas o volume geralmente envolve a posição correta. Modelos de maior precisão usam a suposição de que o corante é completamente livre para girar dentro de sua vida útil de fluorescência. O modelo iso, como o modelo clássico, pressupõe que o corante está em uma posição fixa dentro do volume acessível.

O modelo meanpos-iso assume uma média dinâmica sobre todas as posições possíveis. Embora os volumes confiáveis dos modelos iso sejam muito menores do que os calculados pelos modelos não-iso, eles são inconsistentes com os dados medidos. Queríamos desenvolver uma técnica que nos permitisse capturar informações estruturais dinâmicas de complexos transitórios, um problema que não poderia ser resolvido pelas ferramentas estruturais existentes.

Uma vez que os dados de FRET de molécula única tenham sido registrados, a análise FastNPS é feita em algumas horas, permitindo uma comparação rápida de diferentes modelos de corantes. Seguindo este procedimento, outros métodos, como simulações de MD, podem ser realizados posteriormente, a fim de obter modelos estruturados que sejam consistentes com dados experimentais de FRET de molécula única.