Name: Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprenda a obter dados de FRET de molécula única usando microscopia TIRF e inferência bayesiana para análise estrutural de biomoléculas. Este método permite localizar domínios flexíveis com distribuições de probabilidade tridimensionais.

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Os autores agradecem a B. Gruchmann pelos desenhos mecânicos da câmara de fluxo. Além disso, queremos expressar nossa gratidão a Max Beckers e Florian Drechsler por comentários e discussões perspicazes sobre o NPS e o mecanismo de amostragem subjacente.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
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<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
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<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
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<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
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<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
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<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
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<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apresenta-se o procedimento de instalação e experimental para determinar com precisão a eficiência FRET entre corantes ligados através de elementos de ligação flexíveis a biomacromoléculas, ou seja, ácidos nucleicos e / ou proteínas. A fim de assegurar medições precisas smFRET (secção 3), que é fundamental para excluir o ar da câmara de fluxo em qualquer momento durante a medição. Além disso, certifique-se de não sobrecarregar a câmara de fluxo com fluoróforos. Os fluoróforos devem ser claramente separadas para garantir a análise correta. Como pares smFRET, que não apresentam branqueamento do doador tem que ser excluídos da análise, certifique-se de que&gt; 80% das moléculas no campo de visão são branqueados no final do filme. Para ter em conta não homogeneidades na amostra do factor-β e o factor γ, corrigindo os cross-talk e relativas eficiências de detecção do canal de dador e aceitador, respectivamente, são calculados para cada par de FRET individualmente. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; As definições da câmara (tempo de integração, ganho de multiplicador de elétrons, ganho pré-amplificador e taxa de leitura descrito na Seção 3.9) deve ser definido para valores que dão o melhor equilíbrio entre a relação sinal-ruído, gama dinâmica e tempo-resolução. Eles precisam ser reajustado para diferentes experimentos ou se hardware diferente é usado. Os números de quadros precisa de ser suficientemente elevada para assegurar que a maior parte do doador moléculas lixívia dentro do período de observação. Para as medições sobre o espectrômetro de fluorescência (Secções 7 a 9) um bom compromisso entre a intensidade do sinal ea resolução espectral dos dados gravados tem de ser encontrada. Para este efeito, as fendas na via de excitação e emissão do espectrómetro de fluorescência têm de ser adaptados dependendo do instrumento usado e a concentração da amostra. Além disso, apresentamos o método de análise Fast-NPS para obter informações estrutural da MACROM transitória ou dinâmicocomplexos olecular. NPS foi aplicado para revelar o caminho do filamento de DNA não-molde e a posição dos factores de iniciação de transcrição no complexo aberta de ARN-polimerase de archaea. Usando a rede de mais de 60 medições de distâncias diferentes, mostramos que a Fast-NPS, equipado com um motor de amostragem recém-implementado (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., &amp; Michaelis, J. em preparação), reduz o tempo necessário para a análise desta rede smFRET complexo por ≈2 ordens de grandeza, em comparação com o método de NPS global original 27. a robustez do algoritmo está enraizada em um sampler Metropolis-dentro-Gibbs combinada com um esquema de têmpera paralelo. Fast-NPS mostra reprodutibilidade exata dos resultados da rede e é consistente com os resultados publicados anteriormente 30. Vários métodos diferentes foram publicados com o objetivo de inferir informações estruturais a partir de medições smFRET 11 </sup&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Todas estas abordagens fornecem apenas um modelo de corante específico. Assim, corantes, que não cumprem as suposições feitas pelo respectivo modelo, não pode ser usado ou levar a informações estruturais falsa. Fast-NPS, pelo contrário, permite seleccionar para cada molécula de corante de um modelo diferente. Isto ajuda a explicar diferente comportamento conformacional de ambas, a molécula de corante em si, bem como o ligante utilizado para a sua fixação. Os arredores moleculares locais da molécula do corante, bem como as suas propriedades físicas vai determinar qual o modelo que é mais adequada. Para a rede smFRET analisados ​​do complexo de iniciação de archaea, um pressuposto isotrópica para todas as moléculas de corante conduz a uma diminuição drástica in o tamanho dos volumes credíveis, em comparação com o modelo clássico. Em combinação com uma dinâmica posição média para todas as moléculas de corante da mediana de todos os tamanhos de volume credíveis (a 95%) reduz-se a menos de 0,5 Nm 3. No entanto, estes traseiros molécula corante já não são consistentes com suas medidas smFRET, indicando que as suposições feitas levam a informação estrutural falsa. Em contraste, os posteriores determinados no modelo clássico são consistentes com as eficiências smFRET determinados. Como o pressuposto de posição isotrópico e / ou dinâmico de uma média de todos os corantes levar a inconsistências, Fast-NPS permite antecedentes molécula do corante em que cada corante pode ser atribuída uma das cinco modelos. Cada modelo usa o mesmo volume acessível. O algoritmo para o cálculo dos AVs corante faz várias suposições. Na primeira, forma espacial do fluoróforo é aproximada por uma esfera. Assim, um diâmetro tendo em conta wid do fluoróforoth, altura e espessura deve ser utilizado (Seção 12). Além disso, a forma do ligante é aproximada por uma haste flexível. Os valores apresentados na Secção 12, foram calculados para o corante Alexa 647 ligado por via de um ligante de 12-C. Até à data, não é possível determinar com exactidão, a priori, qual o modelo mais adequado, dada a geometria experimental, e, portanto, todos os modelos devem ser testados. Em geral, uma irá escolher o modelo que dá o menor tamanho possível posterior, enquanto continua a ser consistente com os dados. Para testar se uma escolha de modelos é consistente com os dados smFRET, calcula-se tanto a parte posterior e a probabilidade. Consistência significa que mais de 90% das amostras recolhidas a partir da posterior estão dentro do intervalo de confiança de 95% da probabilidade. Embora seja verdade que quanto menor a anisotropia, quanto menor for a distância incerteza, numa rede smFRET disposições geométricas das moléculas de corante também tem que ser tida em conta. Assim, enquanto Representing moléculas de corante com uma baixa anisotropia de fluorescência com um modelo de iso é uma primeira escolha típica, o teste de consistência fornece um meio mais diretas para a escolha do modelo de corante correta. A escolha óptima de modelos de corante podem conduzir a um aumento drástico na precisão de localização e, ao mesmo tempo, manter a consistência da rede com os seus dados de FRET. Para resumir, Fast-NPS permite obter informações sobre a estrutura e dinâmica dos grandes complexos macromoleculares. Em contraste com os métodos estruturais comuns, tais como cristalografia de raios-X ou microscopia electrónica de crio este permite o monitoramento complexos altamente flexíveis ou transientes, assim aumentando grandemente o nosso entendimento mecanicista de processos biológicos complexos.

A determinação da estrutura de uma biomolécula é um pré-requisito fundamental para a compreensão da sua função. Dois métodos bem estabelecidos para a determinação da estrutura são microscopia de elétrons crio e cristalografia de raios X 1, 2. Hoje em dia, ambos os métodos proporcionam informação estrutural de alta resolução com uma resolução até o nível Angstrom. Estes dois métodos têm sido utilizados extensivamente para elucidar a estrutura de biomoléculas grandes, tais como complexos de proteína. Embora os métodos existentes têm sido constantemente melhorado ao longo das últimas décadas, a complexidade das estruturas biológicas ainda representa um grande desafio para a biologia estrutural, especialmente quando grandes complexos, dinâmicos e transitórios são investigados 3. A fim de estudar a dinâmica dos complexos macromoleculares ea relação estrutura-função em particular, metodologias de molécula única tem provinformações úteis ided 4. Várias novas estratégias foram desenvolvidas fornecendo uma abordagem ortogonal sobre a aquisição de informação estrutural e dinâmica. Exemplos são de alta velocidade AFM 5, 6 manipulação mecânica, microscopia de fluorescência localização 7, bem como uma única molécula de Transferência de Energia de Ressonância de Förster (smFRET) 8, 9. Desde muito cedo na FRET tem sido denominado uma régua molecular, devido à distância a dependência na escala de comprimento de 10 biomacromoléculas. Uma aplicação particularmente interessante do smFRET é usar a informação obtida a partir de medições de distância smFRET inferir estrutural informações 11, 12, 13, 14, 15 &gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Devido à elevada resolução de tempo de smFRET, a posição dos elementos móveis de uma estrutura de proteína pode ser localizada. No entanto, a fim de extrair a informação quantitativa a partir de dados smFRET importantes parâmetros de correcção sobre as moléculas de corante precisa de ser determinada durante a medição 24. Com estes factores de correcção, a eficiência de FRET FRET E pode ser calculado usando a fórmula <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> , onde A e I D Figura 2). O fator β representa cross-talk, a fuga de emissões de doadores para o canal receptor e é calculado <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> onde eu A e I 'D são as intensidades de fluorescência do dador e da molécula receptora após a foto branqueamento da molécula receptora. O factor γ corrige a diferença nas eficiências de detecção em relação nos dois canais, bem como as diferenças no rendimento quântico de fluorescência do dador e o corante aceitador. É calculado de cada traço do tempo individual, Note-se, que esta descrição negligencia excitação directa da molécula aceitadora, que por vezes se torna importante e que seria necessário para ser corrigido para assim. Para determinar esses fatores de correção é útil para excitar tanto o doador, bem como o receptor em um esquema de alternância 25, a fim de diferenciar entre mudanças foto-física e dinâmica estrutural. A fim de não só obter eficiências smFRET quantitativos, mas também informações sobre a estrutura quantitativa, o Sistema de Nano-Posicionamento (NPS) foi introduzido em 2008 26. O nome foi escolhido com base nas suas semelhanças com o sistema de posicionamento global por satélite (GPS). O NPS é uma técnica híbrida que combina smFRET e os dados de cristalografia de raios-X para a localização de posições de corante desconhecidos em complexos biomacromolecular. O Crystal estrutura serve como uma armação de referência e os resultados smFRET são utilizadas para obter informação sobre a distância entre uma posição desconhecido fluoróforo (antena) e uma posição conhecida a partir da estrutura cristalina (satélite). Em experiências consecutivas as distâncias entre a antena e vários satélites são medidos e a posição da antena é determinada por meio de um esquema de análise estatística rigorosa com base na estimativa de parâmetros Bayesiano. Como resultado, não só a posição mais provável da antena é calculado, mas a sua distribuição incerteza 3D completa, a chamada posterior, visualizado por volumes credíveis. Além disso, o NPS foi expandido para permitir a análise de redes atinjam 27 smFRET. O NPS tem sido utilizado para resolver um certo número de questões importantes na transcrição eucariótica, ou seja, o curso do ADN a montante, o DNA não-molde e o ARNm nascente no co alongamento de ARN polimerase IImplex 12, 28, também demonstra o efeito de factores de iniciação da transcrição 26 e a arquitectura dinâmico de um promotor-aberto complexo 29. Além disso, o NPS foi usada para elucidar a estrutura do complexo de archaea aberta de ARN polimerase 30 e, em particular, a posição de início de transcrição factor de TFE, que se liga competitivamente ao mesmo local como o factor de alongamento da transcrição Spt4 / 5 31. Desde então, uma série de abordagens baseadas smFRET estruturais foram publicados 15, 18, 21, 23. Ao comparar diferentes métodos baseados smFRET estruturais, torna-se claro que a aparente precisão do método é altamente dependente da escolha particular de modelos de corante. Note-se quemoléculas de corante pode apresentar um comportamento espacial e de orientação diferente, dependendo do seu ambiente local. Para este fim, Fast-NPS foi introduzido 32. Fast-NPS usa um algoritmo de amostragem avançada reduzindo os tempos de cálculo drasticamente. Além disso, o NPS-rápida permite a realização de uma análise estrutural e para cada molécula de corante o utilizador pode escolher a partir de um conjunto de cinco modelos diferentes de corante, que serão descritos a seguir. O modelo mais conservador, chamado de clássico, assume que o corante ocupa apenas um, mas desconhecida, posição. Nesta posição, o fluoróforo pode rodar livremente no interior de um cone, cujo tamanho é determinado a partir do seu respectivo anisotropia de fluorescência (dependente do tempo). A orientação do cone não é conhecida, o que conduz a grandes incertezas na conversão eficiências smFRET medidos em distâncias. A este respeito, é o modelo conservador, uma vez que irá conduzir à menor precisão em comparação com o outro modo de corantels. Somente para distâncias muito curtas caso as suposições feitas pelo modelo de liderança clássico para a determinação da posição visivelmente incorreto. Para valores smFRET típicos, a posição correta é sempre incluído no comparativamente grande volume credível. No entanto, uma vez que uma maior precisão é desejável, é importante para desenvolver e testar modelos de corantes alternativos, que poderiam ajudar a melhorar a precisão. Se o corante gira muito mais rápido do que o seu tempo de vida de fluorescência inerente, o assim chamado modelo ISO pode ser aplicada. Aqui, o factor de orientação de K 2 (necessária para o cálculo do raio Förster isotrópico característica <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) Está definido para 2/3. Como resultado, os volumes são calculados credíveis quase duas ordens de grandeza menor, em comparação com aqueles no modelo clássico 32. No caso em que o fluoróforo é encontrada num ambiente que permite não só reori rápidoentação, mas o movimento adicionalmente rapidamente em todo o seu volume acessível, deve ser utilizado o modelo meanpos-iso. Neste modelo, o corante ocupa efetivamente apenas uma posição média, onde a média espacial é representada por uma conversão de distância polinomial 15. Este modelo aplica-se, por exemplo, a (geralmente hidrofóbico) corante está ligado a uma região hidrofílica, por exemplo, o ADN. Aplicação do modelo meanpos-iso leva a uma redução adicional do tamanho dos volumes credíveis por um factor de aproximadamente dois. No entanto, um corante ligado a uma proteína pode ligar-se reversivelmente a várias manchas hidrofóbicas em seu volume estericamente acessíveis (AV). Um fluoróforo que instantaneamente alterna entre essas regiões, mas dentro de uma região sofre livre rotação e movimento rápido localizado é melhor descrito pelo modelo VAR-meanpos-iso. Para uma situação semelhante em que o corante não é livre para girar VAR-meanpos modelo se aplica. Mais d etails sobre esses modelos podem ser encontrados em nossa recente publicação 32. Estes modelos oferecem um extenso repertório de explicar especificamente para os diversos ambientes de um corante pode encontrar e aplicá-las com sabedoria otimiza sua precisão de localização. Em Fast-NPS cada molécula corante ligado a uma posição específica pode ser atribuído a um modelo individual, de modo que Fricção-parceiros são autorizados a ter modelos diferentes. Isto permite a modelagem ilimitadas e próxima do natureza. No entanto, é importante que uma executa testes estatísticos rigorosas para assegurar que o resultado obtido pela combinação modelo final ainda está em concordância com os dados experimentais. Estes testes são incluídos no software Fast-NPS. A fim de aplicar Fast-NPS para dados experimentais é requerida a medição de (apenas) de três parâmetros de entrada. Em primeiro lugar, o corante de par isotrópico Förster específica raios (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;) Têm de ser determinados. Portanto, o rendimento quântico (QY) do corante dador, os espectros de emissão de fluorescência de dador e absorção de aceitador os espectros têm de ser medidos. Essas medições podem ser efectuadas em grandes quantidades, usando um espectrómetro de padrão e um espectrómetro de fluorescência padrão. Para cada par, a R 0 é, então, calculado usando a PhotochemCAD gratuito e pode ser usado na análise de NPS. Além disso, as (tempo-resolvido) anisotropias de fluorescência das moléculas de corante precisa para ser obtido usando uma polarização (e tempo) sensível espectrômetro de fluorescência. no entanto, os parâmetros de entrada mais importantes para fast-NPS são as eficiências smFRET medidos em uma configuração de microscopia de fluorescência única molécula, tais como um total microscópio reflexão interna de fluorescência (TIRFM) . Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a obtenção de dados smFRET e aplicando Fast-NPS (Figura 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Preparação da câmara de fluxo</td></tr><tr><td>Suporte de amostra de metal personalizado</td><td>auto-construído</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de vidro de quartzo, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Detergente 101242</td><td></td><td>Marienfeld</td></tr><tr><td>, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>água ultrapura da Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto limpador de plasma</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropil)-trietoxissilano, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>metoxi PEG-succinimidil valerato, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>valerato de PEG-succinimidil biotinilado, 5</td><td>kDa Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTINA-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Biocarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>filme de vedação (Nescofilm)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubo de Silicone Flexível, 0.8&nbsp; mm ID, 2.4&nbsp; mm OD</td> Tubos de Polietileno <td>de 720958</td><td></td><td>Fine-Bore da Saint-Gobain Performance Plastics</td></tr><tr><td>, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscópio de fluorescência de reflexão interna total</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr> laser <tr><td>de estado sólido bombeado por diodo, 491 nm,</td> laser <td>de diodo 904010050</td><td></td>Calypso <td>Cobolt</td></tr><tr><td>643 nm, espelho dicróico iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>, espelho dicróico 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr>, filtro sintonizável acústico-óptico <tr><td>476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AA Lente</td> cilíndrica plano-convexa <td>AOTFnC-VIS</td><td></td>opto-eletrônica</tr><tr><td>, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>cilíndrica plano-côncava, f = -300&nbsp; mm</td><td>Prisma Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>lente de foco, f = 75&nbsp; mm</td> Bomba de seringa <td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 motores de passo, atuador piezoelétrico Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr>, laser de diodo IR <tr><td>PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>parte do espelho dicróico do sistema de foco automático</td></tr><tr><td>, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>detector de detecção de posição (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>parte do sistema de foco automático</td></tr><tr><td>objetiva de imersão em água, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>espelho dicróico, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>parte do filtro de emissão da via de</td></tr><tr><td>emissão, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>canal verde em o</td></tr> filtro de emissão da via de emissão<tr><td>, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>canal vermelho na câmera EMCCD da via de emissão</td></tr><tr><td>, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>Câmera EMCCD, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Diversos</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>Espectrômetro UV-VIS Espectrômetro</td></tr> de <tr><td>fluorescência</td><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>software de controle para a câmera EM-CCD</td></tr><tr><td>Utilitário de usuário Apt&nbsp; (V1.022)</td>Software <td>de controle Thorlabs</td><td></td><td>para os piezo-motores</td></tr><tr><td>Adesivo Óptico Norland 68</td><td>Adesivo Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Vermelho Nilo</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>contas fluorescentes multispec revestidas com avidina&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>linguagem de computação técnica para software escrito custon</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>software de análise de dados e gráficos científicos</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>cubeta de absorção de 1&nbsp; cm de comprimento do caminho</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40 Hellma</td><td></td><td>105-251-15-40</td><td>cubeta de fluorescência com 3 mm de comprimento de caminho</td></tr></tbody></table>

informação estrutural de uma única molécula de fret experimentos usando a nano-posicionamento sistema rápido

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

A transferência de energia de ressonância de Förster de molécula única (smFRET) pode ser usada para obter informações estruturais sobre complexos biomoleculares em tempo real. Assim, várias medições de smFRET são usadas para localizar uma posição de corante desconhecida dentro de um complexo de proteínas por meio de trilateração. Para obter informações quantitativas, o Nano-Positioning System (NPS) usa análise probabilística de dados para combinar informações estruturais da cristalografia de raios-X com dados de fluorescência de molécula única para calcular não apenas a posição mais provável, mas a distribuição de probabilidade tridimensional completa, denominada posterior, que indica a incerteza experimental. O conceito foi generalizado para a análise de redes smFRET contendo numerosas moléculas de corante. A versão mais recente do NPS, Fast-NPS, apresenta um novo algoritmo usando estimativa de parâmetros bayesianos com base na amostragem de Monte Carlo da Cadeia de Markov e têmpera paralela que permite a análise de grandes redes smFRET em um tempo comparativamente curto. Além disso, o Fast-NPS permite o cálculo do posterior escolhendo um dos cinco modelos diferentes para cada corante, que levam em conta os diferentes comportamentos espaciais e de orientação exibidos pelas moléculas do corante devido ao seu ambiente local.
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para obter dados smFRET e aplicar o Fast-NPS. Fornecemos instruções detalhadas para a aquisição dos três parâmetros de entrada do Fast-NPS: os valores de smFRET, bem como o rendimento quântico e a anisotropia das moléculas de corante. Recentemente, o NPS tem sido usado para elucidar a arquitetura de um complexo promotor aberto de archaea. Esses dados são usados para demonstrar a influência dos cinco diferentes modelos de corantes na distribuição posterior.

A transcrição é o primeiro passo para a expressão do gene em todos os organismos. Em Archaea, a transcrição é efectuada por um único RNA polimerase (RNAP). Em comparação com eucariontes, o RNAP archaeal tem uma semelhança estrutural marcante com os seus homólogos eucariotas ao ter uma maquinaria transcricional mais simples. Assim, Archaea pode ser usado como um sistema modelo para o estudo de iniciação da transcrição eucariótica pela RNA polimerase II (pol II). Recentemente, a arquitetura completa do complexo aberto archaeal RNA polimerase foi determinada a partir de uma única molécula de FRET e NPS. Os dados da análise NPS foi usado para construir um modelo do complexo promotor completa archaeal aberta, que fornece informações úteis sobre o mecanismo de iniciação da transcrição. Para elucidar esta estrutura, a eficiência smFRET foram medidos entre moléculas de corante antena desconhecidos localizados dentro do promotor com abertasplex e várias moléculas de corante por satélite conhecidos que foram incorporadas em cinco locais de referência na RNAP, cujas posições são conhecidas a partir de estruturas cristalográficas (APO-ID: 2WAQ) 37. Os corantes de antena foram ligados a qualquer uma das posições diferentes no DNA não-molde, de TFB, TBP ou TFE. A rede completa utilizada neste estudo consistiu em mais do que 60 distâncias medidas. A Figura 7 representa o modelo do complexo aberto promotor arquea completa construída a partir da análise de NPS. É composto pelo promotor de cadeia dupla de DNA (claro e azul escuro), a RNA polimerase (cinza) eo início fatores de transcrição TBP (roxo), TFB (verde) e TFE (amarelo). O modelo é sobreposta com os resultados da análise de NPS, os volumes credíveis, que foram calculados usando o modelo clássico (A), o modelo ISO (B), o modelo meanpos-iso (C), o modelo de var-meanpos-iso (D) e VAR-meanpos modelo (E). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho da aquisição e processamento dos parâmetros necessários para o cálculo Fast-NPS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> Figura 2: Exemplos de intensidade de fluorescência traço do tempo de um evento smFRET. As intensidades de fluorescência do dador (verde) e a molécula receptora (vermelho) que mostra as três fases características, nomeadamente i: smFRET, II: doador de fluorescência após a fotodegradação aceitador, III: fundo de fluorescência após a fotodegradação dador.g2large.jpg "target =" _ blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> Figura 3: Representação esquemática da câmara de fluxo para experiências smFRET. A câmara de fluxo é montado em um suporte de metal personalizado com suportes de vidro acrílico. A sanduíche de concepção da câmara de fluxo compreende um vidro de quartzo (sílica fundida) deslize com dois furos para a fixação de tubos de entrada e saída, um filme de selagem e uma lamela que fecha a câmara de fluxo. O prisma para TIRF iluminação é montado na metade inferior da câmara de fluxo. parafusos guia ocos fornecer a entrada e saídas para a câmara de fluxo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img> alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; Figura 4: Preparação da lâmina de vidro de quartzo e a película selante. Desenho mecânico da lâmina de vidro de quartzo, indicando as posições dos furos (dada em milímetros). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> Figura 5: Desenho mecânico da câmara de fluxo. As medidas de suporte de prisma do alumínio, acrílico suportes de vidro e estrutura de montagem de alumínio são dadas em milímetros. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> igura 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; Figura 6: Ilustração esquemática da configuração TIRF tipo prisma usado para experimentos smFRET. Abreviaturas para componentes ópticos: A, abertura; DM, espelho dicróico; F, filtro de emissão; G, lente; M, espelho; O, objetiva; P, prisma; PSD, a posição sensível de foto-diodos; S, amostra; PS, estágio posicionamento; T, telescópio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> Figura 7: Os resultados da simulação das diferentes suposições do modelo. Todas as imagens mostram a RNA polimerase archaeal (PDB-ID: 2WAQ, vista de cima), juntamente com o modelo de promotor de DNA (DNAt e ntDNA em azul e ciano, respectivamente), TBP (roxo), TFB (verde) e TFE (amarelo)na archaeal abrir complexa 30. Os volumes credíveis são sobrepostas para os resultados da simulação NPS de (A) o modelo clássico, (B) o modelo iso, (C) o modelo meanpos-iso, (D) o modelo VAR-meanpos-iso e (E) do var -meanpos modelo. Todos os volumes são mostrados em 68% credibilidade. O clássico e as redes var-meanpos são consistentes com os dados smFRET. Em contraste, as redes em que para todos os corantes é escolhido o iso, meanpos-iso ou o modelo VAR-meanpos-iso são incompatíveis com os dados medidos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos a configuração e o procedimento experimental para obter dados smFRET de grandes redes doadoras-aceitadoras com um microscópio TIRF. A análise passo a passo dessas medições com o software de inferência bayesiana Fast-NPS produz informações estruturais de alta resolução por meio da aplicação de modelos de corantes adaptados.

Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

O objetivo geral do sistema de posicionamento rápido de nano é fornecer informações estruturais em tempo real de biomoléculas, combinando experimentos de FRET de molécula única com análises estatísticas rigorosas. Este método responde a questões-chave no campo da biologia estrutural, como a localização de domínios flexíveis em macromoléculas, onde as ferramentas padrão de biologia estrutural não podem ser aplicadas. A principal melhoria do NPS rápido em comparação com outras ferramentas estruturais baseadas em FRET é que diferentes modelos de corantes podem ser comparados usando não apenas as posições mais prováveis, mas uma distribuição de probabilidade tridimensional.A principal vantagem dessa técnica é que ela combina dados estruturais do banco de dados de proteínas com medições quantitativas de fluorescência de molécula única. Para iniciar o procedimento, monte uma câmara de fluxo e um porta-amostras. Para preparar os parafusos de entrada e saída, rosqueie o tubo de silicone nos parafusos de aba oca e corte o tubo reto em cada extremidade com uma lâmina de barbear.Aparafuse os parafusos da aba no suporte de amostras. Alinhe os orifícios de quartzo da câmara de fluxo com as roscas do porta-amostras. Aperte suavemente os parafusos do suporte de vidro para fixar a câmara de fluxo no lugar.Rosqueie pedaços de tubo de silicone de 20 centímetros de comprimento nos parafusos de entrada e saída. Lave a câmara de fluxo com 500 microlitros de PBS. Em seguida, lave a câmara de fluxo com 100 microlitros de solução de neutravidina em PBS, garantindo que uma gotícula se forme na extremidade do tubo de entrada para evitar que o ar entre na câmara de amostra.Clamp a tubulação de entrada e saída fechada após cada manipulação para excluir o ar da câmara de fluxo. Incube a câmara por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave a solução de neutravidina com 500 microlitros de PBS.Adicione uma gota de óleo de imersão no prisma e aparafuse o prisma na câmara de amostra. Os dados FRET de molécula única são adquiridos usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total. Inicie o software da câmera e o software do motor piezomotor do estágio.Montar a câmara na fase micrométrica do microscópio TIRF horizontalmente, o mais reto possível, e de modo a cruzar os três lasers. Adicione líquido de imersão e focalize a objetiva do microscópio verificando as reflexões IR. Defina os parâmetros da câmera, o caminho do arquivo e os parâmetros de incremento automático.Inicie a transmissão da câmera ao vivo e branqueie a fluorescência de fundo usando todos os três lasers com intensidades máximas. Em seguida, diminua as intensidades do laser. Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução de esferas fluorescentes na câmara.Aguarde 10 minutos para que as contas se liguem à superfície da câmara. Grave um filme com um campo de visão de 50 a 100 esferas e execute uma análise em lote com um limite de detecção de pico alto. Carregue o arquivo de filme e escolha duas contas com centros distintos em cantos opostos do campo de visão.Selecione os pixels de intensidade máxima nessas contas. Remova e limpe o prisma. Prepare uma segunda câmara de amostra e aparafuse o suporte do prisma na câmara.Monte a câmara no micrômetro stage. Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução picomolar de 50 a 100 de amostra marcada com fluorescência biotinilada na câmara. Aguarde até que as moléculas se liguem à superfície da câmara.Clique simultaneamente em Take Signal para iniciar a gravação e ligar o laser de excitação do doador. Ajuste a potência do laser para garantir que pelo menos 80% das moléculas no campo de visão sejam branqueadas, em seguida, mova a câmara para mostrar uma área não branqueada e grave o próximo filme. Branqueie o resto da câmara de amostra desta maneira.Após as medições no microscópio TIRF, os dados de FRET de molécula única adquiridos precisam ser analisados para obter a eficiência média do FRET. Realize uma análise em lote dos filmes doadores e aceitadores da amostra. Em seguida, carregue os arquivos de filme em lote no software de análise de dados.Clique no botão NÃO selecionado para indicar as fases individuais do FRET. Clique no início do período FRET, depois no momento em que a intensidade do aceptor diminui devido ao branqueamento e, finalmente, no momento em que a intensidade do doador diminui devido ao branqueamento. Na próxima janela, selecione Sim para manter o traço de eficiência FRET selecionado.Uma vez que cada molécula tenha sido analisada, salve os traços e analise o próximo filme. Quando a análise estiver concluída, execute um script para combinar os resultados do FRET. Importe o arquivo FRET combinado em quadro para o software de análise de dados usando a opção de entrada padrão.Plote os dados como um histograma e use a ferramenta de ajuste de curva não linear para ajustar a um gaussiano. O valor excedente é a principal eficiência do FRET. Use VIS UV e espectroscopia fluorescente para determinar o raio de Forster isotrópico e os valores de anisotropia no estado estacionário para cada corante.O sistema de nano-posicionamento foi inspirado no conhecido GPS, pois localizamos uma posição desconhecida, a antena, com várias posições conhecidas, os satélites. Para iniciar a análise do NPS, inicie o software FastNPS e crie um novo arquivo de trabalho. Para definir os priores de posição das antenas e satélites rotulados, na janela ModelDyePrior, insira a resolução espacial da posição que está sendo definida.Exclua o interior da macromolécula carregando o arquivo PDB centralizado correspondente. Insira o diâmetro do corante e a distância de esqueletização. Preencha as coordenadas de posição mínima e máxima do possível local do corante.Se a posição que está sendo definida for um satélite, selecione a fixação do corante por meio do vinculador flexível e insira as coordenadas atômicas do arquivo PDB centralizado. Preencha o comprimento e o diâmetro do vinculante. Clique em calcular volume acessível, salve a posição anterior e exporte-a para visualização.Repita esse processo para todos os satélites e antenas. Depois que as posições forem definidas, abra a janela Definir medição e crie uma nova molécula de corante. Carregue a posição anterior associada a esse corante.Preencha a anisotropia de fluorescência, selecione um modelo de corante apropriado e ative o corante. Repita esse processo até que todos os corantes tenham sido definidos. Em seguida, crie uma nova medida.Selecione um par FRET entre os corantes definidos. Insira a eficiência FRET de molécula única com erro e o raio de Forster isotrópico desse par de corantes e ative a medição. Repita isso para todos os pares de corantes.Em seguida, abra a janela de cálculo. Se as tinturas tiverem sido atribuídas a modelos diferentes, selecione Definido pelo usuário. Caso contrário, selecione o modelo a ser usado para todos os corantes.Execute o cálculo e abra a janela de resultados. Ao usar o FastNPS, é importante lembrar de adaptar os modelos para todos os corantes, a fim de minimizar os volumes confiáveis, mantendo-se, é claro, consistente. Se a consistência for inferior a 90%, clique em consistência detalhada e identifique os corantes comuns às entradas com menos de 90% de consistência.Abra a janela Definir medição e altere o modelo do corante em questão. Execute novamente o cálculo no modo Definido pelo usuário. Exporte os volumes confiáveis dos corantes individualmente ou em lote.Abra os arquivos de densidade no software de visualização e ajuste a credibilidade para o nível desejado. As eficiências de FRET de molécula única foram medidas entre moléculas de antena desconhecidas e várias moléculas satélites conhecidas dentro de um complexo promotor aberto de RNA polimerase archaea. A análise NPS desses dados determinou os volumes confiáveis dessas moléculas de corante em relação ao complexo promotor aberto da RNA polimerase archaea.Cinco modelos diferentes onde as moléculas de corante foram usadas e os resultados foram comparados. Os volumes confiáveis foram consistentes com os dados medidos quando calculados com modelos que assumiram que o corante só pode girar livremente dentro de um cone de orientação desconhecida. O modelo clássico, em particular, é o mais conservador, pois pressupõe ainda que o corante está em um local fixo.Isso cria um volume confiável relativamente grande, mas o volume geralmente envolve a posição correta. Modelos de maior precisão usam a suposição de que o corante é completamente livre para girar dentro de sua vida útil de fluorescência. O modelo iso, como o modelo clássico, pressupõe que o corante está em uma posição fixa dentro do volume acessível.O modelo meanpos-iso assume uma média dinâmica sobre todas as posições possíveis. Embora os volumes confiáveis dos modelos iso sejam muito menores do que os calculados pelos modelos não-iso, eles são inconsistentes com os dados medidos. Queríamos desenvolver uma técnica que nos permitisse capturar informações estruturais dinâmicas de complexos transitórios, um problema que não poderia ser resolvido pelas ferramentas estruturais existentes.Uma vez que os dados de FRET de molécula única tenham sido registrados, a análise FastNPS é feita em algumas horas, permitindo uma comparação rápida de diferentes modelos de corantes. Seguindo este procedimento, outros métodos, como simulações de MD, podem ser realizados posteriormente, a fim de obter modelos estruturados que sejam consistentes com dados experimentais de FRET de molécula única.

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

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Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

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Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas de molécula única é um sensor de proximidade espectroscópico de fluorescência útil sensível às mudanças estruturais locais nas proteínas. Aqui mostramos que pode ser usado para descobrir conformações locais estáveis em α-Synuclein, que também é conhecida como globularmente desestruturada e instável quando medida usando a régua FRET de longo alcance.

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Este artigo apresenta um método para análise espiostemporal de sondas móveis, de uma molécula, baseadas em Förster, utilizando microscopia de fluorescência widefield. O kit de ferramentas de software recém-desenvolvido permite a determinação de traços de tempo smFRET de sondas móveis, incluindo a eficiência correta do FRET e as posições moleculares, em função do tempo.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de força atômica e da espectroscopia no infravermelho em nanoescala para avaliar o desempenho da espectroscopia no infravermelho fototérmico em nanoescala na caracterização de amostras tridimensionais multipoliméricas.

Avanços em Espectroscopia de Infravermelho em Nanoescala para Explorar Sistemas Poliméricos Multifásicos

Aqui, apresentamos o protocolo para estudar a flexibilidade local e a dinâmica de biomoléculas usando anisotropia de fluorescência resolvida no tempo no nível de molécula única no modo de microscopia confocal.

Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Aprenda a obter dados de FRET de molécula única usando microscopia TIRF e inferência bayesiana para análise estrutural de biomoléculas. Este método permite localizar domínios flexíveis com distribuições de probabilidade tridimensionais.

Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido

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