Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

O objetivo geral deste experimento é observar a expressão de múltiplos genes em células individuais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como heterogeneidade de assinaturas moleculares dentro de uma população de células ou uma assinatura molecular rara. A principal vantagem dessa técnica é que assinaturas moleculares específicas com pelo menos 48 genes diferentes podem ser avaliadas em muitas células ao mesmo tempo.

Comece este procedimento preparando uma mistura de pré-amplificação para 48 reações em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione ao tubo 240 microlitros de tampão de retrotranscrição específico, 62,4 microlitros de tampão EDTA TE baixo e 9,6 microlitros de Taq DNA polimerase. Usando uma pipeta eletrônica, distribua 6,5 microlitros da mistura de pré-amplificação para cada um dos 48 poços em uma placa de célula única de 96 poços.

Em seguida, prepare uma mistura de ensaio 0,2x em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione ao tubo 1,4 microlitros de cada primer. Ajuste o volume final para 140 microlitros com baixo tampão EDTA TE.

Usando uma pipeta eletrônica, distribua 2,5 microlitros da mistura de ensaio 0,2x para os 48 poços na placa de classificação de célula única de 96 poços, contendo a mistura de pré-amplificação. Sele a placa com uma película de cobertura. Vortex o prato e gire-o a 280 vezes g por um minuto.

Células linfóides inatas hepáticas únicas, ou ILCs, serão classificadas por classificação de células ativadas por fluorescência. Comece este procedimento usando uma placa vazia de 96 poços como teste. Posicione a placa de teste no suporte da placa com o poço à esquerda e em direção ao experimentador.

Ajuste o suporte da placa para obter uma gota no centro de um poço com contas de verificação. Quando devidamente ajustada, coloque a placa classificadora de célula única de 96 poços contendo a mistura de ensaio e a pré-amplificação no suporte da placa. Desenhe o layout da placa e classifique uma célula por poço da população fechada.

O posicionamento adequado de cada célula na placa de classificação de célula única de 96 poços é essencial, e um layout de placa deve ser mantido em um software de planilha. Deixe um poço contendo mistura de ensaio 0,2x e mistura de pré-amplificação sem células, como um controle sem entrada. Opcionalmente, deixe duas fileiras de seis poços para diluição do cDNA como controles para a eficiência do primer.

Imediatamente após a classificação de célula única, vórtice e rotação para baixo a placa de classificação de célula única de 96 poços. Coloque a placa no termociclador. Realize a transcrição reversa e a pré-amplificação conforme indicado.

A pré-amplificação de genes-alvo específicos em células individuais classificadas é necessária para se ter material suficiente. Dilua as amostras pré-amplificadas adicionando 36 microlitros de tampão EDTA TE baixo em cada poço. Para iniciar este procedimento, prepare 191 microlitros de um Master Mix pipetando 175 microlitros de um Master Mix qPCR e 17,5 microlitros do reagente de carregamento de amostra em um tubo de 1,5 mililitro.

Em uma nova placa de 96 poços, distribua 3,6 microlitros do Master Mix para cada um dos 48 poços. Esta é a placa de amostra de 96 poços. Transfira 2,9 microlitros de cDNA pré-amplificado da placa de classificação de célula única de 96 poços para a nova placa de amostra de 96 poços, mantendo a mesma posição para cada amostra entre as duas placas.

Prepare uma placa de ensaio de 96 poços distribuindo três microlitros de reagente de carregamento de ensaio para cada um dos 48 poços em uma nova placa de 96 poços. Adicione três microlitros de primers a cada poço. O posicionamento adequado de cada primer na placa de ensaio de 96 poços é essencial.

Mantenha um layout de placa em um software de planilha. Para iniciar este procedimento, coloque o circuito microfluídico integrado, ou IFC, na bancada e verifique as válvulas usando uma seringa. Remova a tampa da seringa, coloque-a perpendicularmente a uma válvula e pressione com firmeza.

O O-ring deve se mover. Encha o chip com fluido da linha de controle. Depois de repetir as etapas anteriores com a segunda válvula, remova o filme preto da parte inferior do chip.

Carregue o chip no controlador IFC. Na tela do controlador IFC, selecione prime e execute. Em seguida, ejete o chip e feche novamente o filme preto na parte inferior do chip.

Usando uma pipeta de oito canais, transfira cinco microlitros da placa de ensaio de 96 poços para o lado esquerdo do chip. Troque as pontas para cada poço do chip. Evite criar bolhas e, se aparecerem bolhas, use pontas de 10 microlitros para removê-las.

Preencha o lado esquerdo do chip conforme indicado. Da mesma forma, preencha o lado direito do chip usando cinco microlitros da placa de amostra de 96 poços. Para o sucesso deste experimento, é essencial que o chip IFC seja preenchido adequadamente para carregamento adequado no controlador IFC.

Remova o filme azul da parte inferior do chip e carregue o chip no controlador IFC. Na tela do controlador IFC, selecione load mix e execute. Quando terminar, ejete o chip e feche novamente o filme azul na parte inferior do chip.

Para executar o chip, primeiro selecione o software de coleta de dados no computador qPCR microfluídico. Depois de iniciado, selecione nova execução. Selecione ejetar e carregar o chip.

Depois de configurar o software conforme descrito no protocolo de texto, selecione iniciar execução. A reação levará aproximadamente 90 minutos. Para iniciar a análise de dados, abra o software de análise de PCR em tempo real, selecione o arquivo e abra, encontre a pasta do experimento e selecione chip run dot b m one file.

Clique na visualização de análise, tabela de resultados e visualização de mapa de calor. As caixas marcadas com um x estão abaixo do nível de detecção do limite e/ou apresentaram curvas de amplificação ruins. Nomeie as amostras.

Vá para a configuração de amostra e selecione o novo SBS 96. Clique em mapeamento e selecione o layout da amostra de acordo com o layout da placa de amostra de 96 poços. Copie e cole o design de layout de amostra do software de planilha.

Defina o layout colado como nome de amostra. Use o mesmo procedimento para nomear os ensaios. Insira os nomes dos primers na configuração do detector e defina o layout colado como nome do detector.

Clique em analisar visualizar e analisar. Selecione o arquivo, exporte e salve como resultados do mapa de calor. Usando citometria de fluxo, as populações hepáticas de ILC foram classificadas com base em marcadores de ILC amplamente expressos, e três populações distintas foram definidas.

Um chip de expressão gênica multiplex de célula única devidamente carregado deve aparecer com linhas retas e linhas, com cada câmara de reação preenchida e na mesma dimensão. Um chip carregado incorretamente terá linhas vazias e linhas de câmaras de reação, bem como linhas de dobra. Esta figura de amidita de fluoresceína de um chip devidamente carregado mostra diferenças no brilho da câmara de reação aparecendo após alguns ciclos.

As câmaras de reação com sinal de amplificação parecem mais brilhantes do que as câmaras de reação com nenhum ou baixo sinal de amplificação. Após a classificação, pré-amplificação e carregamento de células adequadas, a população de ILC pareceu heterogênea para a expressão gênica no fígado de camundongos adultos do tipo selvagem. À esquerda está um mapa de calor sem modificações.

À direita está o mapa de calor modificado obtido após a definição do nome da amostra e do ensaio. Usando software online, assinaturas de expressão gênica específicas de células e relações de população celular foram identificadas. Cada linha representa um gene, e cada linha representa a mesma célula, e as três populações de células são representadas em azul, vermelho e verde.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em nove horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante acompanhar cuidadosamente a orientação da placa para distribuições de células e primers. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem assinaturas moleculares raras e específicas em populações celulares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como avaliar a expressão de vários genes em muitas células individuais ao mesmo tempo, após a classificação, pré-amplificação e carregamento adequados das células.