Name: Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a introduzir sondas químicas em fragmentos de anticorpos por incorporação genética de aminoácido contendo azida e cicloadição SPAAC. Este método permite marcação específica por simples mistura.

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1. O plasmídeo Construção <ol><li> Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-HerFab-L177TAG) que expressam o gene do anticorpo alvo (pBAD-HerFab-WT) com um Sua 6-tag, e substituir o codão para a leucina-177 com o códon de âmbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénese dirigida ao local convencional. Veja a Tabela de Materiais. </li><li> Construir outro plasmídeo de expressão (pEVOL-AFRS) contendo os genes para o tRNA Tyr evoluiu e aminoacil-tRNA sintetase par (RAA). Use o vector plasmídeo especialmente concebido, pEVOL, para incorporação eficiente do UAAS. Os protocolos de informação plasmídeo e clonagem detalhadas são descritas no relatório anterior. 28 </li><li> Obter DNA de plasmídeo de alta qualidade, utilizando kits de preparação de plasmídeos disponíveis comercialmente. A proporção de ~ 1,8 260/280 é óptima para o ADN purificado. Se necessário, realizar uma% de electroforese em gel de agarose para verificar a pureza do ADN. </li></ol><ol><li> eletroporação <ol><li> Adicione cada DNA 1 mL de pEVOL-AFRS 28 e pBAD-HerFab-L177TAG a 20 mL Escherichia coli DH10β tensão. Misturar suavemente, usando uma pipeta. Os plasmídeos podem ser transformados em conjunto ou em reacções independentes. </li><li> Para 0,1 cm cuvetes, defina as configurações de eletroporação a 25 mF e 2,5 kV. </li><li> Coloque a célula no slide da câmara chocante. Empurrar o slide para a câmara até a tina fique em contato firme com os eletrodos de câmara. </li><li> Pulsar uma vez, premindo o botão de pulso até que os bips máquina eletroporação. </li><li> Adicionar 1 mL de super caldo óptima com catabólica repressão (SOC) meio contendo 2% (w / v) de triptona, 0,5% (w / v) de extracto de levedura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, e glucose a 20 mM rapidamente à cuvete e transferir a mistura para um tubo de ensaio. Incubam-se as células durante 1 h a 37 ° C com agitação.</li><li> Células de E. coli transformada E. espalhadas sobre Lisogenia Broth (LB) agar contendo os antibióticos apropriados (35 ug / ml de cloranfenicol e 100 ug / ml de ampicilina para selecção pEVOL-RSFA e pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Incubar as placas a 37 ° C durante 12 h. </li></ol></li><li> preparação de cultura <ol><li> Inocular uma única colónia transformada em 5 mL de meio LB contendo antibióticos. Incubar durante 12 h a 37 ° C com agitação. </li></ol></li></ol> 3. Expressão e Purificação de HerFab-L177AF <ol><li> Expressão de HerFab-L177AF <ol><li> Transferir a cultura primária (5 mL) em 200 mL de meio LB contendo ampicilina (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguido de incubação a 37 ° C com agitação. NOTA: solução estoque AF 100 mM (10 ml) foi preparada por dissolução de 206 mg de FA em 100 mM de ácido clorídrico (10 ml, volume final). </li><li> Adicionar 2 mL de 1,6 M arabinose (16concentração final mM) quando a cultura atingir a fase log-(OD550 = 0,8, DO = densidade óptica). Incubar durante 12 h a 30 ° C com agitação. </li><li> Células colheita por centrifugação a 11000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e congelar o sedimento a -20 ° C. </li></ol></li><li> A lise celular <ol><li> Ressuspender os sedimentos celulares em 20 ml de tampão de lise periplasmática contendo 30 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, sacarose a 20%, e 0,2 mg / ml de lisozima, e incubar a mistura durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Centrifuga-se o lisado celular a 18000 xg, a 4 ° C durante 15 min. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e descartar o sedimento. </li></ol></li><li> Cromatografia de afinidade de Ni-NTA <ol><li> Adicionar a suspensão de resina de Ni-NTA para cada tubo de centrifugação (400 mL de resina de uma cultura de 200 mL), e agitar suavemente a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Verter a suspensão em uma coluna de polipropileno e lavar a resina três vezes com 5 mL de lavagem buffer contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 20 mM, e NaCl 300 mM. </li><li> Elui-se o anticorpo alvo com tampão de eluição de 300 uL contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 250 mM e NaCl 300 mM. </li><li> Determinar a concentração de proteína mutante por Bradford ensaio de proteína de 29 ou através da medição da absorvância a 280 nm. Calcular o coeficiente de extinção (75866 M-1cm-1) para HerFab-L177AF a 280 nm pelo coeficiente de extinção da proteína calculadora utilizando o coeficiente de extinção (2471 M-1cm-1) para AF. NOTA: A sequência de aminoácidos de HerFab pode ser encontrada no site do NCBI (GI: 783282791 e GI: 783282792). </li></ol></li></ol> 4. Conjugação de Purificada HerFab-L177AF com Alcino Sondas Usando cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain (SPAAC) <ol><li> Adicionar 20 ul de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) em H2O (20081; M de concentração final) a uma solução de 10 mL de HerFab-L177AF (10 uM de concentração final) em tampão de fosfato contendo 10 mM de Na 2 HPO 4 (pH 7,0) e NaCl 100 mM. NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorinated (DIFO) e biciclo [6.1.0] nonino derivados (BCN) também estão disponíveis para a mesma aplicação. </li><li> Permitir que a reacção de cicloadição promoveu-estirpe prosseguir durante 6 h a 37 ° C. Se é usada uma sonda sensível à luz (por exemplo, Cy5.5), cobrir o vaso de reacção com uma folha de alumínio. </li><li> Purificar o HerFab rotuladas de acordo com a etapa 5. </li></ol> 5. Purificação de HerFab Labeled <ol><li> Adicionar 500 ul de amostra a uma coluna de centrifugação filtro centrífugo. </li><li> Centrifugar a coluna de centrifugação a 14.000 xg, a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Rejeitar de fluxo e de transferência de amostra purificada a partir da coluna de spin para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Como uma alternativa para a etapa 5.1- 5.3, executar Purificação por diálise contra o mesmo tampão. </li><li> Armazenar o HerFab purificado marcado a 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE Análise de HerFab Rotulado <ol><li> Adicionar tampão de amostra de proteína de 5 uL de LDS contendo 106 mM Tris-HCl, Tris base 141 mM (pH 8,5), 2% de LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G250, e fenol 0,175 mM de vermelho a 13 uL de purificado marcado HerFab (7,8 ^ M ou 0,38 mg / mL) na presença (+) ou ausência (-) de 2 ul de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentração final). Incubar a mistura a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Anexar o Bis-Tris cassete de gel de SDS-PAGE a 4-12% para a célula de electroforese e adicionar tampão de corrida. Coloque as amostras de proteína conjugados e o marcador de peso molecular pré-manchado. Efectuar a electroforese de gel durante 35 min a 200 V. Nota: manter a célula de electroforese no escuro durante todo o período para minimizar o foto-branqueamento do fluoróforo. </li><li> Após a electroforese, a transferênciao gel a um scanner de gel fluorescente, e verificar se há emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado. Para Cy5.5, utilize o modo Cy5 no software do scanner. </li><li> Manchar o gel com uma mancha de proteína comercial. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. 3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da proteína alvo. Geralmente, ...

Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, 1 mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. 1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, 4 azida, alcino 5, 6 cyclooctyne, tetrazina 7, 8 α, amida β-insaturado, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Embora cada grupo funcional tem as suas vantagens e desvantagens, os aminoácidos contendo azida foram mais extensivamente utilizada para a conjugação de proteínas. p -Azidophenylalanine (AF), um dos aminoácidos contendo azido, está prontamente disponível, e a sua incorporação efficiency é excelente. pode-se fazer reagir as proteínas mutantes contendo este aminoácido com alcinos por cicloadição catalisada por cobre ou com cyclooctynes ​​por SPAAC. 12-20 Recentemente, biofármacos têm atraído muita atenção na indústria farmacêutica. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é uma classe de anticorpos terapêuticos que são vantajosos devido à sua capacidade para terapia-alvo para o tratamento de cancros humanos e 21 outras doenças. Mais de 50 ADCs estão actualmente em ensaios clínicos, eo número está aumentando rapidamente. No desenvolvimento dos ADCs, muitos factores devem ser considerados para maximizar a eficácia e minimizar os efeitos colaterais. Entre estes factores, a reacção de conjugação eficiente e específica do local para formar uma ligação covalente entre um anticorpo e um fármaco é crítica. A eficiência e especificidade desejada na reacção de conjugação pode ser conseguida por conjugação com um grupo funcional numa bioorthogonalaminoácido não natural que é especificamente incorporada num anticorpo. 22-26 Aqui, nós relatamos um protocolo para o site especificamente incorporar AF em um fragmento de anticorpo e o conjugado do fragmento de anticorpo mutante com uma sonda bioquímica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Construção de plasmídeo</pBAD_HerFab_L177TAG</td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>plasmídeo</td> >forte <td>Opcionalmente, contém o códon de parada âmbar (TAG) na posição desejada. Ko, W. et al. Marcação de anticorpos eficiente e específica do local por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmídeo pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Um sistema aprimorado para mutagênese de aminoácidos não naturais em E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Host Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pacote</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Preparação de Cultura</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Eletroporação</td></tr><tr><td>Micro pulsador</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Micro cubeta de pulso</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm de folga do eletrodo, pacote de 50</td></tr><tr><td>Ampicilina Sódica</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de Ágar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC médio</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Expressão e purificação de HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Expressão de Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>3,2 Lise celular</forte></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de sal dissódico EDTA di-hidratado, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td></td><td>Sigma S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>3,3 Cromatografia de afinidade Ni-NTA</forteResina ></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Coluna de polipropileno</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50 / pacote, capacidade de 1 mL</td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico, 98%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr> <tr><td colspan = "4 "><forte>4. Conjugação de HerFab-L177AF purificado com sondas de alcino usando cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>5. Purificação de</td></tr> <tr><td>Filtros Centrífugos HerFabAmicon Ultra 0,5 mL</td> Rotulados <td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pacote, 500 &#956; L capacidade</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>6. Análise SDS-PAGE de HerFab rotulado e varredura de gel fluorescente</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES running buffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE géis</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 poços</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 gerador de imagens de modo variável</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente e rotulagem de anticorpos por cicloadição azide-alcino promoveu-strain site-specific

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).

Neste estudo, um fragmento de anticorpo foi local especificamente conjugado com um fluoróforo por incorporação de um aminoácido contendo azida no fragmento e fazendo reagir o fragmento de anticorpo mutante com um cyclooctyne tensas (Figura 1). HerFab foi seleccionado como o fragmento de anticorpo-alvo em que AF foi incorporado como um aminoácido contendo azida. Para escolher o resíduo em HerFab para a substituição com FA, foi analisada a estrutura de cristal de raios-X d...

Aqui, apresentamos um protocolo para introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida e, subsequentemente, acoplando a azida a uma sonda química por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química, como modificação de proteínas, engenharia e conjugação. A principal vantagem dessa técnica é que sua sonda ou caldo alvo pode ser introduzido especificamente no local em proteínas ou anticorpos por meio de uma simples mistura.Depois de construir os plasmídeos, adicione um microlitro de cada a 20 microlitros de E.Coli cepa DH10-beta a uma concentração de duas vezes 10 elevado a oito células por microlitro a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Use uma pipeta para misturar suavemente a solução. Em seguida, coloque 20 microlitros da solução misturada em uma cubeta limpa.Defina a máquina de eletroporação para 25 microfarads e 2.5 quilovolts. Em seguida, insira a cubeta na corrediça da câmara de choque. Empurre a corrediça para dentro da câmara até que a cubeta faça contato firme com os eletrodos da câmara.Pressione o botão de pulso uma vez até que a máquina de eletroporação emita um bipe. Depois disso, adicione um meio SOC de milil

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar...

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

Os corantes fotoestáveis de cianina são ligados a oligonucleotídeos para monitorar a hibridização por transferência de energia.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Um procedimento pormenorizado para a síntese de uma azida marcado com 125I e a radiomarcação de dibenzocyclooctyne (DBCO) -Grupo-conjugados, nanopartículas de ouro de 13 nm de tamanho, utilizando uma reacção de clique sem cobre é descrito.

Um protocolo otimizado para a radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro usando um<sup&gt; 125</sup&gt; Marcado com Eu Azida grupo prostético

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Incorporando um derivado do ciclopropeno de lisina em anticorpos permite a ligação de site-specific, rápida e eficiente de moléculas de tetrazine-rolamento para gerar o cojugado anticorpo-droga.

Codificação genética de um aminoácido não-canônicos para a geração de anticorpos-droga conjuga através de uma reação rápida opaco

Neste protocolo, descreveremos a síntese de vagens, phenyoxadiazolyl metil sulfona-baseado reagente para a ligação local-seletivo de cargas para os tióis de biomoléculas, especialmente de anticorpos. Além disso, descreveremos a síntese e caracterização de um quelante bifuncional PODS-rolamento e sua conjugação com um anticorpo de modelo.

Síntese e Bioconjugation dos reagentes Thiol-reativa para a criação de Site-seletivamente modificado Immunoconjugates

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

Aprenda a introduzir sondas químicas em fragmentos de anticorpos por incorporação genética de aminoácido contendo azida e cicloadição SPAAC. Este método permite marcação específica por simples mistura.

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

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