Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

O objetivo geral deste procedimento é introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química, como modificação de proteínas, engenharia e conjugação. A principal vantagem dessa técnica é que sua sonda ou caldo alvo pode ser introduzido especificamente no local em proteínas ou anticorpos por meio de uma simples mistura.

Depois de construir os plasmídeos, adicione um microlitro de cada a 20 microlitros de E.Coli cepa DH10-beta a uma concentração de duas vezes 10 elevado a oito células por microlitro a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Use uma pipeta para misturar suavemente a solução. Em seguida, coloque 20 microlitros da solução misturada em uma cubeta limpa.

Defina a máquina de eletroporação para 25 microfarads e 2.5 quilovolts. Em seguida, insira a cubeta na corrediça da câmara de choque. Empurre a corrediça para dentro da câmara até que a cubeta faça contato firme com os eletrodos da câmara.

Pressione o botão de pulso uma vez até que a máquina de eletroporação emita um bipe. Depois disso, adicione um meio SOC de mililitro à cubeta rapidamente. Em seguida, transfira a mistura para um tubo de ensaio.

Incubar com agitação a 37 graus Celsius por uma hora. Após a conclusão da incubação, espalhe as células de E.Coli transformadas em placas de ágar caldo de lisogenia contendo antibióticos apropriados. Incube as placas a 37 graus Celsius por 12 horas.

Após a conclusão da incubação da placa, inocular uma única colônia transformada em cinco mililitros de meio LB contendo antibióticos. Incubar com agitação por 12 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira a cultura primária para 200 mililitros de meio LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina e uma FA milimolar. Incubar com agitação a 37 graus Celsius por pelo menos três horas.

Adicione dois mililitros de arabinose molar 1,6 quando a cultura atingir uma densidade óptica de 0,8 a 550 nanômetros. Em seguida, incubar com agitação a 30 graus Celsius por 12 horas. Quando a incubação estiver completa, colher as células por centrifugação a 11 000 vezes g durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e congele o pellet a 20 graus Celsius negativos. Quando estiver pronto para lisar as células, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de tampão de lise paraplasmática em um novo tubo de centrífuga. Incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, centrifugue o lisado celular a 18.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e rejeitar o sedimento. Em seguida, adicione 400 microlitros de uma suspensão de resina Ni-NTA.

Usando um rotador, agite suavemente o tubo por uma hora a quatro graus Celsius. Após a mistura estar completa, despeje a suspensão em uma coluna de polipropileno. Lave a resina três vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem.

Eluir o anticorpo alvo com 300 microlitros de tampão de eluição. Depois disso, determine a concentração da proteína mutante conforme descrito no protocolo de texto. Comece adicionando 10 microlitros de uma solução 10 micromolar de HerFab-L177AF em tampão fosfato contendo 10 milimolares de fosfato de sódio dibásico e 100 milimolares de cloreto de sódio a um tubo de centrífuga fresco.

Em seguida, adicione 20 microlitros de uma solução micromolar de 200 de Cy 5,5 azadibenzociclooctileno em água. Depois disso, cubra o recipiente de reação com papel alumínio. Permita que a reação de cicloedição promovida pela mancha prossiga por seis horas a 37 graus Celsius.

Quando a reação estiver completa, adicione 30 microlitros de amostra e 450 microlitros de tampão fosfato para lavar o corante Cy 5.5 em uma coluna de centrifugação do filtro centrífugo. Centrifugar a coluna de centrifugação a 14 000 vezes g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o fluxo e, em seguida, transferir a amostra purificada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Armazene o HerFab rotulado purificado a quatro graus Celsius, a menos que esteja pronto para análise. Comece adicionando 13 microlitros de HerFab purificado de 7,8 micromolares a um tubo novo. Em seguida, adicione cinco microlitros de tampão de amostra de proteína LDS.

Incube a mistura a 95 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, conecte o de gel quatro a 12% Bis-Tris SDS-PAGE à célula de eletroforese. Adicione buffer de execução.

Em seguida, carregue as amostras de proteínas conjugadas no fabricante de peso molecular pré-corado. Realize eletroforese em gel por 35 minutos a 200 volts. Após a conclusão da eletroforese, transfira o gel para um sistema de documentação e análise de gel.

Procure Cy 5.5 e, em seguida, core o gel com um corante de proteína comercial. Neste estudo, o fragmento de anticorpo Her-Fab é conjugado especificamente no local com um Isso é feito incorporando um aminoácido contendo azida no fragmento e, em seguida, reagindo o fragmento de anticorpo mutante com um ciclooctina esticado. A análise SDS-PAGE é realizada para proteínas mutantes expressas com e sem o aminoácido contendo azida.

Como pode ser visto, o fragmento de anticorpo de comprimento total foi obtido apenas na presença do aminoácido. O anticorpo contendo o aminoácido é avaliado quanto à conjugação via reação com um derivado de azadibenzociclooctileno ligado a Cy 5.5 Cy 5.5 e analisado por SDS-PAGE. As imagens de fluorescência mostram conjugação do fragmento de anticorpo mutante com Cy 5.5, enquanto nenhuma conjugação foi observada no controle.

Uma vez devidamente expressa e purificar sua proteína com acetilfenilalanina, a proteína pode ser eficientemente marcada com uma sonda com a cepa Como a reação de marcação não requer reagente adicional, você pode introduzir a sonda em sua proteína alvo simplesmente misturando a sonda com sua proteína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como introduzir uma sonda química específica do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida.