Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

O objetivo geral dos experimentos a seguir é rotular especificamente DNA e proteínas usando metil transferases, que transferem naturalmente o grupo metil ativado e o cofator Sile l metionina chamado aome para D-N-A-R-N-A. Proteínas ou pequenas biomoléculas. A marcação em uma etapa é alcançada substituindo o cofator natural omitido por cofatores sintéticos de aína que alteram o curso da reação, levando ao acoplamento enzimático de todo o cofator e, portanto, à marcação covalente da sequência do substrato A marcação específica do DNA induzida pela metil transferase é demonstrada com a DNA metil transferase específica da adina, M-B-S-E-C, que acopla o cofator Aine biotinilado seis BAZ à sequência de reconhecimento A-G-C-G-A-T levando à sequência, especificamente biotinilada, DNA metil transferase direcionada transferência de grupos ativados é o uso de proteína de marcação e é demonstrado usando MTAs conjunto sete nove, que transfere um grupo pro pargo de C oito oin para lisina quatro da histona H três.

O resíduo de lisina alquilada é quimicamente marcado por um Fluor modificado azi usando química de clique catalisada por cobre, levando assim a uma proteína especificamente marcada. Uma vantagem do uso de metanfettransferases para rotulagem é que elas têm o potencial de atingir diretamente substratos nativos. Demonstrarei isso por meio da bioTE elação específica da sequência do plasmídeo, DNA Meth transferase, modificação catalisada de proteínas com o cofator análogo zina e permite a introdução de uma ampla variedade de grupos repórteres em duas etapas.

Demonstrarei isso por marcação de fluorescência da proteína histona H três e mostrando resultados da marcação de H três com biotina. Além disso, os análogos de cofator duplamente ativados podem ser facilmente sintetizados carregando Sail, el homocisteína, o produto do cofator após a transferência do grupo metil com vários álcoois ativados. Os análogos de cofatores sintéticos são purificados por HPLC de fase reversa e, em alguns casos, é até possível separar o epi Marte em enxofre.

O DNA sorridente é uma marcação de DNA induzida por metiltransferase específica da sequência. Aqui, o conceito é demonstrado marcando o DNA do plasmídeo PB 3 22 com seis cofatores BAZ Aine e a DNA metil transferase específica da adina. M-B-S-E-C um começa com hawing os seis BAZ a 20 graus Celsius.

Uma vez pensado, repare a mistura de reação no gelo. Inclui um micrograma de plasmídeo, 60 micromolares de seis BAZ e 10 equivalentes de MBS Sequência de reconhecimento HER no DNA em tampão de modificação.

Certifique-se de adicionar os seis BAZ e M-B-S-E-C um por último. Certifique-se de que não haja AME ligado à metanfetaminase que você está usando, pois o cofator natural bloqueará a rotulagem. React For controla.

Substitua os MTAs por água para visualizar quaisquer modificações não específicas do cofator e adicione água em vez de cofator para testar o cofator natural no concentrado enzimático. Agora misture as reações suavemente com uma pipeta e incube-as a 55 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, repare uma mistura de endonuclease no gelo adicionando 10 microlitros de 10 x tacômetro recombinante, um tampão a 80 microlitros de água e, em seguida, adicionando 3,3 microlitros de recombinante tak uma endonuclease de restrição.

Após a incubação, puxe as reações com um giro rápido e, em seguida, verifique a modificação do DNA em cada uma. Adicione dois microlitros de 10 x tak, um tampão e 28 microlitros da mistura de endonuclease. Misture as reações com pipetagem suave.

Agora incube as reações a 65 graus Celsius por meia hora. Quando as reações estiverem completas, puxe a solução com um giro rápido e colete 25 microlitros das reações em novos tubos. A essas alíquotas, adicione 2,4 microlitros de TTR estreptocócico em tamponado a um milimolar por monômero de estrepto.

Agora incube essa reação por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione cinco microlitros de seis x tampão de carregamento às reações concluídas e esgote 10 microlitros em um gel 1%agros a 80 volts por cerca de uma hora. Em seguida, visualize as bandas mt A é a abreviatura de transferência direcionada de metil transferase de grupos ativados.

Nesta demonstração, a metil transferase definiu sete, nove e cofator C duplamente ativado oito. Oin são usados para rotular lisina quatro de sua histona H três. Depois de descongelar os componentes em misturas de reação de 20 microlitros de reparo de gelo, a solução de ensaio contém tampão de modificação 10 micromolar de histona H três e adicionado os últimos 10 micromolares de metil transferases mais 600 micromolares de cofator.

Faça um controle enzimático substituindo o C oito ON por água deionizada. Faça também um controle de cofator para visualizar modificações inespecíficas, incluindo 60 milimolares de ADO encontrados para competir com os cofatores sintéticos. Agora misture as reações com a peste lenta do tubo e verifique seu pH com tiras de teste. Os análogos de cofator duplamente ativados são armazenados em condições C.

Portanto, o pH de sua solução de reação pode mudar adicionando cofator, se necessário, em pequenas quantidades de hidróxido de sódio 50 milimolares para ajustar o pH. Agora incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas durante o reparo da incubação. Um gel de poliacrilamida 12% SDS pouco antes do término da incubação, faça 20 microlitros de cinco x mistura de clique contendo sulfato de cobre de três mili molares, três mili molares de ligante T-H-P-T-A de 250 milimolares, isca ACO de sódio e seis milimolares de azida de Tamara.

No final da incubação, adicione cinco microlitros da mistura de clique a cada reação e misture as reações lentamente por carícia. Proteja as reações da luz usando papel alumínio e incube-as a 20 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, remova o excesso de clorofórmio precipitando as proteínas.

Adicione 75 microlitros de metanol, 18,7 microlitros de clorofórmio e 50 microlitros de água a cada reação e vórtice-os brevemente após cada adição. Depois de preparar cada tubo, gire-os a 16.000 G por cinco minutos. Remova a fase superior da separação sem perturbar a camada de interface, que contém as proteínas.

Agora adicione 56,3 microlitros de metanol, a fase inferior e o vórtice. Em seguida, gire isso para pellet a proteína e descarte o supinato. Em seguida, adicione 56,3 microlitros de metanol.

Mais uma vez, vórtice. Repita a centrifugação e recupere os pellets. Deixe os pellets secarem em seus tubos, sem tampa e cobertos com papel sem fiapos.

Posteriormente, dissolva as proteínas em 20 microlitros de tampão de carga SDS com corante de carga. Enxágue as paredes do tubo com o tampão para coletar o pellet. Em seguida, incube os tubos a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Uma vez que os tubos tenham atingido a temperatura ambiente, gaste-os brevemente para puxar seu conteúdo e visualizar as proteínas por página SDS. Execute a 120 volts por cerca de 90 minutos. A reação de sorriso foi realizada com a DNA metil transferase M-B-S-E-C uma, que modifica o segundo resíduo de adenina dentro da sequência A-T-C-G-A-T de fita dupla e tem um local de reconhecimento no plasmídeo PBR 3 2 2, que é marcado em vermelho para testar a marcação do plasmídeo.

PB 3 2 2 foi desafiado com a restrição recombinante ENDONUCLEASE T um, que tem sete sítios em PB 3 22 marcados em verde, um dos quais está incluído no sítio M-B-S-E-C um. Quando ocorre a rotulagem, este local deve ser protegido contra clivagem no gel. Isso foi confirmado.

Um novo fragmento com 683 pares de bases apareceu demonstrando que havia rotulagem no local M-B-S-E-C um. Isso é visto apenas na pista de ensaio, que é a pista três. A especificidade da reação de marcação foi demonstrada pelo deslocamento da eletromobilidade.

Após a adição de strept adin, a eletromobilidade do fragmento de 683 pares de bases marcado com biotina foi retardada. Enquanto a mobilidade dos fragmentos sem o M-B-S-E-C um sítio permaneceu inalterada, ou uma marcação em duas etapas de substratos de metil transferase com oito análogos de oh met duplamente ativados. Foram utilizadas a histona H, três lisina, quatro metil transferase, conjunto sete nove e o cofator pequeno C oito ON.

A eletroforese em gel foi utilizada para detecção de fluorescência apenas na pista de ensaio. A pista um mostrou uma banda fluorescente correspondente à histona H três, indicando que a cadeia lateral do cofator foi especificamente transferida e a proteína modificada foi marcada com a Tamara Flora.Quatro. A coloração ESI serve como um controle de carga.

Todas as pistas mostraram a mesma quantidade de proteína. Os substratos da metiltransferase também podem ser marcados com reações de biotina com uma biotina derivada de azi. No lugar de um flúor foram testados por Western blotting com peroxidase de rábano.

A rotulagem bem-sucedida e específica de Aden conjugada foi vista depois de assistir a este vídeo. Você deve ter um bom entendimento de como rotular DNA e sequência de proteínas, especificamente com texto de afinidade, força de flúor ou outros rótulos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que outros mets e seus análogos são sensíveis à temperatura.

Sempre manuseie-os no gelo e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Eu sintetizei dupla ativação. Outros análogos do MET com o grupo de repórteres já incorporados à cadeia lateral e os usaram para rotular especificamente o DNA em uma única etapa.

Estou especialmente entusiasmado com a perspectiva de combinar diferentes enzimas e grupos de relatórios para mapeamento de DNA usando técnicas de molécula única. Sorrir e NEC são muito flexíveis, e quase todos os grupos químicos podem ser transferidos não apenas para DNA e proteínas, mas também para RNA e pequenos usando transferências apropriadas de metanfetamina.