Name: Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a rotulagem específica de sequência de DNA e proteínas usando metiltransferases com análogos de cofator sintéticos. Este método permite marcar substratos nativos em uma ou duas etapas para estudos de interações biomoleculares.

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Os autores agradecem a Kerstin Glensk por preparar os MTases M.BseCI e Set7/9 e agradecem o financiamento da Iniciativa de Excelência dos Governos Federal e Estadual Alemão e da Universidade RWTH Aachen. Os autores têm o prazer de fornecer 6BAz e SeAdoYn ou outros análogos de cofator para pesquisa colaborativa.

1. Instruções Gerais <ol><li> Aziridina loja cofactor 6BAz (em DMSO) e proteína MTase SET7 / 9 a -80 ° C e todos os outros reagentes, incluindo co-factor activado SeAdoYn dupla e ADN MTase M.BseCI (em glicerol a 50%) à temperatura de -20 ° C. </li><li> Determinar a concentração de 6BAz e SeAdoYn via UV / Vis utilizando os coeficientes de extinção ε 269nm (6BAz) = 16,000 centímetros -1 M-1 e ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 centímetros -1 M-1 em água deionizada. Determinar a concentração de MTases pelo ensaio de Bradford ou, se o coeficiente de extinção está disponível, por meio de absorção directa a 280 nm. </li><li> Tentar evitar a criação de bolhas por pipetagem intensivo ou em vortex para evitar a perda de actividade da enzima. Em vez disso, misture cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Quando a adição de co-factores de aziridina partir de soluções mãe em DMSO a certificar-se de que a concentração final de DMSO no ensaio é de menosdo que 5%. Sempre incluir 10 mM de iões de magnésio no tampão de ensaio para evitar reacções não específicas com o ADN. </li><li> Quando a adição de co-factores activados duplas a partir de soluções de estoque ácidas utilizar pequenos volumes (soluções de reserva altamente concentrada) para evitar a variação do pH e certificar-se de que o pH da solução de ensaio não se altera significativamente. Evitar, por exemplo, tióis, β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT), em tampão de ensaio, porque eles podem interferir com a reacção de cliques por complexação dos iões de cobre necessários. </li></ol> 2. Um passo Rotulagem de DNA via Aziridine Cofactores <ol><li> Específica da sequência Induzido por Metiltransferase Etiqueta ing (sorrindo) de DNA plasmídeo com M.BseCI DNA MTase e aziridine cofator 6BAz. <ol><li> Descongelar o cofactor solução a 20 ° C e preparar as misturas de reacção em gelo. </li><li> Além de realizar um ensaio de controlo &quot;cofactor&quot;, para visualizar as modificações não específicas, e um &amp; #8220; enzima &quot;controle, para se certificar de que a preparação MTase está livre do AdoMet cofator natural. </li><li> Para a mistura do ensaio 2 ul de tampão de modificação 10x (contendo 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl 2, 20 mM de β-mercaptoetanol, pH 7,4), 2 uL do pBR322 (0,5 ug / uL), 10 eq. M.BseCI por sequência de reconhecimento no ADN (sequência de reconhecimento em pBR322 1) e o cofactor aziridina 6BAz para uma concentração final de 60 pM num volume total de 20 ul. Adicionar cofator e DNA MTase passada. NOTA: β-mercaptoetanol é tóxico, corrosivo e prejudicial para o ambiente. </li><li> Para o controle &quot;cofator&quot; adicionar água deionizada em vez de M.BseCI e para o controle de &quot;enzima&quot; adicionar água deionizada em vez de 6BAz. </li><li> Misture as soluções cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Incubar os tubos a 55 ° C durante 1 h. </li><li> Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos. </li></ol></li><li> Ensaio restrição-modificação para verificar modificação DNA. <ol><li> Prepara-se uma solução por mistura de 10 ul de tampão 10x R.TaqI (contendo 100 mM de Tris-HCl, 50 mM de MgCl 2, 1 M de NaCl, 1 mg / ml de albumina de soro bovino, pH 8,0), 80 ul de água desionizada e 3,3 mL da endonuclease de restrição (Rease) a partir de Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / ul). Certifique-se de adicionar o Rease na última etapa. </li><li> Para cada tubo de 2.1.7 adicionar 2 ul de tampão Taq 10x R. e 28 ul da solução a partir de acima (2.2.1). </li><li> Misture as soluções cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Incubar os tubos a 65 ° C durante 30 min. </li><li> Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos. </li></ol></li><li> Teste de desvio de Electromobility (EMSA) com estreptavidina para verificar modificação funcional. <ol><li> Remover 25 mL de cada tubo (2.2.5) e adicionar 2,4 mL de uma solução de estreptavidina (1 mM com respeito a estreptavidina monomer estreptavidina em tampão contendo 100 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 100 mM, pH 7,5; 4 equivalentes de biotina total). Adicionar 2,4 mL de tampão de estreptavidina para os restantes tubos. </li><li> Incubar todos os tubos a 37 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Análise através de electroforese em gel de agarose. <ol><li> Adiciona-se 5 mL de tampão de carregamento 6x (0,25% de azul de bromofenol, 30% de glicerol) a cada tubo. </li><li> Misture delicadamente as soluções. </li><li> Carga de 10 ul de cada amostra para os poços de um gel de agarose (1% de agarose em tampão TBE 0,5x contendo 1x GelRed a partir de uma solução estoque 10.000x). </li><li> Execute o gel em tampão TBE 0,5x com 80 V por aprox. 1 hr. </li><li> Visualizar as bandas de ADN numa mesa de UV (312 nm) com uma câmara CCD equipado com um filtro (540 ± 50 nm). NOTA: a luz UV é prejudicial para os olhos e pele. </li></ol></li></ol> 3. Duas fases de marcação de proteínas via casal Cofactores activados <ol><li> MethyltransfTransferência de Grupos ativado (mTAG) com SET7 / 9 e cofator double-ativado SeAdoYn para histona H3 lisina 4 rotulagem (etapa de modificação) apagar-dirigida. <ol><li> Descongelar os componentes e preparar as misturas de reacção em gelo. NOTA: Sempre mantenha SeAdoYn resfriado para evitar a degradação. </li><li> Além de realizar um ensaio de controlo &quot;cofactor&quot;, para visualizar as modificações não específicas, e um controlo de &quot;enzima&quot;, para excluir as reacções não específicas da sonda fluorescente. </li><li> Prepara-se uma solução de ensaio (20 ul) contendo tampão de modificação (50 mM Tris-HCl, 5% de glicerol, pH 8,5), 10 mM de histona H3, 10 uM SET7 / 9 e 600 uM SeAdoYn (mistura de ambos os epímeros em selénio). Nas últimas etapas adicionar cofator e depois MTase. </li><li> Para o controlo &quot;cofactor&quot; preparar uma solução de ensaio como em 3.1.3 e adicionar AdoMet 60 mM para competir com o cofactor sintético. Para o controle de &quot;enzima&quot; adicionar água deionizada em vez de SeAdoYn.</li><li> Misture as soluções por lentamente pipetagem cima e para baixo. Verificar o pH por adição de 1 ul de cada solução para o campo superior de uma faixa de pH (gama de pH de 5 - 10). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> No gel entretanto preparar um gel de SDS-poliacrilamida a 12% (em execução: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) de APS, 0,04% (v / v) e TEMED a 12% de acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1 ; carregamento do gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) de APS, 0,04% (v / v) e TEMED a 5% de acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1). NOTA: A acrilamida / bisacrylamide é tóxico e nocivo à saúde. Usar luvas durante este procedimento. </li></ol></li><li> Rotulagem Chemical de lisina alkinylated 4 em histona H3 via cicloadiï¿½o azida-alcino (CuAAC) (etapa de rotulagem) catalisada por cobre. <ol><li> Pouco antes do fim da reacção de modificação preparar uma mistura 5x clique contendo 3 mM de CuSO 4, 3 mM de tris (3-hidroxipropil-triazolilmetil) amina (THPTA), ascorbato de sódio 250 mM e TAMRA 6 mM de azida com umvolume total de 20 ul. </li><li> Adiciona-se 5 uL da mistura de 5x clique recentemente preparada a cada tubo para iniciar a CuAAC e extingue-se a reacção de modificação. </li><li> Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Proteja todos os tubos com folha de alumínio da luz para evitar a foto-branqueamento do fluoróforo. </li><li> Incubar a 20 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Precipitação de proteínas para remover o excesso de livre fluorophore TAMRA. <ol><li> Para evitar resplendor da marcação fluorescente histona H3 por intensivo fluorescência in-gel de livre fluorophore TAMRA, retire o excesso fluorophore por precipitação de proteínas (3.3.2 - 3.3.4) 34. </li><li> Adicionar 75 mL de metanol, 18,8 mL de clorofórmio e 50 ul de água desionizada a cada tubo e vortex brevemente após cada adição. Centrifuga-se a 16000 xg durante 5 min. Remover a fase superior sem perturbar a camada de interface, que contém a proteína. </li><li> Adicionar 56,3 mL de metanol à fase restante in cada tubo, vortex e centrifuga-se a 16.000 xg durante 5 min para sedimentar a proteína. Remover o sobrenadante. Repetir esta etapa para lavar o sedimento. </li><li> Cubra os tubos abertos com um tecido que não solte fiapos e deixe-os secar por 15-30 min. </li></ol></li><li> Análise via SDS PAGE. <ol><li> Dissolve-se as proteínas precipitadas a partir de 3.3.4 em 20 ul de tampão de carga SDS (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w / v) de SDS, 10% (v / v) de glicerol, 320 mM β-mercaptoetanol e 0,05% (w / v) azul de bromofenol, pH 6,8). Certifique-se para dissolver completamente o sedimento, por lavagem das paredes dos tubos com uma pipeta. </li><li> Incubar as amostras a 95 ° C durante 10 min e deixa-os arrefecer até 20 ° C. </li><li> Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos. </li><li> Coloque toda a quantidade de cada amostra para os poços de um gel de poliacrilamida SDS (3.1.7). Use 50 mM de MOPS, 50 mM de Tris-X (Tris-base), EDTA 5 mM, 0,1% (w / v) de SDS como tampão de corrida para electroforese. </li><li>Execute o gel com 120 V por aprox. 90 min. </li><li> Visualizar a fluorescência em gel sobre uma mesa de UV (312 nm) com uma câmara CCD equipado com um filtro (540 nm ± 50 nm). NOTA: a luz UV é prejudicial para os olhos e pele. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores divulgam o seguinte interesse financeiro concorrente: E.W. é inventor de patentes relacionadas.

Rotulagem de uma etapa de DNA com MTases DNA e cofatores aziridina (DNA sorrindo) é um método robusto, mas alguns aspectos devem ser considerados quando se planeja o experimento. Cofactor aziridina: A concentração 6BAz para marcação de ADN com M.BseCI foi de 60 uM. Ao usar outros MTases DNA a concentração cofator deve ser otimizada, por exemplo, concentrações tão baixas como 20? M têm sido empregadas com o DNA MTase M.TaqI 19. Baixas concentrações 6BAz tem a vant...

Rotulagem específica de ácidos nucléicos e proteínas 1,2 3,4 é de grande interesse para caracterizações funcionais, diagnóstico médico e (nano) biotecnologia. Aqui apresentamos um método de marcação enzimática para esses biopolímeros que é baseada no S -adenosyl-l-metionina (AdoMet ou SAM) methyltransferases -dependentes (MTases). Esta classe de enzimas (EC 2.1.1.) Tem como alvo as posições individuais nucleofílicos (azoto, oxigénio, enxofre e átomos de carbono) no interior resíduos específicos de ácidos nucleicos e proteínas e naturalmente transfere o grupo metilo activado da AdoMet cofactor (Figura 1A) 5. Além disso, pode utilizar MTases análogos sintéticos de cofactor para marcação específica com fluoróforos, marcadores de afinidade ou outras etiquetas (Figura 1B) 6. Duas classes de análogos da AdoMet foram desenvolvidos: cofactores aziridina para M ethyltransferase- específico equence S-I L abel ING (sorrindo) 7 e duplos análogos ativados AdoMet para dirigida por ethyltransferase m T ransferência de A ctivated rupos G (mTAG) 8. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" width="700"> Figura 1: As reacções catalisadas por metiltransferases (MTases) de transferência de grupo A. Metil do cofactor naturais AdoMet (SAM) a vários substratos, incluindo ADN, ARN, proteínas e pequenas biomoléculas B. Etiquetagem / funcionalização de ácidos nucleicos e proteínas (NNNNN. =. pares de bases de DNA, nucleotídeos de RNA para ácidos e aminoácidos das proteínas; XXXXX = sequência de reconhecimento do MTase com resíduo alvo em verde) com análogos cofactor sintéticos. Cofatores Aziridine contendo um grupo repórter (esfera azul)ligado ao anel de adenina são especificamente sequência acoplado com o resíduo alvo (esquerda) e análogos dupla activada AdoMet conduzir à transferência de cadeias alquilo que transportam um repórter estendidos química Y (direita), que podem ser marcados por reacção bioorthogonal clique num segundo passo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Cofatores Aziridine trabalhar melhor com DNA MTases. Eles contêm um anel de três membros, com um átomo de azoto, 9 (ou um seu N mostarda 10,11) em vez do centro do grupo de sulfónio como reactivo. A protonação do átomo de azoto presente no anel de aziridina activa para o ataque nucleofílico pelo nucleotídica alvo que leva para o acoplamento covalente de todo o co-factor com ADN. Ao ligar-se grupos repórter para o anel de adenina os cofactores de aziridina pode ser utilizado em combinação com DNA para rotular MTases ADN em um passo ( <stron> g&gt; Figura 1B, à esquerda) 7,12. Isto é demonstrado em detalhe para a biotinilação de ADN com 6BAz 13-15 (cofactor aziridina com biotina ligada à posição 6 do anel de adenina) e a adenina-specific DNA MTase de Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Figura 2, consulte a seção de protocolo 2: rotulagem de uma etapa de DNA via aziridina cofatores). Além M.BseCI ('sequência de reconhecimento, o MTases ADN de Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG Um -3 5'-ATCG A T-3)'), a partir de Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-G C GC-3') e de Spiroplasma (M.SssI, 5'-G C-3 ') foram usados ​​com sucesso para biotinilar ADN com 6BAz 17. Além disso, co-factores de aziridina pode ser empregue para um passo de ADN de fluorescência rotulagem 18,19. </stron>ontent "fo: manter-together.within-page =" always "&gt; <img alt="A Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" width="700"> Figura 2:. Sequência de biotinilação específica de um passo de ADN com M.BseCI e 6BAz O ADN MTase M.BseCI reconhece a sequência de ADN de cadeia dupla 5'-ATCG A T-3 'e naturalmente metila o grupo amino da segunda adenina resíduo (verde) usando AdoMet. Com o co-fator aziridine 6BAz o curso da reacção é alterada e M.BseCI leva para sequenciar biotinilaï¿½o DNA específico acoplando todo o cofator incluindo biotina (azul) com a adenina alvo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Duplos análogos AdoMet activados contêm estendido cadeias laterais insaturadas em vez de um grupo metilo no centro de sulfónio (Figura 1B 20. A ligação dupla ou tripla insaturada em β-position para o centro da sulfonium compensa eletronicamente efeitos estéricos desfavoráveis ​​no interior do estado de transição de estabilização conjugative. Uma vez que tanto o centro de sulfonium ea ligação insaturada ativar a cadeia lateral para a transferência enzimática, estes cofatores foram nomeados análogos AdoMet double-ativadas. Tipicamente, eles são utilizados para transferir as cadeias laterais com grupos repórteres únicos químicos (químicos), como grupos amino, alquino e azida, para rotulagem quimio-selectiva numa segunda etapa 8,21. Em geral, os análogos dupla ativada AdoMet pode não só funcionam como co-fatores para DNA MTases 8,20,21, mas também para RNA MTases 22,23 e MTases proteína 24-28 permitindo rotulagem adicional de RNA e proteínas. No entanto, as cadeias laterais estendidas estão estericamente mais exigente do que um grupo metilo e alargando os locais activos MTAse por engenharia de proteínas é frequentementeen necessária para a obtenção de taxas de transferência eficientes. Outra solução para este problema é a utilização de um análogo AdoMet com um grupo pequeno propargilico (três carbonos), onde o terminal de alcino tem duas funções: 1. Estabilização do estado de transição durante a transferência enzimática e 2. alça reativos para seguir modificações químicas por cobre- catalisada cicloadiï¿½o azida-alcino (CuAAC) clique química. Descobriu-se que o resultante propargílica AdoMet análogo 29 é bastante instável em condições neutras ou ligeiramente básicas e somente de uso limitado. Este inconveniente pode ser corrigido, substituindo o átomo de enxofre com selênio. O cof actor resultante 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-desoxiadenosina (SeAdoYn, Figura 3) é aceite pelo ADN de tipo selvagem, ARN e MTases proteína 30-32 que anula a necessidade de engenharia de proteínas, em muitos casos. Isto é exemplificado por fluorescência pró rotulagem tein com a lisina histona H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 33 (Figura 3, ver seção de protocolo 3: marcação de proteínas em dois passos via cofatores ativados duplas). <img alt="Figura 3" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig3highres.jpg" width="700"> Figura 3:. Específica da sequência de fluorescência de duas etapas rotulagem de histona H3 com SET7 / 9, SeAdoYn e TAMRA azida A proteína MTase SET7 / 9 naturalmente metila o grupo amino da lisina 4 em histona H3 (H3K4, verde) usando AdoMet. Com o co-fator duplo ativado SeAdoYn o MTase transfere um grupo propargilico pequeno (vermelho) ao resíduo de lisina. A ligação tripla terminal conectado é então modificada seletivamente em uma reação clique bioorthogonal (azida-alcino cicloadiï¿½o catalisada por cobre, CuAAC) com (tetramethylrhodamine, azul) fluorophore derivado-azida TAMRA.carga / 52014 / "target =" _ 52014fig3highres.jpg blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<table><tbody><tr><td>6BAz</td><td></td><td></td><td>Sintetizado de acordo com Weinhold et al., Patente número US 8.129.106, publicada em 6 de março de 2012.</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Serva</td><td>28625</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Scientific</td><td>10304980</td><td></td></tr> Solução de <tr><td>Acrilamida/Bis, 37,5:1</td><td>Serva</td><td>10688</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Serva</td><td>13375</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Gerbu</td><td>1304</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Gerbu</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol Na sal</td><td>Serva</td><td>15375</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10020090</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Serva</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico</td><td>Gerbu</td><td>1034</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>GelRed (10.000x em água)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (99.5%)</td><td>Gerbu</td><td>2006</td><td></td></tr><tr><td>FastRuler Low Range DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1103</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo de expressão obtido do Dr. Philipp Voigt e do Prof. Danny Reinberg; expressão e isolamento de acordo com T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.</td></tr><tr><td>M.BseCI</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo de expressão obtido do Dr. Michael Kokkinidis; expressão e isolamento de acordo com Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10675112</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio&nbsp; hexahidratado</td><td>J.T. Baker</td><td>4003</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Gerbu</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Gerbu</td><td>1112</td><td></td></tr><tr><td>tira de pH (Neutralit)</td><td>Merck</td><td>1,095,330,001</td><td></td></tr><tr><td>pBR322</td><td>Thermo Scientific</td><td>SD0041</td><td></td></tr><tr><td>R.TaqI (10 u/&micro; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>ER0671</td><td></td></tr><tr><td>SeAdoYn</td><td></td><td></td><td>Sintetizado de acordo com Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td></tr><tr><td>Set7/9</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo de expressão obtido do Prof. Danny Reinberg, expressão e isolamento de acordo com D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.</td></tr><tr><td>Estreptavidin</td><td>Gerbu</td><td>3058</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sódio</td><td>Sigma Life Science</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>SDS Granular</td><td>Gerbu</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico</td><td>Merck</td><td>106.586</td><td></td></tr><tr><td>TAMRA azida</td><td></td><td></td><td>Sintetizado de acordo com a referência 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td></tr><tr><td>Tampão TaqI (10x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>B28</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>Acros Organics</td><td>42058</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gerbu</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-X (TRIS-base)</td> <td>Gerbu</td><td>1018</td><td></td></tr><tr><td>Tris (3-hidroxipropiltriazolil-metil) amina (THPTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com metiltransferases e cofator analogues

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

-Adenosyl S-L-metionina (AdoMet ou SAM) metiltransferases dependentes de (MTAse) catalisam a transferência do grupo metilo de AdoMet activado a posições específicas no ADN, ARN, proteínas e pequenas biomoléculas. Esta reacção de metilação pode ser natural, expandida para uma grande variedade de reacções de alquilação usando análogos sintéticos de cofactor. A substituição do centro reactivo da AdoMet sulfónio com um anel aziridina leva à co-factores que podem ser acoplados com ADN por vários MTases ADN. Estes cofactores de aziridina pode ser equipado com grupos repórter em diferentes posições a porção de adenina e usado para S-specific equence M ethyltransferase- I nduced ing L abel de DNA (DNA de sorriso). Como um exemplo típico, damos um protocolo para a biotinilação de DNA de plasmídeo pBR322 na sequência 5&#39;-ATCG A T-3 &#39;com o ADN MTase M.BseCI e o cofactor aziridina em 6BAzum passo. Extensão do grupo metil ativado com insaturados grupos alquilo resulta em uma outra classe de análogos AdoMet que são utilizados para dirigida por ethyltransferase m T ransferência de A ctivated rupos G (mTAG). Uma vez que as cadeias laterais estendidas são activados pelo centro de sulfónio e a ligação insaturada, estes cofactores são chamados análogos AdoMet dupla activada. Estes análogos não só funcionam como co-factores para MTases ADN, como os cofactores de aziridina, mas também para ARN, proteínas e pequenas MTases molécula. Eles são tipicamente usados ​​para a modificação enzimática da MTAse substratos com grupos funcionais únicos que são marcados com grupos repórter num segundo passo químico. Isso é exemplificado em um protocolo para a rotulagem de fluorescência da proteína histona H3. Um pequeno grupo propargilo é transferido do SeAdoYn cofactor análogo à proteína pela lisina histona H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 seguido por clique rotulagem dohistona H3 alkynylated com TAMRA azida. Rotulagem MTase mediada com análogos cofactor é uma tecnologia capacitadora para muitas aplicações interessantes, incluindo a identificação e estudo funcional de substratos MTase bem como genotipagem de DNA e detecção de metilação.

Um passo-a Rotulagem de DNA via Aziridine Cofactores Esta reacção é levada a cabo exemplo com o ADN MTase M.BseCI, que modifica o resíduo de adenina segunda dentro do 5'-ATCG A T-3 'sequência de cadeia dupla e tem um local de reconhecimento no plasmídeo pBR322 (Figura 4A). Para testar rotulagem plasmídeo, pBR322 é desafiado com a endonuclease de restrição (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI tem sete sites na pBR322, um dos quais está incluído no si...

DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é rotular especificamente DNA e proteínas usando metil transferases, que transferem naturalmente o grupo metil ativado e o cofator Sile l metionina chamado aome para D-N-A-R-N-A. Proteínas ou pequenas biomoléculas. A marcação em uma etapa é alcançada substituindo o cofator natural omitido por cofatores sintéticos de aína que alteram o curso da reação, levando ao acoplamento enzimático de todo o cofator e, portanto, à marcação covalente da sequência do substrato A marcação específica do DNA induzida pela metil transferase é demonstrada com a DNA metil transferase específica da adina, M-B-S-E-C, que acopla o cofator Aine biotinilado seis BAZ à sequência de reconhecimento A-G-C-G-A-T levando à sequência, especificamente biotinilada, DNA metil transferase direcionada transferência de grupos ativados é o uso de proteína de marcação e é demonstrado usando MTAs conjunto sete nove, que transfere um grupo pro pargo de C oito oin para lisina quatro da histona H três.O resíduo de lisina alquilada é quimicamente marcado por um Fluor modificado azi usando química de clique catalisada por cobre, levando assim a uma proteína especificamente marcada. Uma vantagem do uso de metanfettransferases para rotulagem é que elas têm o potencial de atingir diretamente substratos nativos. Demonstrarei isso por meio da bioTE elação específica da sequência do plasmídeo, DNA Meth transferase, modificação catalisada de proteínas com o cofator análogo zina e permite a introdução de uma ampla variedade de grupos repórteres em duas etapas.Demonstrarei isso por marcação de fluorescência da proteína histona H três e mostrando resultados da marcação de H três com biotina. Além disso, os análogos de cofator duplamente ativados podem ser facilmente sintetizados carregando Sail, el homocisteína, o produto do cofator após a transferência do grupo metil com vários álcoois ativados. Os análogos de cofatores sintéticos são purificados por HPLC de fase reversa e, em alguns casos, é até possível separar o epi Marte em enxofre.O DNA sorridente é uma marcação de DNA induzida por metiltransferase específica da sequência. Aqui, o conceito é demonstrado marcando o DNA do plasmídeo PB 3 22 com seis cofatores BAZ Aine e a DNA metil transferase específica da adina. M-B-S-E-C um começa com hawing os seis BAZ a 20 graus Celsius.Uma vez pensado, repare a mistura de reação no gelo. Inclui um micrograma de plasmídeo, 60 micromolares de seis BAZ e 10 equivalentes de MBS Sequência de reconhecimento HER no DNA em tampão de modificação.Certifique-se de adicionar os seis BAZ e M-B-S-E-C um por último. Certifique-se de que não haja AME ligado à metanfetaminase que você está usando, pois o cofator natural bloqueará a rotulagem. React For controla.Substitua os MTAs por água para visualizar quaisquer modificações não específicas do cofator e adicione água em vez de cofator para testar o cofator natural no concentrado enzimático. Agora misture as reações suavemente com uma pipeta e incube-as a 55 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, repare uma mistura de endonuclease no gelo adicionando 10 microlitros de 10 x tacômetro recombinante, um tampão a 80 microlitros de água e, em seguida, adicionando 3,3 microlitros de recombinante tak uma endonuclease de restrição.Após a incubação, puxe as reações com um giro rápido e, em seguida, verifique a modificação do DNA em cada uma. Adicione dois microlitros de 10 x tak, um tampão e 28 microlitros da mistura de endonuclease. Misture as reações com pipetagem suave.Agora incube as reações a 65 graus Celsius por meia hora. Quando as reações estiverem completas, puxe a solução com um giro rápido e colete 25 microlitros das reações em novos tubos. A essas alíquotas, adicione 2,4 microlitros de TTR estreptocócico em tamponado a um milimolar por monômero de estrepto.Agora incube essa reação por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione cinco microlitros de seis x tampão de carregamento às reações concluídas e esgote 10 microlitros em um gel 1%agros a 80 volts por cerca de uma hora. Em seguida, visualize as bandas mt A é a abreviatura de transferência direcionada de metil transferase de grupos ativados.Nesta demonstração, a metil transferase definiu sete, nove e cofator C duplamente ativado oito. Oin são usados para rotular lisina quatro de sua histona H três. Depois de descongelar os componentes em misturas de reação de 20 microlitros de reparo de gelo, a solução de ensaio contém tampão de modificação 10 micromolar de histona H três e adicionado os últimos 10 micromolares de metil transferases mais 600 micromolares de cofator.Faça um controle enzimático substituindo o C oito ON por água deionizada. Faça também um controle de cofator para visualizar modificações inespecíficas, incluindo 60 milimolares de ADO encontrados para competir com os cofatores sintéticos. Agora misture as reações com a peste lenta do tubo e verifique seu pH com tiras de teste. Os análogos de cofator duplamente ativados são armazenados em condições C.Portanto, o pH de sua solução de reação pode mudar adicionando cofator, se necessário, em pequenas quantidades de hidróxido de sódio 50 milimolares para ajustar o pH. Agora incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas durante o reparo da incubação. Um gel de poliacrilamida 12% SDS pouco antes do término da incubação, faça 20 microlitros de cinco x mistura de clique contendo sulfato de cobre de três mili molares, três mili molares de ligante T-H-P-T-A de 250 milimolares, isca ACO de sódio e seis milimolares de azida de Tamara.No final da incubação, adicione cinco microlitros da mistura de clique a cada reação e misture as reações lentamente por carícia. Proteja as reações da luz usando papel alumínio e incube-as a 20 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, remova o excesso de clorofórmio precipitando as proteínas.Adicione 75 microlitros de metanol, 18,7 microlitros de clorofórmio e 50 microlitros de água a cada reação e vórtice-os brevemente após cada adição. Depois de preparar cada tubo, gire-os a 16.000 G por cinco minutos. Remova a fase superior da separação sem perturbar a camada de interface, que contém as proteínas.Agora adicione 56,3 microlitros de metanol, a fase inferior e o vórtice. Em seguida, gire isso para pellet a proteína e descarte o supinato. Em seguida, adicione 56,3 microlitros de metanol.Mais uma vez, vórtice. Repita a centrifugação e recupere os pellets. Deixe os pellets secarem em seus tubos, sem tampa e cobertos com papel sem fiapos.Posteriormente, dissolva as proteínas em 20 microlitros de tampão de carga SDS com corante de carga. Enxágue as paredes do tubo com o tampão para coletar o pellet. Em seguida, incube os tubos a 95 graus Celsius por 10 minutos.Uma vez que os tubos tenham atingido a temperatura ambiente, gaste-os brevemente para puxar seu conteúdo e visualizar as proteínas por página SDS. Execute a 120 volts por cerca de 90 minutos. A reação de sorriso foi realizada com a DNA metil transferase M-B-S-E-C uma, que modifica o segundo resíduo de adenina dentro da sequência A-T-C-G-A-T de fita dupla e tem um local de reconhecimento no plasmídeo PBR 3 2 2, que é marcado em vermelho para testar a marcação do plasmídeo.PB 3 2 2 foi desafiado com a restrição recombinante ENDONUCLEASE T um, que tem sete sítios em PB 3 22 marcados em verde, um dos quais está incluído no sítio M-B-S-E-C um. Quando ocorre a rotulagem, este local deve ser protegido contra clivagem no gel. Isso foi confirmado.Um novo fragmento com 683 pares de bases apareceu demonstrando que havia rotulagem no local M-B-S-E-C um. Isso é visto apenas na pista de ensaio, que é a pista três. A especificidade da reação de marcação foi demonstrada pelo deslocamento da eletromobilidade.Após a adição de strept adin, a eletromobilidade do fragmento de 683 pares de bases marcado com biotina foi retardada. Enquanto a mobilidade dos fragmentos sem o M-B-S-E-C um sítio permaneceu inalterada, ou uma marcação em duas etapas de substratos de metil transferase com oito análogos de oh met duplamente ativados. Foram utilizadas a histona H, três lisina, quatro metil transferase, conjunto sete nove e o cofator pequeno C oito ON.A eletroforese em gel foi utilizada para detecção de fluorescência apenas na pista de ensaio. A pista um mostrou uma banda fluorescente correspondente à histona H três, indicando que a cadeia lateral do cofator foi especificamente transferida e a proteína modificada foi marcada com a Tamara Flora.Quatro. A coloração ESI serve como um controle de carga.Todas as pistas mostraram a mesma quantidade de proteína. Os substratos da metiltransferase também podem ser marcados com reações de biotina com uma biotina derivada de azi. No lugar de um flúor foram testados por Western blotting com peroxidase de rábano.A rotulagem bem-sucedida e específica de Aden conjugada foi vista depois de assistir a este vídeo. Você deve ter um bom entendimento de como rotular DNA e sequência de proteínas, especificamente com texto de afinidade, força de flúor ou outros rótulos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que outros mets e seus análogos são sensíveis à temperatura.Sempre manuseie-os no gelo e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Eu sintetizei dupla ativação. Outros análogos do MET com o grupo de repórteres já incorporados à cadeia lateral e os usaram para rotular especificamente o DNA em uma única etapa.Estou especialmente entusiasmado com a perspectiva de combinar diferentes enzimas e grupos de relatórios para mapeamento de DNA usando técnicas de molécula única. Sorrir e NEC são muito flexíveis, e quase todos os grupos químicos podem ser transferidos não apenas para DNA e proteínas, mas também para RNA e pequenos usando transferências apropriadas de metanfetamina.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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