Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

O objetivo geral deste procedimento é identificar as proteínas de ligação de pequenas moléculas usando uma sonda de fotoafinidade, que pode se ligar ao seu alvo em células vivas, permitindo o subsequente isolamento e identificação do alvo. Este método pode ser usado para elucidar o mecanismo molecular de ação de drogas ou outras pequenas moléculas. A principal vantagem desta técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular nativo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação à lise celular.

Comece este procedimento, preparando placas estéreis de cultura de células de seis centímetros, para o número de amostras desejadas. Normalmente, um prato de células é usado por condição de tratamento. Três placas de células serão preparadas para esta demonstração, e o controle negativo apenas com DMSO, marcado como D, apenas tratamento de sonda, rotulado como P, e sonda mais concorrente, rotulado C.To cada placa de cultura, adicionará 3,5 milhões de células T HEK 293 em quatro mililitros de meio de cultura.

Incube as células durante a noite. Antes de tratar as células, pré-alíquota dos medicamentos necessários em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para o pré-tratamento do concorrente, adicione quatro microlitros de DMSO a cada um dos dois tubos e quatro microlitros de 10 milimolares concorrentes a um tubo.

Para o tratamento da sonda, adicione 16 microlitros de DMSO a um tubo e 16 microlitros de sonda de fotoafinidade de 15 micromolares a cada um dos dois tubos. Traga as placas de cultura de células para a coifa de cultura de células para a adição dos medicamentos pré-aliquotados. Aspire um mililitro de meio de cultura do prato de tratamento de competição, transfira-o para o tubo de microcentrífuga que contém o competidor pré-aliquotado e ressuspenda o medicamento no meio.

Adicione delicadamente o meio e a mistura de medicamentos gota a gota de volta ao prato. Da mesma forma, adicione DMSO ao prato de controle negativo e ao prato de sonda. Devolva os pratos à incubadora por 30 minutos.

Após 30 minutos, traga os pratos de volta para o exaustor e diminua as luzes. Adicione o DMSO pré-aliquotado ao prato de controle negativo e a sonda ao prato de sonda e competição. Devolva os pratos à incubadora por uma hora.

Após uma hora, coloque os pratos no gelo. Lave as células em cada prato suavemente com cinco mililitros de PBS gelado para remover o excesso de sonda. Cubra novamente as células com quatro mililitros de PBS gelado.

Coloque um prato de células, centralizado três centímetros sob a lâmpada UV em cima de uma bolsa de gelo, para minimizar o aquecimento da lâmpada, e irradie por três minutos. Retire o prato e coloque-o no gelo. Desta forma, irradie todas as amostras.

Após a irradiação de todas as amostras, aspire o PBS das células e adicione 200 microlitros de PBS gelado com inibidores de protease a cada prato. Separe as células do prato usando um raspador de borracha e transfira para tubos de microcentrífuga pré-rotulados no gelo. Adicione SDS a cada amostra até uma concentração final de 0,4% Lise as células sonicando a suspensão por 10 pulsos, incubando no gelo por um minuto e depois sonicando por mais 10 pulsos.

Ferva as amostras em um bloco de calor ajustado a 95 graus Celsius por cinco minutos para completar a lise celular e desnaturar todas as proteínas. Depois de medir a concentração de proteína em cada amostra, conforme descrito no protocolo de texto, normalize a concentração de proteína para 2,5 miligramas por mililitro, adicionando PBS PH 8,5 mais 0,4% SDS conforme necessário. Para iniciar este procedimento, transfira 40 microlitros de cada lisado celular, preparado no segmento anterior, para um novo tubo de microcentrífuga.

Adicione os seguintes reagentes nesta ordem, 0,2 microlitros de farinha-azida, 0,58 microlitros de TCEP e 3,38 microlitros de TBTA. Vórtice para misturar. Adicione 1,14 microlitros de sulfato de cobre pentahidratado para iniciar a reação.

Vortex brevemente e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Adicione 50 microlitros de tampão de amostra 2X SDS para extinguir a reação. Execute as amostras em um gel SDS-PAGE e, quando a frente do corante atingir o final do gel, continue executando o gel por mais cinco minutos para garantir que todo o excesso de farinha-azida não reagido tenha saído completamente do gel.

Depois de lavar todo o excesso de farinha-azida, coloque o gel em uma placa de vidro e escaneie o gel usando um scanner de gel fluorescente, de acordo com as instruções do fabricante. Para a fixação de uma etiqueta de biotina, use a quantidade máxima de lisados celulares após a normalização da proteína, de modo que todas as amostras tenham o mesmo volume. Pré-limpe os lisados adicionando cada amostra a um novo tubo, contendo 50 microlitros de grânulos de estreptavidina agarose de alta capacidade pré-lavados.

Incubar durante uma hora a quatro graus Celsius com rotação. Pellet as contas por centrifugação. Remova o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga no gelo e descarte as contas.

Por 500 microlitros de lisado, adicione os seguintes reagentes, 1,38 microlitros de biotina-azida, 5,5 microlitros de TCEP e 32,5 microlitros de TBTA. Vórtice para misturar. Adicione 11 microlitros de sulfato de cobre pentahidratado por 500 microlitros de lisado e vórtice brevemente.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione quatro volumes de amostra de acetona, resfriados a 20 graus Celsius, vortex as amostras e incube durante a noite a 80 graus Celsius, para precipitar completamente as proteínas e remover a biotina-azida não reagida. No dia seguinte, centrifugar as amostras a 17 000 x g durante 15 minutos a quatro graus Celsius para granular as proteínas precipitadas.

Aspire o sobrenadante completamente, adicione 150 microlitros de PBS PH 7,4 e 1% SDS a cada amostra e resoluabilize as proteínas por sonicação. Adicione 600 microlitros de PBS a cada amostra, para diluir a concentração de SDS para 0,2% e, em seguida, adicione a amostra a um novo tubo contendo 30 microlitros de grânulos de estreptavidina agarose de alta capacidade pré-lavados. Incubar durante uma hora a quatro graus Celsius com rotação.

Após uma hora, esfolar os grânulos por centrifugação a 1000 x g por três minutos. Aspirar e descartar o sobrenadante, contendo proteínas não ligadas. Adicione um mililitro de tampão de lavagem às contas e incube por cinco minutos em temperatura ambiente com rotação.

Centrifugue, descarte o sobrenadante e lave novamente com tampão de lavagem. Após a lavagem final, aspire completamente o tampão de lavagem dos grânulos e adicione 30 microlitros de tampão de amostra 2X SDS. Incube por cinco minutos em um bloco de calor a 95 graus Celsius, para liberar as proteínas das contas.

Centrifugue os grânulos a 13000 x g à temperatura ambiente por um minuto. Pipete cuidadosamente o tampão de amostra, contendo proteínas dos grânulos, para SDS-PAGE. A visualização das proteínas após a marcação com a etiqueta fluorescente é ilustrada por este gel fluorescente.

A principal banda de proteína de ligação específica, em aproximadamente 35 kilodaltons, está presente apenas na pista da sonda e é competida pelo excesso de composto original. A mesma banda de 35 kilodalton foi visualizada por coloração de prata após a retirada da biotina e, posteriormente, identificada por espectrometria de massa como a proteína de membrana VDAC1. A identidade da proteína foi posteriormente validada, usando um anticorpo específico para VDAC1.

O sinal está presente na pista de sonda e diminuiu na pista de competição. Incluir a fração de entrada garante que o anticorpo funcione e a proteína de interesse possa ser detectada no lisado. O ligeiro aumento no peso molecular das amostras pulldown é devido à sonda acoplada ao covelante.

As consequências de não executar certas etapas do protocolo corretamente são ilustradas. A remoção incompleta do excesso de farinha-azida resulta em grandes manchas pretas na parte inferior do gel fluorescente, enquanto a pré-limpeza insuficiente dos lisados e/ou lavagem dos grânulos resulta em um gel manchado de prata com coloração de fundo muito alta. Do início ao fim, o experimento de pulldown leva de dois a três dias para ser concluído.

Depois que a proteína-alvo foi isolada e identificada por espectrometria de massa ou western blotting, outros experimentos de validação específicos do alvo devem ser realizados para avaliar a relevância do alvo para o fenótipo induzido por drogas.