Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

O objetivo geral deste procedimento é identificar as proteínas que se ligam a moléculas pequenas utilizando uma sonda de fotoafinidade, que pode ligar-se ao seu alvo em células vivas, permitindo o subsequente isolamento e identificação do alvo. Este método pode ser usado para elucidar o mecanismo molecular de ação de fármacos ou outras moléculas pequenas. A principal vantagem desta técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem no ambiente celular nativo, eliminando o risco de perturbar a estrutura nativa das proteínas e as condições de ligação durante a lise celular.

Inicie este procedimento preparando placas estéreis de cultura celular de seis centímetros, na quantidade necessária para as amostras desejadas. Normalmente, utiliza-se uma placa de células por condição de tratamento. Para esta demonstração, serão preparadas três placas de células: uma com controle negativo contendo apenas DMSO, rotulada D; tratamento apenas com sonda, rotulada P; e sonda mais competidor, rotulada C. Adicione a cada placa de cultura 3,5 milhões de células HEK 293 T em quatro mililitros de meio de cultura.

Incube as células durante a noite. Antes de tratar as células, pré-alíquota os fármacos necessários em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para o pré-tratamento com competidor, adicione quatro microlitros de DMSO a cada um de dois tubos e quatro microlitros de competidor 10 milimolar a um tubo.

Para o tratamento com a sonda, adicione 16 microlitros de DMSO a um tubo e 16 microlitros da sonda de afinidade fotoligante 15 micromolar a cada um dos dois tubos. Leve as placas de cultura celular para a cabine de cultura celular para a adição das drogas pré-aliquotadas. Aspire um mililitro do meio de cultura da placa do tratamento de competição, transfira-o para o tubo de microcentrífuga que contém o competidor pré-aliquotado e ressuspenda a droga no meio.

Adicione cuidadosamente a mistura de meio e fármaco gota a gota de volta ao recipiente. Da mesma forma, adicione DMSO ao recipiente do controle negativo e ao recipiente do grupo experimental. Retorne os recipientes ao incubador por 30 minutos.

Após 30 minutos, leve as placas de volta para a capela de cultura e atenuar as luzes. Adicione o DMSO pré-aliquotado à placa de controle negativo e o marcador às placas de marcador e competição. Retorne as placas ao incubador por uma hora.

Após uma hora, coloque as placas sobre gelo. Lave as células em cada placa suavemente com cinco mililitros de PBS gelado para remover o excesso de sonda. Recubra novamente as células com quatro mililitros de PBS gelado.

Coloque uma placa com células, centralizada a três centímetros abaixo da lâmpada UV sobre uma bolsa de gelo, para minimizar o aquecimento provocado pela lâmpada, e irradie por três minutos. Remova a placa e coloque-a sobre gelo. Dessa maneira, irradie todas as amostras.

Após a irradiação de todas as amostras, aspire o PBS das células e adicione 200 microlitros de PBS gelado com inibidores de protease a cada placa. Desprenda as células da placa utilizando uma espátula de borracha e transfira para tubos de microcentrífuga previamente rotulados sobre gelo. Adicione SDS a cada amostra até uma concentração final de 0,4%. Lise as células por sonicação da suspensão por 10 pulsos, incubação em gelo por um minuto e, em seguida, sonicação por mais 10 pulsos.

Ferva as amostras em um bloco térmico ajustado a 95 graus Celsius por cinco minutos para completar a lise celular e desnaturar todas as proteínas. Após medir a concentração de proteína em cada amostra, conforme descrito no protocolo textual, normalize a concentração de proteína para 2,5 miligramas por mililitro, adicionando PBS pH 8,5 mais 0,4% SDS conforme necessário. Para iniciar este procedimento, transfira 40 microlitros de cada lisado celular, preparado no segmento anterior, para um novo tubo de microcentrífuga.

Adicione os seguintes reagentes nesta ordem: 0,2 microlitros de flour-azida, 0,58 microlitros de TCEP e 3,38 microlitros de TBTA. Agite em vórtex para homogeneizar. Adicione 1,14 microlitros de sulfato de cobre penta-hidratado para iniciar a reação.

Vortex brevemente e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Adicione 50 microlitros de tampão amostra 2X SDS para interromper a reação. Carregue as amostras em um gel de SDS-PAGE e, quando a frente do corante atingir o final do gel, continue a eletroforese por mais cinco minutos para garantir que todo o azida fluorescente em excesso e não reagida tenha saído completamente do gel.

Após remover todo o excesso de azida fluorescente, coloque o gel sobre uma placa de vidro e escaneie o gel utilizando um escâner de gel fluorescente, de acordo com as instruções do fabricante. Para a ligação de uma marcação com biotina, utilize a quantidade máxima de lisados celulares após a normalização das proteínas, de modo que todas as amostras tenham o mesmo volume. Pré-limpe os lisados adicionando cada amostra a um novo tubo contendo 50 microlitros de perlas de agarose estreptavidina de alta capacidade previamente lavadas.

Incube por uma hora a quatro graus Celsius com rotação. Peliculize as microesferas por centrifugação. Remova o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga em gelo e descarte as microesferas.

Para cada 500 microlitros de lisado, adicione os seguintes reagentes: 1,38 microlitro de azida de biotina, 5,5 microlitros de TCEP e 32,5 microlitros de TBTA. Agite em vórtex para homogeneizar. Adicione 11 microlitros de sulfato de cobre penta-hidratado por 500 microlitros de lisado e agite brevemente em vórtex.

Incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione quatro volumes de amostra de acetona resfriada a 20 graus Celsius, vortexe as amostras e incube durante a noite a 80 graus Celsius para precipitar completamente as proteínas e remover o biotina-azida não reagido. No dia seguinte, centrifugue as amostras a 17.000 × g por 15 minutos a quatro graus Celsius para formar o pellet das proteínas precipitadas.

Aspire completamente o sobrenatante, adicione 150 microlitros de PBS pH 7,4 e 1% de SDS a cada amostra e ressuspender as proteínas por sonicação. Adicione 600 microlitros de PBS a cada amostra para diluir a concentração de SDS a 0,2%, em seguida, adicione a amostra a um novo tubo contendo 30 microlitros de esferas de agarose estreptavidina de alta capacidade pré-lavadas. Incube por uma hora a quatro graus Celsius com rotação.

Após uma hora, pelotize as microesferas por centrifugação a 1000 x g durante três minutos. Aspire e descarte o sobrenadante, contendo proteínas não ligadas. Adicione um mililitro de tampão de lavagem às microesferas e incube por cinco minutos à temperatura ambiente com rotação.

Centrifugue, descarte o sobrenatante e lave novamente com o tampão de lavagem. Após a lavagem final, aspire completamente o tampão de lavagem das esferas e adicione 30 microlitros de tampão amostral SDS 2X. Incube por cinco minutos em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius para liberar as proteínas das esferas.

Centrifugue as esferas a 13000 x g em temperatura ambiente por um minuto. Remova cuidadosamente com pipeta o tampão da amostra, contendo as proteínas, das esferas, para eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A visualização das proteínas após marcação com a etiqueta fluorescente é ilustrada por este gel escaneado com fluorescência.

A principal banda da proteína de ligação específica, com aproximadamente 35 quilodaltons, está presente apenas na pista da sonda e é competida por excesso do composto original. A mesma banda de 35 quilodaltons foi visualizada por coloração com prata após o ensaio de precipitação com biotina e posteriormente identificada por espectrometria de massas como a proteína de membrana VDAC1. A identidade da proteína foi ainda validada utilizando um anticorpo específico para VDAC1.

O sinal está presente na pista da sonda e reduzido na pista de competição. A inclusão da fração de entrada garante que o anticorpo funcione e que a proteína de interesse possa ser detectada no lisado. O ligeiro aumento no peso molecular das amostras de pulldown deve-se à sonda ligada covalentemente.

As consequências de não realizar corretamente certas etapas do protocolo são ilustradas. A remoção incompleta do excesso de flour-azida resulta em manchas pretas grandes na base do gel fluorescente escaneado, enquanto a pré-limpeza insuficiente dos lisados e/ou a lavagem inadequada das perlas resulta em um gel corado com nitrato de prata com coloração de fundo muito alta. Do início ao fim, o experimento de precipitação leva de dois a três dias para ser concluído.

Após a proteína-alvo ter sido isolada e identificada por espectrometria de massa ou por western blot, devem ser realizados experimentos adicionais de validação específicos para o alvo, a fim de avaliar a relevância deste alvo para o fenótipo induzido pelo fármaco.