Name: Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a identificar proteínas de ligação de pequenas moléculas em células HEK 293 T usando marcação por fotoafinidade. Esta técnica preserva o ambiente celular nativo e permite elucidar mecanismos de ação de fármacos com alta confiabilidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Dr. Ben Nacev pelos conselhos sobre o design do protocolo de marcação de fotoafinidade, ao Dr. Wei Shi por sintetizar a sonda de fotoafinidade itraconazol, ao Dr. Yongjun Dang pelos conselhos sobre experimentos de pull-down de afinidade e a outros membros do laboratório JOL pelos comentários úteis e apoio. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa da Fundação PhRMA em Farmacologia / Toxicologia (para SAH); Subsídio do Instituto Nacional do Câncer R01CA184103; o Instituto de Pesquisa Médica de Comissários de Bordo; Fundação do Câncer de Próstata (GOL); e o Instituto Johns Hopkins de Pesquisa Clínica e Translacional, que é financiado em parte pelo Grant UL1 TR 001079 do Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais (NCATS).

NOTA: Este protocolo foi adaptado do MacKinnon e Taunton 10 para utilização em células vivas. 1. Preparação de células cultivadas <ol><li> Prepare estéreis 6 cm placas de cultura de células para o número de amostras desejado (ver abaixo). NOTA: Uma placa de células é utilizado por condição de tratamento, mas se for necessária mais proteínas 2 ou 3 pratos podem ser preparados por condição e combinadas depois da irradiação UV. <ol><li> Preparar pelo menos 3 pratos de células; controle negativo com apenas DMSO (D), o tratamento Probe única (P), e sonda + concorrente (C). </li><li> Opcionalmente, preparar um prato 4 th como um controlo sem UV, a serem tratados com a sonda, mas não sujeita a luz UV. NOTA: Se várias moléculas concorrentes estão a ser testada, tais como diferentes análogos da pequena molécula de interesse, preparar as placas concorrente adicionais conforme necessário. </li></ol></li><li> Adicionar células HEK293T para placas de cultura em 4 media ml de cultura. Use 3,5 milhões de cells por placa. NOTA: O número de células deve ser determinado para cada tipo de célula de modo a que as células são quase 100% confluentes no início da experiência, de modo a atingir o rendimento máximo de proteína. Para HUVEC, use 0,3 milhões de células por placa. Uma boa aproximação é de 10/01 as células confluentes em um prato de 15 centímetros. células HEK293T devem ser cultivadas em Dulbecco Modified Eagles Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina. </li><li> Devolver as células na incubadora de cultura (37 ° C, 5% CO 2) durante a noite. </li></ol> 2. Tratamento de células e fotorreticulação <ol><li> No dia seguinte, pré-aliquota os seguintes medicamentos em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga: <ol><li> Para o primeiro tratamento, adicionar 4 mL de DMSO para 2 tubos e 4 ul de 10 mM de concorrente (isto é, o composto parental não modificada) para um tubo. </li><li> Para o segundo tratamento, adicionar 16 ul de DMSO para um tubo e 16 ul de 50 &amp;# 181; M sonda de fotoafinidade a 2 tubos. NOTA: A concentração óptima pode ser diferente para sondas diferentes (ver discussão), mas entre 200-500 nm é um bom ponto de partida (aqui nós usamos 200 nM). A concentração do competidor deve ultrapassar o da sonda, pelo menos, 20 vezes (aqui usamos 10 uM). A concentração final de DMSO deve ser igual em todas as placas e não deve ser superior a 0,5% (volume de 20 ul). </li></ol></li><li> Trazer as placas celulares na capa de cultura de células e adicionar as drogas pré-alíquotas do passo 2.1.1 do seguinte modo: Aspirar 1 ml de meio de cultura, ressuspensão a droga pré-alíquota na mídia, e adicionando-o suavemente de volta para a queda de placa sensato. Adicione o DMSO à (D) Placa de DMSO e a sonda (P) placa, e adicionar o concorrente para a competição (C) placa. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 30 min. </li><li> Com luzes na capa de cultura esmaecido, adicione a sonda pré-alíquota do passo 2.1.2 para sondar (P) e as placas de concorrência (C) e adicione oDMSO para a placa de DMSO (D), como acima. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 1 h. </li><li> Durante a incubação, preparar os seguintes itens; Uma bandeja de gelo que pode caber todas as chapas; tampão de lise arrefecido com gelo (PBS [pH 8,5] + 1x cocktail inibidor de protease [completo isento de EDTA, diluída a partir da solução estoque 50x feita em água]; 200? l / placa); tubos de microcentrífuga rotulado D, P ou C para cada uma das diferentes condições de tratamento, em gelo. </li><li> 15 min antes do final da incubação de 1 hora, configurar a lâmpada UV (365 nm) na sala fria e ligá-lo para aquecer a lâmpada. </li><li> Após 1 horas de incubação com a sonda, coloque pratos no gelo. Lavam-se as células cuidadosamente com 5 ml de PBS arrefecido com gelo (pH 7,4) para remover o excesso de sonda. Re-cobrir as células com 4 PBS ml gelada. </li><li> Colocar a placa de células centradas 3 cm abaixo da lâmpada de UV no topo de um bloco de gelo para minimizar o aquecimento da lâmpada. Irradiar durante 3 min. Remover o prato para a bandeja de gelo e repetir para todas as amostras. </li><li> UMAepois irradiação, aspirar o PBS a partir das células e adicionar 200 ul do PBS gelado (pH 8,5) com inibidores de protease para cada placa. Separe as células da placa com um raspador de borracha e transferência para os tubos de microcentrífuga pré-marcado em gelo. </li><li> Adicionar SDS para uma concentração final de 0,4% (10 ul de SDS a 10% em 250 ul de amostra). CUIDADO: SDS pó é perigosa. Evitar a inalação de pó SDS, vestindo uma máscara sobre o nariz ea boca. </li><li> Lisar as células por sonicação da suspensão para 10 impulsos de saída (1, ciclo de trabalho de 30%) e incubar em gelo durante 1 min antes de um segundo turno de 10 pulsos. </li><li> Se necessário, retire 2 ul de suspensão e verificar sob um microscópio de luz para assegurar a lise celular completa. </li><li> Ferver as amostras sobre uma placa quente a 95 ° C durante 5 minutos para completar a lise das células e desnatura todas as proteínas. </li><li> Medir a concentração de proteína em cada amostra utilizando um ensaio de proteína compatíveis com detergentes espectrofotométrica, tais como thDc e ensaio de proteína de 19, de acordo com as instruções do fabricante, com um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 750 nm. </li><li> Normalizar a concentração de proteína de 2,5 mg / ml (ou se as concentrações são mais baixos do que 2,5 mg / ml, normalizar para a amostra com a concentração de proteína mais baixa) por adição de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS, conforme necessário (por exemplo, se as amostras são 5 mg / ml em 250 ul, adicionar 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS para se obter uma concentração final de 2,5 mg / ml). </li></ol> 3. Fixação de Tag fluorescente por Click Química para a visualização de proteínas marcadas <ol><li> Remover 40 pi de lisado celular e transferência para um novo tubo de microcentrifugação. Manter os lisados ​​restantes para a reacção com biotina-azida (passo 4). </li><li> Adicionar os seguintes reagentes em ordem: 0,2 ul fluor-azida (solução de reserva 1 mM em DMSO), 0,58 mL TCEP (estoque 100 mM em água com 4 equivalentes NaOH adicionado, elaborada fresco), e 3,38 TBTA ul (1.estoque 7 mM em uma proporção de 4: 1 de t-butanol a DMSO). Vortex para misturar. </li><li> Adicionar 1,14 ul de CuSO 4 -5H 2 O (50 mM em água) para iniciar a reacção. Vortex brevemente e incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de amostra 2x SDS para extinguir a reacção. Neste ponto, executar as amostras directamente sobre um gel de SDS-PAGE 20 para obter os melhores resultados, ou armazenar a -20 ° C durante a noite se necessário. </li><li> Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes do carregamento para o gel. Observação: Uma vez que o peso molecular da proteína alvo tipicamente não é conhecida nesta fase, é aconselhável para executar 2 géis com diferentes concentrações de acrilamida (isto é, 8% e 15%), ou um gel de gradiente molecular gama de peso de largura (isto é, 4-15%), para assegurar a cobertura completa do peso molecular. </li><li> Quando a frente do corante atingiu a extremidade do gel, continuar a executar o gel durante mais 5 minutos para garantir que todo o excesso de unreacted fluor-azida saiu completamente o gel. </li><li> Remover o gel para um recipiente com ddH2O e incubar durante 10 min com agitação suave, para lavar o excesso de fluor-azida. </li><li> Colocar o gel para uma placa de vidro e digitalização do gel utilizando um scanner de gel Typhoon fluorescente de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 4. Fixação de Biotina Tag por Click Química por afinidade Purificação de proteínas marcadas <ol><li> Dos lisados ​​restantes do passo 3.1, utilizar a quantidade máxima após a normalização da proteína de tal modo que todas as amostras são o mesmo volume (por exemplo, se após a normalização para 2,5 mg / mL os volumes de amostra resultantes são 500, 550, e 600 ul, utilizar 500 ul de cada). </li><li> Pré-limpar os lisados ​​pela adição de 50 ul de alta capacidade grânulos de agarose estreptavidina, 2x pré-lavada com PBS (pH 7,4). Incubar 1 h a 4 ° C com rotação. </li><li> Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Retirar tele sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação em gelo e descartar os grânulos. </li><li> Remover 1-2% da amostra de DMSO para um novo tubo marcado &quot;entrada&quot;. Adicionar um volume equivalente de 2x tampão de amostra SDS e armazenar a -20 ° C. </li><li> Por 500 mL de lisado, adicione os seguintes reagentes: 1,38 mL biotina-azida (estoque 10 mM em DMSO), 5,5 ul TCEP, e 32,5 ul TBTA. Vortex para misturar. </li><li> Adicionar 11 ul CuSO 4 5H 2 O por 500 mL de lisado e vortex brevemente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionar 4 volumes de amostra de acetona arrefecida a -20 ° C. Agitar as amostras e incubar durante a noite a -80 ° C para precipitar as proteínas e completamente remover a biotina que não reagiu-azida. </li><li> Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as proteínas precipitadas. </li><li> Aspirar o sobrenadante completamente, e ressolubilizar as proteínas por sonicação em 150 ul de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS. </li><li&gt; Adicionar 600 ul de PBS (pH 7,4) para diluir a concentração de SDS a 0,2%. </li><li> Adicionar as amostras de 30 ul de pré-lavado com estreptavidina de alta capacidade esferas de agarose e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação. </li><li> Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante contendo proteínas não ligadas e descarte. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de lavagem (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, SDS a 0,2%, pH 7,4) às pérolas e incubar 5 minutos à temperatura ambiente com rotação. </li><li> Repita os passos de 4.12 e 4.13 3 vezes. </li><li> Aspirar o tampão de lavagem completamente a partir dos grânulos, e adicionar 30 ul de tampão de amostra 2x SDS. </li><li> Incubar durante 5 min num bloco de calor a 95 ° C para libertar as proteínas a partir das esferas. </li><li> Centrifugar os grânulos durante 1 min a 13.000 x g à temperatura ambiente. NOTA: neste momento, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para ser executado por SDS-PAGE. Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes da utilização. </li><li> Cuidadosamentepipetar o tampão de amostra contendo proteínas fora dos grânulos, e carregar em SDS-PAGE 20 (ver considerações importantes abaixo). Os grânulos podem ser guardadas para fervura do mais tarde, se necessário. NOTA: Para a detecção de proteínas por coloração com prata, melhores resultados são obtidos usando um gel espesso de 1 mm. Se uma banda está a ser cortada para fora do gel corado com prata para análise de espectrometria de massa (MS), preparar todos os reagentes frescos a partir de soluções estéreis e deixar um poço vazio entre amostras no gel. Para cada faixa de corte da pista sonda, uma fatia paralelamente devem ser tomadas a partir da pista de DMSO de modo que as proteínas do fundo podem ser subtraídos. Para a validação de identificação de proteínas por transferência de western, é também crítico para carregar a amostra de entrada a partir do passo 4.4 durante a execução do gel de SDS-PAGE. </li><li> Seguir um protocolo padrão para qualquer coloração com prata ou Western blot, 21, 22 para detectar a proteína (s) alvo. </li></ol>

<ol><li>Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Cook, D., Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+a+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Titov, D. V., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+protein+targets+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules.</a> Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Sumranjit, J., Chung, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Target+Characterization+and+Identification+by+Photoaffinity+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes.</a> Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).</li>
<li>Robles, O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-+and+site-selective+derivatizations+of+natural+products+enabling+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies.</a> Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).</li>
<li>Zhou, Q., Gui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+Native+Chemical+Tagging+of+C-H+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds.</a> J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).</li>
<li>Li, Z., Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Synthesis+of+Minimalist+Terminal+Alkyne-Containing+Diazirine+Photo-Crosslinkers+and+Their+Incorporation+into+Kinase+Inhibitors+for+Cell-+and+Tissue-Based+Proteome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling.</a> Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).</li>
<li>Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazo+reagents+with+small+steric+footprints+for+simultaneous+arming%2FSAR+studies+of+alcohol-containing+natural+products+via+O-H+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem+biol%22%5BJournal%5D)">Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion.</a> ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).</li>
<li>Mackinnon, A. L., Taunton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Identification+by+Diazirine+Photo-Cross-linking+and+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).</li>
<li>Smith, E., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+in+target-+and+binding-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Future+med+chem%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification.</a> Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).</li>
<li>Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.3-Dipolare+Cycloadditionen%2C+XXXII.+Kinetik+der+Additionen+organischer+Azide+an+CC-Mehrfachbindungen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ber%22%5BJournal%5D)">1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen.</a> Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+Solid+Phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-Triazoles+by+Regiospecific+Copper%28I%29-Catalyzed+1%2C3-Dipolar+Cycloadditions+of+Terminal+Alkynes+to+Azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Head, S. A., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+itraconazole+targets+VDAC1+to+modulate+the+AMPK%2FmTOR+signaling+axis+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itraconazole+Side+Chain+Analogues%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies+for+Inhibition+of+Endothelial+Cell+Proliferation%2C+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor+2+%28VEGFR2%29+Glycosylation%2C+and+Hedgehog+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling.</a> J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Absolute+Stereochemistry+on+the+Antiangiogenic+and+Antifungal+Activities+of+Itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Diferentes abordagens para identificar os alvos de pequenas moléculas podem ser agrupadas em duas categorias: de cima para baixo, onde o fenótipo celular da droga é usada para diminuir seus alvos potenciais com base em suas funções conhecidas, ou bottom-up, onde o alvo é identificada directamente por meios químicos ou genéticos 3. De cima para baixo ou estudos fenotípicos podem identificar certos processos celulares afectados pela droga (por exemplo, a transcrição / tradução / síntese do ADN, bloquei...

pequenas moléculas bioactivas fundamentalmente trabalhar por interagir com e alterar a função de uma ou mais moléculas de &quot;alvo&quot;, mais comumente proteínas, na célula. Na descoberta de medicamentos, quando um composto activo é descoberto por meio de triagem fenotípica, a identificação do alvo molecular (s) de que o composto é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de acção e os potenciais efeitos colaterais do composto, mas também para potencialmente descobrir nova biologia subjacente ao modelo de doença e preparando o caminho para o desenvolvimento de novas classes mecanicistas de terapêutica 1. Embora a identificação do alvo não é necessária para um medicamento para ser usado terapeuticamente, nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento de que os novos candidatos a fármacos são mais propensos a ter sucesso em ensaios clínicos, e, portanto, produzir melhores retornos sobre o investimento, se um alvo validado é conhecida 2. Assim, tem havido um crescente interesse em métodos para a identificação de pequenasproteínas alvo molécula. Um experimento identificação do alvo clássica tipicamente depende de purificação por afinidade, em que a pequena molécula de interesse é imobilizada sobre uma resina e incubada com lisados ​​de células inteiras, após o que as proteínas não ligadas são lavadas e as proteínas restantes são eluídas e identificados 3. Embora esta técnica tenha sido utilizada para identificar os alvos de muitas moléculas pequenas 4, não é adequado como um método de identificação de destino universal para várias razões. Em primeiro lugar, a proteína alvo deve manter a sua conformação nativa após a lise celular, a fim de manter a sua capacidade de se ligar à molécula pequena. Isto pode ser particularmente problemático para proteínas de membrana, o que muitas vezes sofrem alterações conformacionais depois de ser removido do seu ambiente nativo, ou simplesmente agregado e precipitar para fora da solução. Em segundo lugar, a pequena molécula deve ser quimicamente modificado de tal forma que ele pode ser imobilizada na resina enquanto se mantéma sua capacidade de se ligar a proteína alvo. bolsas de ligação profundas podem, por conseguinte, tornam-se inacessíveis a uma molécula pequena, uma vez que é fixado à resina. Em terceiro lugar, a afinidade de ligação deve ser suficientemente elevada para que a interacção é mantido durante os passos de lavagem, tornando a identificação de interacções de afinidade inferiores desafiantes. Em quarto lugar, as condições ambientais tais como pH, concentração iónica ou a presença de outras moléculas endógenas pode variar espacialmente dentro da célula e são, por vezes, os pré-requisitos para a interacções fármaco-alvo. Assim, encontrar as condições correctas para permitir e manter do lado de fora da célula de ligação pode necessitar de uma quantidade significativa de tentativa e erro. a marcação por fotoafinidade evita estes problemas, permitindo a ligação de uma pequena molécula e o seu alvo no contexto nativo de uma célula covalente. Em vez de imobilizar a molécula pequena a uma grande resina volumosa, em vez da molécula é quimicamente modificados para instalar duas pequenas g funcionalrupos: uma porção fotoactivável que permite a reticulação covalente à proteína alvo quando irradiado com um comprimento de onda particular de luz, e um grupo repórter que permite que a proteína alvo a ser detectada e subsequentemente isolado. As células vivas são tratados com a sonda de fotoafinidade, a sonda liga-se e reticula covalentemente à proteína alvo, e o complexo sonda-proteína é em seguida isolada intacta. A especificidade de ligação ao alvo da sonda é demonstrada através da realização de uma experiência de competição em paralelo, em que um excesso do composto de origem é usada para competir distância de ligação da sonda para a proteína alvo. O design e síntese de sondas de fotoafinidade varia muito de uma pequena molécula para outra, e não será coberto neste protocolo; no entanto, vários excelentes discussões sobre o assunto foram publicados 5-9. A consideração principal é que a sonda retém a bioactividade do composto-mãe, por conseguinte presumabLY de ligação para o mesmo alvo (s). relação estrutura-actividade (SAR) estudos devem ser realizados para determinar que partes da molécula podem ser modificados sem perda de bioactividade. Uma variedade de diferentes grupos químicos têm sido utilizados como agentes de ligação cruzada foto-activáveis, incluindo diazirina, benzofenona, e azida de arilo, que cada um tem vantagens e desvantagens 10. Da mesma forma, existem várias marcações repórter que foram utilizadas para isolar proteínas de ligação à sonda. Os grupos repórter podem ser funcionais por si sós, tais como a biotina utilizada ou etiquetas fluorescentes, ou podem ser precursores que requerem maior funcionalização subsequente ao passo de foto-reticulação, que tem a vantagem de ser mais pequeno e, assim, menos susceptíveis de comprometer bioactividade 11. Neste protocolo, utilizou-se uma sonda de fotoafinidade contendo um grupo diazirina fotorreticulação, e um alcino terminal para a ligação de um grupo descritor através de um Cu (I) -catalyzed Azide-Alcino Sharpless-Huisgen cicloadição (ou clique) reacção de 12-15. Os estudos de SAR, sondar concepção e síntese, e os resultados destes estudos foram publicados em outros lugares 16-18.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Faça um dia fresco de uso. Preparar o stock de 100 mM em água com 4 eq NaOH.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil] amina (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>Prepare estoque de 1,7 mM em uma proporção de 4:1 de t-butanol para DMSO, armazene a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Sulfato de Cobre (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>Prepare o estoque de 50 mM em água e armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Ferramentas de Química de Biotina-azida</td><td>Click</td><td>AZ104-100</td><td>Prepare estoque de 10 mM em DMSO, armazene a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azida&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>Prepare 1 mM de estoque em DMSO, armazene a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Lâmpada UV de 365 nm</td> Os óculos de bloqueio UV <td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>devem ser usados durante a operação.</td></tr><tr><td>Comprimidos inibidores de protease, sem EDTA</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Prepare a solução 50x em água e armazene a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonifier Sonicator</td><td>Branson</td><td>250</td><td>Definido para saída 1, duty 30%.&nbsp;</td></tr><tr><td>Scanner de gel fluorescente</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Use laser vermelho para detectar Alexa-fluor 647.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Dc compatível com detergente</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Estreptavidina Agarose de Alta Capacidade&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Médio, baixo teor de glicose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualificado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SDS Sample Buffer (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade labeling

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificar o(s) alvo(s) molecular(is) de pequenas moléculas é um passo desafiador, mas necessário, para entender seu mecanismo de ação. Embora vários métodos de identificação de alvos tenham sido desenvolvidos e usados para elucidar com sucesso as proteínas de ligação de uma variedade de pequenas moléculas, essas técnicas têm desvantagens que as tornam inadequadas para detectar certos tipos de interações pequenas molécula-alvo. Em particular, as interações não covalentes que dependem de condições celulares nativas, como as de proteínas de membrana cujas estruturas podem ser perturbadas na lise celular, muitas vezes não são passíveis de métodos de identificação de alvos baseados em afinidade. Aqui, demonstramos um método em que uma sonda contendo um grupo fotolábil é usada para reticulação covalente com a proteína de ligação a pequenas moléculas dentro do ambiente da célula viva, permitindo a detecção e isolamento da proteína alvo sem a necessidade de manutenção da interação após a lise celular. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para estudar pequenas moléculas biologicamente interessantes com mecanismos desconhecidos, tanto no contexto da biologia básica quanto na descoberta de medicamentos.

Os resultados aqui apresentados foram obtidos com uma sonda de foto-afinidade do itraconazol droga antifúngica, cuja utilização tem sido publicado anteriormente 16. Estes resultados demonstram a utilização da técnica de marcação por fotoafinidade-de células vivas para identificar com sucesso uma grande proteína de ligação de itraconazol como a de 35 kDa de proteína de membrana de tensão dependente de aniões Canal 1 (VDAC1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar as proteínas que se ligam a moléculas pequenas utilizando uma sonda de fotoafinidade, que pode ligar-se ao seu alvo em células vivas, permitindo o subsequente isolamento e identificação do alvo. Este método pode ser usado para elucidar o mecanismo molecular de ação de fármacos ou outras moléculas pequenas. A principal vantagem desta técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem no ambiente celular nativo, eliminando o risco de perturbar a estrutura nativa das proteínas e as condições de ligação durante a lise celular.Inicie este procedimento preparando placas estéreis de cultura celular de seis centímetros, na quantidade necessária para as amostras desejadas. Normalmente, utiliza-se uma placa de células por condição de tratamento. Para esta demonstração, serão preparadas três placas de células: uma com controle negativo contendo apenas DMSO, rotulada D; tratamento apenas com sonda, rotulada P; e sonda mais competidor, rotulada C. Adicione a cada placa de cultura 3,5 milhões de células HEK 293 T em quatro mililitros de meio de cultura.Incube as células durante a noite. Antes de tratar as células, pré-alíquota os fármacos necessários em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para o pré-tratamento com competidor, adicione quatro microlitros de DMSO a cada um de dois tubos e quatro microlitros de competidor 10 milimolar a um tubo.Para o tratamento com a sonda, adicione 16 microlitros de DMSO a um tubo e 16 microlitros da sonda de afinidade fotoligante 15 micromolar a cada um dos dois tubos. Leve as placas de cultura celular para a cabine de cultura celular para a adição das drogas pré-aliquotadas. Aspire um mililitro do meio de cultura da placa do tratamento de competição, transfira-o para o tubo de microcentrífuga que contém o competidor pré-aliquotado e ressuspenda a droga no meio.Adicione cuidadosamente a mistura de meio e fármaco gota a gota de volta ao recipiente. Da mesma forma, adicione DMSO ao recipiente do controle negativo e ao recipiente do grupo experimental. Retorne os recipientes ao incubador por 30 minutos.Após 30 minutos, leve as placas de volta para a capela de cultura e atenuar as luzes. Adicione o DMSO pré-aliquotado à placa de controle negativo e o marcador às placas de marcador e competição. Retorne as placas ao incubador por uma hora.Após uma hora, coloque as placas sobre gelo. Lave as células em cada placa suavemente com cinco mililitros de PBS gelado para remover o excesso de sonda. Recubra novamente as células com quatro mililitros de PBS gelado.Coloque uma placa com células, centralizada a três centímetros abaixo da lâmpada UV sobre uma bolsa de gelo, para minimizar o aquecimento provocado pela lâmpada, e irradie por três minutos. Remova a placa e coloque-a sobre gelo. Dessa maneira, irradie todas as amostras.Após a irradiação de todas as amostras, aspire o PBS das células e adicione 200 microlitros de PBS gelado com inibidores de protease a cada placa. Desprenda as células da placa utilizando uma espátula de borracha e transfira para tubos de microcentrífuga previamente rotulados sobre gelo. Adicione SDS a cada amostra até uma concentração final de 0,4%. Lise as células por sonicação da suspensão por 10 pulsos, incubação em gelo por um minuto e, em seguida, sonicação por mais 10 pulsos.Ferva as amostras em um bloco térmico ajustado a 95 graus Celsius por cinco minutos para completar a lise celular e desnaturar todas as proteínas. Após medir a concentração de proteína em cada amostra, conforme descrito no protocolo textual, normalize a concentração de proteína para 2,5 miligramas por mililitro, adicionando PBS pH 8,5 mais 0,4% SDS conforme necessário. Para iniciar este procedimento, transfira 40 microlitros de cada lisado celular, preparado no segmento anterior, para um novo tubo de microcentrífuga.Adicione os seguintes reagentes nesta ordem: 0,2 microlitros de flour-azida, 0,58 microlitros de TCEP e 3,38 microlitros de TBTA. Agite em vórtex para homogeneizar. Adicione 1,14 microlitros de sulfato de cobre penta-hidratado para iniciar a reação.Vortex brevemente e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Adicione 50 microlitros de tampão amostra 2X SDS para interromper a reação. Carregue as amostras em um gel de SDS-PAGE e, quando a frente do corante atingir o final do gel, continue a eletroforese por mais cinco minutos para garantir que todo o azida fluorescente em excesso e não reagida tenha saído completamente do gel.Após remover todo o excesso de azida fluorescente, coloque o gel sobre uma placa de vidro e escaneie o gel utilizando um escâner de gel fluorescente, de acordo com as instruções do fabricante. Para a ligação de uma marcação com biotina, utilize a quantidade máxima de lisados celulares após a normalização das proteínas, de modo que todas as amostras tenham o mesmo volume. Pré-limpe os lisados adicionando cada amostra a um novo tubo contendo 50 microlitros de perlas de agarose estreptavidina de alta capacidade previamente lavadas.Incube por uma hora a quatro graus Celsius com rotação. Peliculize as microesferas por centrifugação. Remova o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga em gelo e descarte as microesferas.Para cada 500 microlitros de lisado, adicione os seguintes reagentes: 1,38 microlitro de azida de biotina, 5,5 microlitros de TCEP e 32,5 microlitros de TBTA. Agite em vórtex para homogeneizar. Adicione 11 microlitros de sulfato de cobre penta-hidratado por 500 microlitros de lisado e agite brevemente em vórtex.Incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione quatro volumes de amostra de acetona resfriada a 20 graus Celsius, vortexe as amostras e incube durante a noite a 80 graus Celsius para precipitar completamente as proteínas e remover o biotina-azida não reagido. No dia seguinte, centrifugue as amostras a 17.000 × g por 15 minutos a quatro graus Celsius para formar o pellet das proteínas precipitadas.Aspire completamente o sobrenatante, adicione 150 microlitros de PBS pH 7,4 e 1% de SDS a cada amostra e ressuspender as proteínas por sonicação. Adicione 600 microlitros de PBS a cada amostra para diluir a concentração de SDS a 0,2%, em seguida, adicione a amostra a um novo tubo contendo 30 microlitros de esferas de agarose estreptavidina de alta capacidade pré-lavadas. Incube por uma hora a quatro graus Celsius com rotação.Após uma hora, pelotize as microesferas por centrifugação a 1000 x g durante três minutos. Aspire e descarte o sobrenadante, contendo proteínas não ligadas. Adicione um mililitro de tampão de lavagem às microesferas e incube por cinco minutos à temperatura ambiente com rotação.Centrifugue, descarte o sobrenatante e lave novamente com o tamp&atilde;o de lavagem. Ap&oacute;s a lavagem final, aspire completamente o tamp&atilde;o de lavagem das esferas e adicione 30 microlitros de tamp&atilde;o amostral SDS 2X. Incube por cinco minutos em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius para liberar as prote&iacute;nas das esferas.Centrifugue as esferas a 13000 x g em temperatura ambiente por um minuto. Remova cuidadosamente com pipeta o tampão da amostra, contendo as proteínas, das esferas, para eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A visualização das proteínas após marcação com a etiqueta fluorescente é ilustrada por este gel escaneado com fluorescência.A principal banda da proteína de ligação específica, com aproximadamente 35 quilodaltons, está presente apenas na pista da sonda e é competida por excesso do composto original. A mesma banda de 35 quilodaltons foi visualizada por coloração com prata após o ensaio de precipitação com biotina e posteriormente identificada por espectrometria de massas como a proteína de membrana VDAC1. A identidade da proteína foi ainda validada utilizando um anticorpo específico para VDAC1.O sinal está presente na pista da sonda e reduzido na pista de competição. A inclusão da fração de entrada garante que o anticorpo funcione e que a proteína de interesse possa ser detectada no lisado. O ligeiro aumento no peso molecular das amostras de pulldown deve-se à sonda ligada covalentemente.As consequências de não realizar corretamente certas etapas do protocolo são ilustradas. A remoção incompleta do excesso de flour-azida resulta em manchas pretas grandes na base do gel fluorescente escaneado, enquanto a pré-limpeza insuficiente dos lisados e/ou a lavagem inadequada das perlas resulta em um gel corado com nitrato de prata com coloração de fundo muito alta. Do início ao fim, o experimento de precipitação leva de dois a três dias para ser concluído.Após a proteína-alvo ter sido isolada e identificada por espectrometria de massa ou por western blot, devem ser realizados experimentos adicionais de validação específicos para o alvo, a fim de avaliar a relevância deste alvo para o fenótipo induzido pelo fármaco.

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

Uma nova técnica para a detecção de receptores endógenos de baixa abundância presentes em embriões de peixe-zebra é descrita. Nós o chamamos de AFLIP porque consiste na marcação de afinidade do receptor por seu ligante ligado à imunoprecipitação.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para dividir-BioID, um ensaio de fragmentos-complementação de proteínas com base na técnica de criação de etiquetas de proximidade BioID. Ativado na interação das duas proteínas determinadas, permite a análise proteômica de contexto-dependente da proteína em seu ambiente nativo do celular. O método é simples e econômica e só requer equipamentos de laboratório padrão.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Este protocolo descreve a marcação de anticorpo único (SAL) para resolver a organização espacial em nanoescala das proteínas da membrana plasmática. Ao aproveitar as interações cumulativas anticorpo-epítopo no nível de molécula única, o SAL de membrana (mSAL) mapeia distribuições locais de epítopos enquanto captura simultaneamente o comportamento de ligação de anticorpos no ambiente celular nativo.

Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

Aprenda a identificar proteínas de ligação de pequenas moléculas em células HEK 293 T usando marcação por fotoafinidade. Esta técnica preserva o ambiente celular nativo e permite elucidar mecanismos de ação de fármacos com alta confiabilidade.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Explorar mais vídeos