Name: Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a usar o minigene E1A2 para avaliar alterações globais de emenda de mRNA em células HEK 293. Este método rápido e econômico permite estudar a função de proteínas na regulação da emenda alternativa após tratamento quimioterápico.

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Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do Grant Temático 2017/03489-1 ao JK e à bolsa da FLB 2018/05350-3) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) para financiar essa pesquisa. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Adrian Krainer por fornecer o plasmídeo pMTE1A e Zerler e colegas por seu trabalho na clonagem E1A. Agradecemos também ao Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti e Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller para permitir que usem seu espaço de laboratório e equipamentos.

1. Células de chapeamento
NOTA: Neste protocolo descrito, foram utilizadas linhas de células estáveis HEK293, anteriormente geradas para expressão indutível estável de Nek421, porém, o mesmo protocolo é adequado para muitas outras linhas celulares, tais como HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. O padrão de expressão dos isoformes minigene E1A em condições basais varia entre essas células e deve ser caracterizado para cada condição. Este protocolo não se limita a linhas de células estáveis. A abordagem mais comum na avaliação da proteína candidata é pela co-transfecção transitória de aumentar sua quantidade com quantidade fixa do minigene. O mesmo protocolo é adequado para células eliminatórias.
<ol><li>Células de placa considerando controles de veículos, não transtraídos e GFP.</li>
	<li>Cultura HEK293 células com expressão estável do gene de interesse no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 4,5 g/L de glicose, 4 mM L-Glutamina e manter com 100 μg/mL de higimicincina B, em placas tratadas com cultura tecidual a 37 °C em 5% DE CO2 e atmosfera umidificada.</li>
	<li>Células divididas usando 0,25% de trippsina-EDTA. Placa 3 x 105 células em placas de 6 poços e incuba-las por 24 h a 37 °C em 5% DE CO2. NOTA: Para a transfecção, as células devem ser 70-80% confluentes para diminuir a morte celular após a transfecção.</li>
</ol>2. Transfecção celular
NOTA: 1-2 μg de pMTE1A minigene plasmid foi usado aqui, porém a quantidade de DNA, bem como o tempo de expressão, deve ser mantida no mínimo para evitar a toxicidade. Por exemplo, alta toxicidade foi observada em células HeLa após 30h de transfecção com 1 μg de DNA pMTE1A. Para a transfecção aqui descrita, foi usado um reagente de transfecção à base de lipídio
<ol><li>Verifique a confluência celular 24 h após o revestimento e transfecte células estáveis HEK293 somente quando 70-80% confluentes.</li>
	<li>Remova o meio de cultura celular cuidadosamente com uma pipeta, em vez de usar um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione cuidadosamente 2 mL de meio DMEM completo sem antibióticos e coloque a placa de volta na incubadora.</li>
	<li>Prepare um tubo com o tampão de transfecção (200 μL/well), adicione 2 μg de DNA pMTE1A, vórtice e adicione 2 μL de reagente de transfecção. Vórtice novamente e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire as placas da incubadora e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção dropwise.</li>
	<li>Às células estáveis HEK293, adicione tetraciclina (0,5 μg/mL) para indução de expressão de Nek4 6 h após a transfecção. Mudanças médias não são necessárias. NOTA: Os volumes/quantidades descritos nesta seção são para um bem. Prepare a mistura para todos os poços utilizados no experimento no mesmo tubo.</li>
	<li>Prepare um poço para transfectar com eGFP, ou outro fluorforeiro expressando plasmídeo para estimar a eficiência de transfecção. Melhores resultados podem ser observados com eficiência de transfecção de pelo menos 40%, mas foram observados bons desempenhos com menor eficiência de transfecção.</li>
	<li>Ao usar a co-transfecção (proteína de interesse e minigene) mantenha um poço com células não transfectadas para evitar obter resultados de mRNA endógeno. No caso do E1A, as células HEK293 já expressam o gene E1A30.</li>
</ol>3. Preparando as drogas
NOTA: O tempo e a concentração do tratamento foram escolhidos com base nos resultados da literatura, que apontam mudanças no splicing alternativo para alguns genes.
<ol><li>Realize uma curva dose-resposta antes de iniciar o ensaio para determinar a concentração mínima para indução alternativa de emenda sem efeito na viabilidade celular.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque paclitaxel a 5 mM de concentração de etanol. A concentração final é de 1 μM. Mantenha-se a -20 °C. Use 0,02% de etanol como controle de veículos.</li>
	<li>Prepare uma solução de cisplatina diluindo em 0,9% NaCl em torno de 0,5 mg/mL (1,66 mM). Proteja contra luz, vórtice e incubar em um banho térmico, 37 °C por 30 min. A concentração final é de 30 μM. Prepare fresco ou armazene a 2-10 °C por até um mês. NOTA: Todas as drogas devem ser protegidas da luz.</li>
</ol>4. Tratamento e coleta celular
NOTA: As células estáveis HEK293 foram coletadas 48 h após a transfecção e para isso foram tratadas 24h após a transfecção porque o maior nível de expressão nek4 é alcançado dentro de 48 h. No entanto, foram observados níveis elevados de expressão isoforme 13S (até 90%) neste momento. Para diminuir a proporção de isoforme 13S, tente tratar e coletar células 30 h após o máximo de transfecção.
<ol><li>Use dicas e tubos gratuitos RNA/DNase. Realize a extração total de RNA com reagente fenol-clorofórmio seguindo a recomendação do fabricante.</li>
	<li>24 h após a transfecção, verifique a morfologia celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio fluorescente.</li>
	<li>Remova o meio de cultura celular, usando preferencialmente uma pipeta em vez de um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione o meio de cultura celular com a quimioterápico na concentração final descrita anteriormente.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% de CO2 para 18 - 24 h.</li>
	<li>Colete RNA descartando o meio de cultura celular em um recipiente e adicionando 0,5 - 1 mL de reagente de extração de RNA diretamente ao poço. Se os poços forem muito confluentes, use 1 mL de reagente de extração de RNA para melhorar a qualidade do RNA.</li>
	<li>Homogeneize-se com a pipeta e transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado armazenando amostras a -80 °C ou prosseguir imediatamente para a extração de RNA. ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA à base de fenol é tóxico e todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de fumaça química e os resíduos descartados corretamente.</li>
</ol>5. Extração de RNA e síntese de CDNA
<ol><li>Em um capô de fumaça descongele as amostras e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 0,1 -0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente.</li>
	<li>Incubar por 3 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min a 12.000 x g e 4 °C.</li>
	<li>Colete a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Coletar cerca de 60% do volume total; no entanto, não coletar o DNA ou a fase orgânica (inferior).</li>
	<li>Adicione 0,25 - 0,5 mL de isopropanol e agitar pela inversão 4 vezes. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min, a 4 °C e descartar o supernaspe.</li>
	<li>Lave a pelota de RNA duas vezes com etanol (75% em água tratada com dietilpirato (DEPC). Centrifugar a 7.500 x g por 5 min e descartar o etanol.</li>
	<li>Remova o excesso de etanol invertendo o tubo em um papel toalha e deixe o tubo aberto dentro de um capô de fumaça para secar parcialmente a pelota por 5 - 10 min.</li>
	<li>Resuspend a pelota de RNA em 15 μL de água tratada com DEPC.</li>
	<li>Quantifique o RNA total usando absorvância em 230 nm, 260 nm e 280 nm para verificar a qualidade do RNA.</li>
	<li>Para verificar a qualidade total do RNA, execute um gel de 1% de agarose pré-tratado com 1,2% (v/v) de uma solução de hipoclorito de sódio de 2,5% por 30 min31.</li>
	<li>Realize a síntese de CDNA usando 1-2 μg de RNA total.<ol>
<li>Pipeta RNA, 1 μL de oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) e compõem o volume a 12 μL com água livre de nuclease. Incubar no termociclador por 5 min a 65 °C.</li>
		<li>Remova amostras do termocicl para esfriar e prepare a mistura de reação: 4 μL de tampão de transcriptase reversa, 2 μL de dithiothreitol (DTT) e 1 μL de inibidor de ribonuclease. Incubar a 37 °C por 2 min.</li>
		<li>Adicione 1 μL de transcriptase reversa termoestabilidade. Incubar a 37 °C por 50 min e inativar a enzima a 70 °C por 15 min. NOTA: O cDNA pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas. Realize um controle de transcriptase não reversa (NRT) para contaminação genômica por discriminação de eventos putativos de retenção de intron.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. pMTE1A minigene PCR
<ol><li>Execute o PCR com a composição de reação (1,5 mM de MgCl2, 0,3 mM de mix dNTP, 0,5 μM de cada primer, 2,5 U de uma polimerase Taq de partida quente e 150 ng de cDNA) com as seguintes condições: 94 °C por 2 min, 29 ciclos de: 94 °C para 1 min, 50 °C para 2 min, 72 °C para 2 min, 72 °C para 10 min.</li>
	<li>Carregar 20-25 μL do produto PCR em um gel de 3% de agarose contendo mancha de ácido nucleico e funcionar a 100 V por aproximadamente 1 h.</li>
</ol>7. Análise do gel utilizando um software de processamento e análise de imagem32
<ol><li>Após a execução, fotografe o gel (usando um sistema de aquisição de imagens de gel) evitando qualquer saturação de banda e quantifique as bandas usando um software de processamento de imagem.</li>
	<li>Para quantificação considere as bandas em ~631 bp, ~493 bp, e ~156 bp para corresponder aos isoforms 13S, 12S e 9S, respectivamente.</li>
	<li>No menu Arquivo do software, abra o arquivo de imagem obtido do sistema de aquisição de imagens. Converta-se em escala de cinza, ajuste o brilho e o contraste e remova o ruído mais estranho, se necessário.</li>
	<li>Desenhe um retângulo ao redor da primeira faixa com a ferramenta Seleção de Retângulo e selecione-o através da | Géis | Selecione o comando First Lane ou pressionando o atalho do teclado para ele.</li>
	<li>Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na primeira pista e arrastá-lo para a próxima pista. Vá para Analisar | Géis | Selecione Next Laneou pressione o atalho disponível. Repita este passo para todas as faixas restantes.</li>
	<li>Depois de todas as faixas serem destacadas e numeradas, vá para Analisar | Géis | Plot Lanes para desenhar um enredo de perfil de cada pista.</li>
	<li>Com a ferramenta de seleção de linha reta, desenhe uma linha através da base de cada pico correspondente a cada banda, deixando de fora o ruído de fundo. Depois de todos os picos, de todas as pistas, foi fechado, selecione a ferramenta Varinha e clique dentro de cada pico. Para cada pico que destacou, as medidas devem aparecer na janela Resultados que aparece.</li>
	<li>Soma a intensidade de todas as 3 bandas para cada amostra e calcule a porcentagem de cada isoforme em relação ao total.</li>
	<li>Plote as porcentagens de cada isoforme ou as diferenças na porcentagem em relação às amostras não tratadas. NOTA: Certifique-se de que a soma das três variantes E1A deve ser igual a 100%.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Minigenes são ferramentas importantes para determinar os efeitos no splicing alternativo global in vivo. O minigene adenoviral E1A tem sido usado com sucesso há décadas para avaliar o papel das proteínas, aumentando a quantidade delas na célula13,14. Aqui, propomos o uso de minigene E1A para avaliar emendas alternativas após exposição quimioterápica. Uma linha de célula estável expressando isoforme Nek4 1 foi usada, evitando os artefatos de superexpressão causado...

O splicing está entre os passos mais importantes no processamento de mRNA eucariótico que ocorre simultaneamente ao capping de 5'mRNA e à poliadenilação de 3'mRNA, compreendendo a remoção de intron seguido de junção exon. O reconhecimento dos locais de emenda (SS) pelo emendatório, um complexo ribonucleoproteíno contendo pequenas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 e U6), pequenas RNAs (snRNAs) e várias proteínas regulatórias1 é necessário para emendas.
Além da remoção intron (emendas constitutivas), em eucariotes, os introns podem ser retidos e os exons podem ser excluídos, configurando o processo chamado emenda alternativa mRNA (AS). A emenda pré-mRNA alternativa expande a capacidade de codificação de genomas eucarióticos permitindo a produção de um grande e diversificado número de proteínas de um número relativamente pequeno de genes. Estima-se que 95-100% dos mRNAs humanos que contêm mais de um exon podem passar por emendas alternativas2,3. Isso é fundamental para processos biológicos como desenvolvimento neuronal, ativação da apoptose e resposta ao estresse celular4,fornecendo ao organismo alternativas para regular o funcionamento celular usando o mesmo repertório de genes.
O maquinário necessário para emendas alternativas é o mesmo utilizado para emendas constitutivas e o uso da SS é o principal determinante para a ocorrência alternativa de emendas. O splicing constitutivo está relacionado ao uso de locais de emenda forte, que geralmente são mais semelhantes aos motivos de consenso para o reconhecimento deemendas 5.
Exons alternativos são tipicamente reconhecidos de forma menos eficiente do que os exons constitutivos uma vez que seus elementos cis-regulatórios,as sequências em 5'SS e 3'SS flanqueando esses exons, mostram uma capacidade de ligação inferior ao emendatório. O mRNA também contém regiões denominadas enhancers ou silenciadores localizados em exons (aprimoramentos de emendas exônicas (ESEs) e silenciadores de emenda exônica (ESSs)) e introns (aprimoramentos de emendas intrônicas (ISEs) e silenciadores de emenda intrônica (ISSs)) que melhoram ou reprimem o uso de exon,respectivamente 5. Essas sequências são reconhecidas por elementos trans-regulatórios, ou fatores de emenda (SF). As SFs são representadas principalmente por duas famílias de proteínas, os fatores de emenda rico em serina/arginina (SRSFs) que se ligam aos ESEs e à família de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNPs) que se ligam às sequências de ESSs5.
O splicing alternativo pode ser modulado por fosforilação/desfosforilação de trans-fatores que modificam os parceiros de interações e localização celular dos fatores de emenda6,7,8. Identificar novos reguladores de fatores de emenda podem fornecer novas ferramentas para regular o splicing e, consequentemente, alguns tratamentos contra o câncer.
Anufrieva et al.9, em um perfil de expressão genética de microarray mRNA, observaram mudanças consistentes nos níveis de componentes spliceossômicos em 101 linhas celulares e após diferentes condições de estresse (drogas à base de platina, irradiação gama, inibidores de topoisomerase, inibidores de quinase tyrosina e impostos). A relação entre padrão de emenda e eficácia da quimioterapia já foi demonstrada em células cancerígenas de pulmão, que são resistentes à quimioterapia, mostrando alterações na taxa de variantes caspase-910. As células HEK293 tratadas com o painel de quimioterapia mostram mudanças no splicing com um aumento nas variantes pró-apoptóticas. Gabriel et al.11 observaram alterações em pelo menos 700 eventos de emenda após o tratamento de cisplatina em diferentes linhas celulares, apontando que as vias de emenda são afetadas pela cisplatina. Moduladores de emenda já demonstraram atividade anti-tumoral, mostrando que o splicing é importante para o desenvolvimento tumoral e, principalmente, a resposta à quimioterapia12. Por isso, caracterizar novas proteínas que regulam o splicing após agentes estressores celulares, como a quimioterapia, é muito importante para descobrir novas estratégias de tratamento.
As pistas de regulação alternativa de emendas a partir de estudos interactome, particularmente importantes para caracterizar funções de proteínas novas ou não caracterizadas, podem exigir uma abordagem mais geral e simples para verificar o real papel da proteína em AS. Minigenes são ferramentas importantes para a análise do papel geral de uma proteína que afeta a regulação do splicing. Eles contêm segmentos de um gene de interesse contendo regiões genômicas emendadas e flanqueadas13. O uso de uma ferramenta minigene permite a análise do splicing in vivo com diversas vantagens, como o comprimento do minigene que é menor e, portanto, não é uma limitação à reação de amplificação; o mesmo minigene pode ser avaliado em diferentes linhas celulares; todos os componentes celulares, principalmente sua regulação da modificação pós-translacional (fosforilação e alterações nos compartimentos celulares) estão presentes e podem ser abordados13,14. Além disso, mudanças no padrão alternativo de emenda podem ser observadas após o estresse celular e, o uso de um sistema minigene, permitem identificar a via que está sendo modulada por diferentes estímulos.
Existem vários sistemas de minigene já descritos que são específicos para diferentes tipos de eventos de emenda13,14, no entanto, como um ensaio preliminar, o minigene E1A15 é um sistema de repórteres alternativo muito bem estabelecido para o estudo da seleção de 5 SS in vivo. De apenas um gene, E1A, cinco mRNAs são produzidos por emenda alternativa com base na seleção de três diferentes locais de emenda de 5′ e de um local de emenda maior ou um menor de 3′16,17,18. A expressão das variantes E1A muda de acordo com o período de infecção adenoviral19,20.
Já mostramos anteriormente que tanto os isoformes nek4 interagem com fatores de emenda como SRSF1 e hnRNPA1 e, embora a isoforme 2 mude o emendamento alternativo minigene E1A, o isoforme 1 não tem efeito nesse21. Como o isoforme 1 é a isóforme mais abundante e altera a resistência à quimioterapia e a resposta a danos no DNA, avaliamos se ele poderia mudar a emenda alternativa minigene E1A em uma condição de estresse.
O ensaio minigene é um método simples, de baixo custo e rápido, uma vez que só precisa de extração de RNA, síntese de CDNA, amplificação e análises de gel de agarose, e pode ser uma ferramenta útil para avaliar, uma vez que um possível efeito sobre a emenda alternativa por uma proteína de interesses até o efeito de diferentes tratamentos no padrão de emenda alternativa celular.

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 placa de poços</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC água</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de imagem em gel - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td> Células estáveis <td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Gerado a partir do Flp-In&trade; T-REx&trade; 293 - Invitrogen e descrito na ref 21</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Usado para manutenção de células Flp-In</td></tr><tr><td>Software de processamento e análise de imagem - software</td><td></td><td></td> FIJI <td>ref. 32</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção à base de lipídios - jetOPTIMUS Polyplus Reagente</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de Placas Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>/ Absorvância UV</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek/ Adaptador Take3</td></tr><tr><td>plasmid</td><td></td><td></td> pMTE1A <td>Fornecido pelo Dr. Adrian Krainer</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase reversa - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase reversa - Superscript IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ribunuclease RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Reagente à base de fenol-clorofórmio de extração de RNA - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Usado para Flag empty ou Nek4- Indução de expressão de bandeira</td></tr><tr><td>Thermocycler Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

usando a ferramenta e1a minigene para estudar alterações de emenda mrna

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

O processamento de mRNA envolve múltiplas etapas simultâneas para preparar o mRNA para tradução, como 5'capping, adição poli-A e emenda. Além do emendamento constitutivo, o emendamento alternativo de mRNA permite a expressão de proteínas multifuncionais de um gene. Como os estudos interactome são geralmente a primeira análise para proteínas novas ou desconhecidas, a associação da proteína isca com fatores de emenda é uma indicação de que ela pode participar do processo de emenda mRNA, mas determinar em que contexto ou quais genes são regulados é um processo empírico. Um bom ponto de partida para avaliar esta função é usar a ferramenta minigene clássica. Aqui apresentamos o uso de minigene Adenoviral E1A para avaliar as mudanças alternativas de emenda após diferentes estímulos de estresse celular. Avaliamos o splicing de minigene E1A em HEK293 exprimidamente superexpressando proteína Nek4 após diferentes tratamentos de estresse. O protocolo inclui transfecção de minigene E1A, tratamento celular, extração de RNA e síntese de CDNA, seguido de análise de PCR e gel e quantificação das variantes emendadas E1A. O uso deste método simples e bem estabelecido combinado com tratamentos específicos é um ponto de partida confiável para lançar luz sobre processos celulares ou quais genes podem ser regulados por emendas mRNA.

Um ensaio de 5' locais de emenda utilizando minigene E1A foi realizado para avaliar mudanças no perfil de emenda nas células após a exposição da quimioterapia. O papel de Nek4 - isoform 1 na regulação AS em células estáveis HEK293 após o tratamento paclitaxel ou cisplatina foi avaliado.
A região Adenoviral E1A é responsável pela produção de três mRNAs principais de um precursor de RNA devido ao uso de diferentes doadores de emen...

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer orientação detalhada para usar o minigene E1A2 para avaliar as mudanças globais de emenda mRNA. Trata-se de uma ferramenta rápida, barata e simples para avaliar a função da proteína-alvo na regulação alternativa de emendas sem a necessidade de regimes especiais ou condições laboratoriais. Comece por estacionar células HEK 293 com expressão estável do gene de interesse.Divida as células usando 0,25% de trippsina EDTA, depois a placa 300.000 células por poço em placas de seis poços e incuba-as por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, verifique a confluência e transfete as células estáveis HEK 293 somente quando 70 a 80% confluentes. Remova cuidadosamente o meio de cultura celular com uma pipeta, em seguida, adicione dois mililitros de meio DMEM completo sem antibióticos e coloque a placa de volta na incubadora.Prepare um tubo com o tampão de transfecção, em seguida, adicione dois microgramas de DNA pMTE1A, vórtice, e adicione dois microliters de reagente de transfecção. Vórtice novamente e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Retire as placas da incubadora e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção em termos de gota.Seis horas após a transfecção, adicione tetraciclina às células estáveis HEK 293 para indução de expressão nek4. 24 horas após a transfecção, verifique a morfologia celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio fluorescente. Use uma pipeta para remover o meio de cultura celular e adicione meio de cultura celular com a quimioterápico.Incubar as células por mais 24 horas. Para coletar RNA, descarte o meio de cultura celular e adicione 0,5 a 1 mililitro de reagente de extração de RNA diretamente ao poço. Se os poços forem muito confluentes, use um mililitro de reagente de extração de RNA para melhorar a qualidade do RNA.Homogeneize as células com uma pipeta e transfira-as para um tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Prossiga imediatamente para a extração de RNA, ou armazene as amostras a menos 80 graus Celsius. Descongele as amostras em um capô de fumaça e incuba por cinco minutos em temperatura ambiente.Adicione 0,1 a 0,2 mililitros de clorofórmio e se agitar vigorosamente, depois incubar por três minutos em temperatura ambiente. Centrífuga por 15 minutos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius, depois colete a fase aquosa superior e transfira-a para um novo tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Coletar cerca de 60% do volume total, mas não coletar o DNA ou a fase orgânica.Adicione 0,25 a 0,5 mililitros de isopropanol e agitar a amostra por inversão quatro vezes. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, depois centrífuga a 12.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe. Lave a pelota de RNA duas vezes com etanol, e centrífuga a 7.500 vezes G por cinco minutos, depois descarte o etanol.Remova o excesso de etanol invertendo o tubo em uma toalha de papel, depois deixe o tubo aberto dentro de um capô de fumaça para secar parcialmente a pelota por cinco a 10 minutos. Suspenda a pelota de RNA em 15 microliters de água tratada com DEPC. Quantifique o RNA total e verifique a qualidade do RNA medindo a absorvância em 230, 260 e 280 nanômetros.Para verificar a qualidade total do RNA, execute um gel de 1%agarose pré-tratado com 1,2% de uma solução de hipoclorito de sódio de 2,5% por 30 minutos. Realize a síntese de CDNA usando um a dois microgramas de RNA total. Combine RNA, um microliter de oligo d-T, um microliter de DNTP, e água sem nuclease a 12 microlitadores.Incubar a reação no Thermo Cycler por cinco minutos a 65 graus Celsius. Remova amostras do Thermo Cycler e adicione quatro microliters de buffer de transcriptase reversa, dois microliters de DTT e um microliter do inibidor de ribonuclease. Incubar a 37 graus Celsius por dois minutos.Adicione um microliter de transcriptase reversa termo-estável e incubar a 37 graus Celsius por 50 minutos. Inativar a enzima a 70 graus Celsius por 15 minutos. Realize o PCR como descrito no manuscrito do texto, em seguida, carregar 20 a 25 microliters do produto PCR em um gel de 3%agarose contendo mancha de ácido nucleico, e executado a 100 volts por aproximadamente uma hora.Fotografe o gel, evitando qualquer saturação de banda, e quantifique as bandas usando um software de processamento de imagem. As bandas com 631, 493 e 156 pares de base correspondem aos isoforms 13S, 12S e 9S, respectivamente. No menu Arquivo do software, abra o arquivo de imagem e converta-o em escala cinza.Ajuste o brilho e o contraste e remova o ruído mais estranho, se necessário. Desenhe um retângulo ao redor da primeira faixa com a ferramenta de seleção de retângulos e selecione-o através do comando Analisar, Gels e Selecionar Primeira Faixa, ou usando o atalho do teclado. Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na primeira pista e arrastá-lo para a próxima pista.Vá para Analisar, Gels e Selecionar Próxima Pista. Repita esta etapa para todas as faixas restantes. Depois de todas as faixas serem destacadas e numeradas, vá até Analyze, Gels e Plot Lanes para desenhar um enredo de perfil de cada pista.Use a ferramenta de seleção em linha reta para desenhar uma linha através da base de cada pico, correspondendo a cada banda, deixando de fora o ruído de fundo. Depois de todos os picos de cada pista terem sido fechados, selecione a ferramenta varinha e clique dentro de cada pico. As medições devem aparecer na janela de resultados para cada pico destacado.Considere apenas os picos de 13S, 12S e 9S correspondentes a 631, 493 e 156 bandas de pares de base. Copie dados de intensidade para um editor de planilhas e ressira a intensidade das três bandas para cada amostra e, em seguida, calcule a porcentagem de cada isoforme em relação ao total. Plote as porcentagens de cada isoforme ou as diferenças na porcentagem em relação às amostras não tratadas.Utilizou-se um plasmid contendo o minigene de E1A para observar o efeito sobre o splicing alternativo, avaliando a proporção de mRNA de cada isoforme produzido. A expressão basal das variantes isoformas E1A dependia da linha celular e do tempo de expressão E1A. A linha de células estáveis HEK 293, ou HEK 293 recombinase contendo o local, mostrou uma expressão mais elevada de 13S em comparação com as células HeLa, mas mostrou níveis semelhantes de isoformes 13S e 12S após 48 horas de expressão E1A.Células expostas à cisplatina mostraram uma mudança em cinco seleção de splicing S-S prime favorecendo a expressão 12S. Este efeito foi observado em HEK 293 expressando o vetor vazio da Bandeira, bem como isoforme um de Nek4. As mudanças na emenda alternativa após o tratamento do paclitaxel foram muito discretas, mas as direções das mudanças foram opostas nas células expressas Flag e Nek4.Ao executar este protocolo, é importante usar controles de transcriptase não transtrafetos e não reversos para evitar interpretações erradas com expressão Endógena E1A, principalmente quando se usa células HEK 293. Após a obtenção de resultados positivos, pode-se avaliar o splicing alternativo de genes específicos relacionados à resposta quimioterápico. Quando algum efeito é observado, este protocolo simples pode direcionar esses estudos para caminhos mais consistentes, onde a proteína desempenha um papel regulando a emenda alternativa na resposta à quimioterapia, por exemplo.

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Research

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