Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

O objetivo geral desta abordagem proteômica é a caracterização da reorganização molecular nas sinapses após o aprendizado e a formação da memória para entender os mecanismos básicos e as vias de sinalização. A principal vantagem desta técnica é uma abordagem livre de hipóteses, permitindo quantificação e caracterização em larga escala de pós-tradução e modificações dentro de proteomas sinápticos. Nosso fluxo de trabalho estabelecido permite uma correlação entre uma determinada mudança molecular e um comportamento específico.

O aprendizado e a formação da memória são baseados em mudanças na eficácia sináptica e, portanto, os estudos proteômicos devem se concentrar mais na análise de estruturas sinápticas como sinaptossomos do que em homogeneizados do tecido cerebral. Os resultados proteômicos representam conjuntos de dados altamente complexos, portanto, requerem processamento bioinformático. Comece o treinamento colocando o mouse de teste em uma caixa de transporte mal iluminada dentro de uma câmara à prova de som.

Use um cronograma de aprendizado totalmente controlado por computador para o aprendizado de discriminação auditiva. Comece com um período de habituação de três minutos de silêncio antes de iniciar a sessão de treinamento. Durante os testes de go, o animal tem que cruzar o obstáculo dentro de seis segundos após a apresentação do tom para marcar um acerto.

Durante os testes de proibição, o animal deve permanecer no compartimento atual da caixa de transporte durante os seis segundos de apresentação do tom. Realize 30 tentativas e 30 tentativas proibidas em uma ordem pseudo-randomizada, com um intervalo entre tentativas de 20 segundos, de modo que uma sessão consista em 60 tentativas e dure cerca de 25 minutos. Depois que todos os testes forem realizados, retorne o mouse treinado à gaiola inicial até o sacrifício.

Depois de sacrificar o camundongo e remover o cérebro, localize o córtex auditivo usando pontos de referência visuais, incluindo vasos sanguíneos e a forma da superfície. Em seguida, use um bisturi e uma agulha para dissecar bilateralmente o córtex auditivo como um bloco de tecido retangular. Usando o quiasma óptico como ponto de referência, disseque o córtex frontal como uma fatia do cérebro entre Bregma 3,56 e 1,54.

Disseque o estriado como uma fatia de cérebro entre Bregma 1,54 e 0,5. E remova cuidadosamente o tecido cortical. Disseque o hipocampo estabilizando o cérebro com a agulha através do cerebelo e desenrolando o córtex começando no lobo occipital.

Amostras de cérebro dissecadas por congelamento de choque em nitrogênio líquido. Comece a purificação do sinaptossomo transferindo o tecido cerebral dissecado para vasos de homogeneização contendo um mililitro de tampão A gelado. Centrifugar as amostras a 1 000 vezes G durante 10 minutos.

Após a centrifugação, reter os sobrenadantes. Homogeneizar novamente o pellet como antes e combinar os sobrenadantes. Centrifugar os sobrenadantes combinados durante 20 minutos a 12 000 vezes G. Ressuspender os pellets num mililitro de tampão de homogeneização e homogeneizar com seis movimentos a 900 RPM, seguidos de centrifugação a 1 200 vezes G durante 20 minutos.

Durante a centrifugação para produzir os pellets P2, prepare gradientes de etapa de sacarose em tubos de ultracentrífuga. Comece com 2,5 mililitros de tampão de sacarose 1,0 molar e, em seguida, use uma pipeta Pasteur de vidro para subcamada de 1,5 mililitros de tampão de sacarose 1,2 molar. Após a centrifugação, adicione 0,5 mililitros de tampão sacarose 0,32 molar aos pellets P2.

Em seguida, homogeneizar novamente usando seis traços. Carregue as frações homogeneizadas no topo dos gradientes. Coloque os gradientes carregados em um rotor de caçamba oscilante e gire a 85.000 vezes G por duas horas em uma ultracentrífuga.

Quando a centrifugação estiver concluída, descarte a camada superior de sacarose molar de 0,32, incluindo o material na interface com o tampão de sacarose molar de 1,0. Colete sinaptossomos na interface tampão de sacarose de um a 1,2 molar. Adicione tampão de sacarose molar de 0,32 à fração sinaptossomal na proporção de 1,1.

Misture com cuidado e gire a 150.000 vezes G por uma hora. Os sinaptossomos estão no pellet e podem ser ressuspensos em um tampão para processamento posterior. Dissolva os sinaptossomos de cada área do cérebro de um animal em 20 a 50 microlitros de ureia 8 molar incubando no gelo por uma hora em um banho ultrassônico.

Diluir com um por cento de um detergente removível para garantir uma concentração final de dois molares de ureia. Depois de determinar as quantidades relativas de proteína usando SDS-PAGE, pipetar um terço do restante de cada amostra em um tubo novo. Execute a digestão em solução adicionando dois DTT milimolar e 25 bicarbonato de amônio milimolar e vórtice suavemente a amostra.

Reduza as amostras por 45 minutos a 20 graus Celsius. Adicione 10 milimolares iota de acetamida aos resíduos de carbamidometilato de cisteína e misture. Incube por 30 minutos no escuro a 20 graus Celsius.

Finalmente, adicione um microlitro de uma solução estoque de tripsina e incube a 20 graus Celsius por 12 horas. Para remover o detergente ácido-clivável, adicione ácido trifluoroacético a uma concentração final de um por cento e incube por mais uma hora a 20 graus Celsius. Depois de centrifugar as amostras a 16 000 vezes G durante 10 minutos, recolher cuidadosamente os sobrenadantes.

Coloque a coluna de extração em fase sólida em um rack e equilibre a matriz com dois mililitros de metanol. Após a lavagem, adicione mais dois mililitros de Buffer B e carregue a amostra. Depois de lavar três vezes com o tampão B, eluir os peptídeos adicionando 200 microlitros de acetonitrila a 70% e ácido triflouroacético a 0,1%.

Em seguida, seque as amostras purificadas em uma centrífuga a vácuo. Neste exemplo, os animais treinados na tarefa de discriminação de tom FM mostram uma taxa crescente de acertos e uma taxa decrescente de alarmes falsos ao longo das sessões de treinamento. Discriminação significativa ocorre a partir da quarta sessão.

As abundâncias sinápticas relativas de proteínas selecionadas são comparadas entre camundongos treinados na tarefa de discriminação de tom FM e camundongos de controle ingênuos 24 horas após a primeira sessão de treinamento. Após o treinamento, os níveis da proteína CYFP2 são alterados em todas as regiões estudadas. Não se esqueça de que os animais geralmente exibem variabilidades intraindividuais.

Portanto, é altamente recomendável incluir pelo menos cinco ou mais réplicas biológicas de grupos de animais bem combinados no estudo. Uma vez estabelecida, essa técnica pode ser facilmente adaptada a outras espécies. Por exemplo, tem sido usado para monitorar mudanças na expressão de proteínas dependentes do aprendizado em cérebros de moscas da fruta.