Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

O objetivo geral dessa abordagem proteômica é a caracterização da reorganização molecular nas sinapses após a formação da aprendizagem e da memória, com o intuito de compreender os mecanismos básicos e as vias de sinalização. A principal vantagem dessa técnica é a abordagem livre de hipóteses, que permite a quantificação e caracterização em larga escala de modificações pós-traducionais nos proteomas sinápticos. Nosso fluxo de trabalho estabelecido permite uma correlação entre uma determinada alteração molecular e um comportamento específico.

A aprendizagem e a formação da memória baseiam-se em mudanças na eficácia sináptica e, portanto, os estudos proteômicos devem focar mais na análise de estruturas sinápticas, como sinaptossomos, do que em homogenatos de tecido cerebral. Os resultados proteômicos representam conjuntos de dados altamente complexos e, por conseguinte, exigem processamento bioinformático. Inicie o treinamento colocando o camundongo-teste em uma caixa de passagem fracamente iluminada dentro de uma câmara à prova de som.

Utilize um cronograma de aprendizagem totalmente controlado por computador para o aprendizado de discriminação auditiva. Inicie com um período de habituação de três minutos de silêncio antes de começar a sessão de treinamento. Durante os ensaios de resposta, o animal deve atravessar o obstáculo dentro de seis segundos após a apresentação do tom para obter um acerto.

Durante os ensaios de não-ir, o animal deve permanecer no compartimento atual da caixa de transferência durante os seis segundos de apresentação do tom. Realize 30 ensaios de ir e 30 ensaios de não-ir em ordem pseudoaleatória, com um intervalo entre ensaios de 20 segundos, de modo que uma sessão consista em 60 ensaios e dure cerca de 25 minutos. Após a realização de todos os ensaios, devolva o camundongo treinado à gaiola de origem até o sacrifício.

Após sacrificar o camundongo e remover o cérebro, localize o córtex auditivo utilizando marcos visuais, incluindo vasos sanguíneos e o formato da superfície. Em seguida, use um bisturi e uma agulha para dissecar bilateralmente o córtex auditivo na forma de um bloco de tecido retangular. Utilizando o quiasma óptico como marco, dissecar o córtex frontal como uma fatia cerebral entre Bregma 3,56 e 1,54.

Disseque o estriado como uma fatia cerebral entre Bregma 1,54 e 0,5. E remova cuidadosamente o tecido cortical. Disseque o hipocampo estabilizando o cérebro com a agulha através do cerebelo e desenrolando o córtex a partir do lobo occipital.

Congele rapidamente as amostras de cérebro dissecadas em nitrogênio líquido. Inicie a purificação de sinaptossomos transferindo o tecido cerebral dissecado para recipientes de homogeneização contendo um mililitro do Tampão A gelado. Em seguida, homogeneíze o tecido a 900 RPM utilizando aproximadamente 12 movimentos. Centrifugue as amostras a 1.000 × g por 10 minutos.

Após a centrifugação, retenha os sobrenadantes. Re-homogeneíze o precipitado como anteriormente e combine os sobrenadantes. Centrifugue os sobrenadantes combinados por 20 minutos a 12.000 × g. Re-suspenda os precipitados em um mililitro de tampão de homogeneização e homogeneíze com seis movimentos a 900 rpm, seguido por centrifugação a 1.200 × g por 20 minutos.

Durante a centrifugação para produzir os pellets P2, prepare gradientes de sacarose em etapas em tubos para ultracentrífuga. Comece com 2,5 mililitros de tampão de sacarose 1,0 molar e, em seguida, use uma pipeta de vidro de Pasteur para adicionar sob a camada 1,5 mililitro de tampão de sacarose 1,2 molar. Após a centrifugação, adicione 0,5 mililitro de tampão de sacarose 0,32 molar aos pellets P2.

Em seguida, re-homogeneíze utilizando seis movimentos. Carregue as frações homogeneizadas sobre os gradientes. Coloque os gradientes carregados em um rotor de rotor oscilante e centrifugue a 85.000 vezes G por duas horas em uma ultracentrífuga.

Após a conclusão da centrifugação, descarte a camada superior de sacarose 0,32 molar, incluindo o material na interface com o tampão de sacarose 1,0 molar. Colete os sínaptossomos na interface entre os tampões de sacarose 1,0 e 1,2 molar. Adicione tampão de sacarose 0,32 molar à fração sínaptossomal numa proporção de 1,1.

Agite cuidadosamente e centrifugue a 150.000 ×g por uma hora. Os sinaptossomos estão no pellet e podem ser re-suspensos em um tampão para processamento adicional. Dissolva os sinaptossomos de cada área cerebral de um animal em 20 a 50 microlitros de ureia 8 molar, incubando no gelo por uma hora em banho ultrassônico.

Dilua com um por cento de um detergente removível para garantir uma concentração final de dois molar de ureia. Após determinar as quantidades relativas de proteína usando SDS-PAGE, pipete um terço do restante de cada amostra em um tubo novo. Realize a digestão em solução adicionando DTT a dois milimolar e bicarbonato de amônio a 25 milimolar e vorte a amostra suavemente.

Reduza as amostras por 45 minutos a 20 graus Celsius. Adicione iodoacetamida 10 milimolar para carboxiametilar resíduos de cisteína e misture. Incube por 30 minutos no escuro a 20 graus Celsius.

Finalmente, adicione um microlitro de uma solução estoque de tripsina e incube a 20 graus Celsius por 12 horas. Para remover o detergente clivável por ácido, adicione ácido trifluoroacético até uma concentração final de um por cento e incube por mais uma hora a 20 graus Celsius. Após centrifugar as amostras a 16.000 ×g por 10 minutos, colete cuidadosamente os sobrenadantes.

Coloque a coluna de extração em fase sólida em um suporte e equilibre a matriz com dois mililitros de metanol. Após a lavagem, adicione dois mililitros adicionais de Tampão B e aplique a amostra. Após três lavagens com Tampão B, elua os peptídeos adicionando 200 microlitros de acetonitrila a 70 por cento e ácido trifluoroacético a 0,1 por cento.

Em seguida, seque as amostras purificadas em um centrifugador a vácuo. Neste exemplo, animais treinados na tarefa de discriminação de tons FM mostram uma taxa crescente de acertos e uma taxa decrescente de falsos alarmes ao longo das sessões de treinamento. A discriminação significativa ocorre a partir da quarta sessão.

As abundâncias sinápticas relativas de proteínas selecionadas são comparadas entre camundongos treinados na tarefa de discriminação de tons FM e camundongos controle ingênuos, 24 horas após a primeira sessão de treinamento. Após o treinamento, os níveis da proteína CYFP2 são alterados em todas as regiões estudadas. Não se esqueça de que os animais frequentemente exibem variabilidades intra-individuais.

Portanto, recomenda-se fortemente incluir pelo menos cinco ou mais réplicas biológicas de grupos de animais bem pareados no estudo. Uma vez estabelecida, esta técnica pode ser facilmente adaptada para outras espécies. Por exemplo, tem sido usada para monitorar alterações na expressão proteica dependentes de aprendizagem em cérebros individuais de moscas-das-frutas.