Name: Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas sinápticas em regiões cerebrais de camundongos após aprendizado auditivo. Este método proteômico de alta resolução correlaciona alterações moleculares com comportamentos específicos de memória.

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Gostaríamos de agradecer a Yvonne Ducho e Kathrin Pohlmann pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) e pelo Estado da Saxônia-Anhalt / Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) por meio do Centro de Ciências do Cérebro Comportamental (CBBS).

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<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O estudo apresenta um fluxo de trabalho metodológico otimizado para um perfil quantitativa precisa de mudanças de expressão de proteínas sinápticas durante a aprendizagem e consolidação da memória em diferentes áreas cerebrais de camundongos. A configuração oferece a oportunidade para estudar a expressão de proteína ao nível de um único animal, apesar de a aplicação desejada de pelo menos três replicados por amostra de técnicas para a análise por espectrometria de massa. A metodologia leva em conta a composição de proteína em particular do pré e postsynapse consistindo de proteínas de elevado peso molecular de andaime, mas também de proteínas importante mediador rolamento pesos moleculares médios ou baixos. Os digeridos em solução de preparações sinaptosomais resultar numa geração eficiente e, portanto, uma sobre-representação de péptidos derivados de andaime. Este, por sua vez, pode suprimir a análise de proteínas abundantes menores ou inferiores. A preparação sugerido de frações de SDS-PAGE de umalíquota de cada amostra combinada com um procedimento de digestão em gel em paralelo facilita a análise de proteínas de abundância médio e baixo e representa um método complementar altamente recomendado. Após a aplicação de espectrometria de massa separada de todas as fracções derivadas a partir de uma amostra (por exemplo, em solução digerir, em gel de digerir, fracções enriquecidas-fosfo combinados) os correspondentes conjuntos de dados de MS / MS pode ser combinado e ainda calculadas para a identificação de proteínas e quantificação de picos software ou pacotes de software alternativos populares. Alternativamente, a aplicação individual das fracções em gel derivado de digestão de uma amostra (gel-áreas processados separadamente de uma pista de amostra) e fracções geradas da amostra digerida em solução (por exemplo, por cromatografia de permuta iónica) para espectrometria de massa pode aumentar a profundidade analítica. No entanto, este fluxo de trabalho prolongado aumenta drasticamente o tempo necessário para LS-MS / MS de aquisição de dados. para generatioN de uma sequência molecular detalhada de rearranjos de proteínas sinápticas durante a aprendizagem e a formação da memória de um curso de tempo especificado do perfilamento proteomic é necessária. Este curso tempo pode começar imediatamente depois ou mesmo durante a primeira sessão de treinamento e abrange um período de tempo do fim-de malha até que o desempenho dos animais atingiu o nível assintótica da curva de aprendizagem após aprox. 8 - 10 dias de treinamento (veja a Figura 2 para obter detalhes). A análise das alterações de fosforilação de proteínas sinápticas requer um foco particular sobre os prazos selecionados durante a aprendizagem FMTD. Sobre as cascatas de sinalização um lado, iniciando rearranjos de proteínas sinápticas conhecidos por ser desencadeada por fosfolarização proteína e dephosphorylations são esperados nos primeiros estágios de treinamento animal. Por outro lado, existem longos modificações duradouras de múltiplas proteínas fosforiladas sinápticas conhecidas que regulam a conectividade e a montagem dentro dos sarquitetura ynaptic 19, 20. Essas modificações pós-translacionais são esperados, mesmo em momentos posteriores da consolidação da memória. Os conjuntos de dados complexos gerados por este fluxo de trabalho proteômica requerem processamento de bioinformática para identificar participar vias moleculares e moléculas-chave. Meta-análise mostra caminhos sobre-representados significativas, que desempenham um papel nos processos de aprendizagem e memória.

A aprendizagem é baseado na formação de traços de memória e a sua manutenção. É amplamente aceito que um mecanismo subjacente pode representar uma formação de novo e / ou rearranjo dos contatos sinápticos existentes entre os neurônios dependente de atividade. Ao nível molecular, várias modificações de proteínas, relocalizações subcelulares e mudanças no volume das proteínas sinápticas foram descritos 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). No entanto, a maioria dos estudos até agora focada em proteínas selecionados, em vez de sobre a composição proteoma sináptica global, mas complexa. A presente abordagem permite uma seleção imparcial por mudanças proteoma sinápticas em regiões do cérebro do rato após uma experiência de aprendizagem. Ele é adequado para tornar ponto de tempo instantâneos moleculares dependentes da reorganização induzida-learning da arquitetura sináptica. O fluxo de trabalho descrito requer um trabalho em equipe específica de diversos especialistas em comportamento animal, bioquímica de proteínas, espectrometria de massa e bioinformatics. O paradigma de aprendizagem escolhida, ou seja, tom de discriminação de frequência modulada (FMTD), é uma tarefa de discriminação auditiva bem caracterizado em roedores 5. Aprendizagem e formação da memória de longo prazo nesta caixa de transporte Go / No-Go-tarefa envolve mecanismos dependendo aumentou sinalização de dopamina cortical e síntese de proteínas. Assim, estudos recentes proteômicas sobre gerbils e ratos revelaram dopamina e rearranjos de plástico induzida por aprendizagem dos componentes sinápticas em cortical, mas também em regiões cerebrais mais basais que supostamente interagir durante a aprendizagem e memória FMTD 6-8. Isto ilustra que a formação da memória envolve uma complexa interacção de várias regiões do cérebro e, assim, podem ser regulados diferencialmente dentro destas regiões sobre o nível do proteoma. Portanto, o esvaziamento das regiões do cérebro do rato corticais e subcorticais seleccionadas incluído no fluxo de trabalho. Além disso, o characterizati fiávelno mesmo de alterações fracas na composição de proteína sináptica requer um enriquecimento de compartimentos pré e pós-sinápticos, ao invés da análise de homogenatos de membrana em bruto ou fracções 9. Protocolos Portanto, a preparação de sinaptossomas utilizando estabelecida antes de proteomic análise é descrito, a fim de aumentar o nível de detecção e a faixa dinâmica para proteínas específicas de sinapse 10,11. Um pré-requisito essencial para utilizar a espectrometria de massa de alta resolução livre de marcador para fins quantitativos é um elevado grau de semelhança das amostras de proteína. Como são esperadas mudanças em vez menores na composição de proteína sináptica a ocorrer depois de saber, uma abordagem livre de etiqueta será adequado para comparar amostras de proteínas obtidos a partir de ratos treinados e ingênuo correspondente. Alternativamente, as estratégias de etiquetas de condições específicas de proteínas / peptídeos usando isótopos estáveis (por exemplo, TMT, iTRAQ, ICPL e SILAC), bem como qua livre rótulo baseado em MS2ntification (SWATH) são úteis, mas eles são mais caros do que a abordagem sem rótulo escolhido ou precisa de hardware especial de espectrometria de massa. Desde rastreios proteômicas, muitas vezes produzir conjuntos de dados complexos, processamento de bioinformática é recomendado para interpretação de dados apropriado. meta-análises adicionais podem apoiar uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes potenciais alterações relacionadas com o paradigma e a identificação de processos celulares chave envolvidas e vias de sinalização. metodologias adequadas também são descritos abaixo.

<table><tbody><tr><td>Extração em Fase Sólida Empore 3 M - Filtro</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &micro; m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 &micro; m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de amônio&nbsp; &nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Blue R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Bromofenol</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57BL/6J</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga para MLS-50</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga para rotor TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R centrífuga</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 rotor</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT Fosfatase Coquetel Inibidor&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de homogeneização 2 ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Análise da via de engenhosidade</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acionamento de perfuração de laboratório &nbsp; K-ControlTLC 4957&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kaltenbach & Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix rotador de tubo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escada de Proteína Prestada</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Soluções de Bioinformática&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coquetel Inibidor de Fosfatase 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP / IMBA / GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Êmbolo / pilão feito de PTFE</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador PotterS</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease mini</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>completo Quantidade Um 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Águas</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de transporte</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sódio (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sódio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>Sódio tartarato di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 Banho ultrassônico</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Câmara à prova de som</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletileno -1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="RANGE! A60">Titansphere TiO 5&micro; m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japão</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético&nbsp; (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS)</td> <td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td>Tubo de Ultracentrífuga <td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador Refrigerado Unijet II</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H Concentrator Centrífuga&nbsp;</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Água (purificada de alta qualidade)</td><td></td><td></td><td>Resistividade: > 18,2 M&Omega;*cm a 25 &deg; C&nbsp; Pirogênios: < 0,02 UE/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TOC: < 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 Ponteiras de Pipeta</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

alta resolução quantitativa synaptic proteome profiling de rato regiões cerebrais depois auditivo discriminação aprendizagem

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Os mecanismos sinápticos moleculares subjacentes ao aprendizado auditivo e à memória permanecem amplamente desconhecidos. Aqui, o fluxo de trabalho de um estudo proteômico sobre o aprendizado da discriminação auditiva em camundongos é descrito. Nesse paradigma de aprendizado, os camundongos são treinados em uma tarefa Go / NoGo para discriminar entre tons modulados em frequência ascendente e decrescente, a fim de evitar um leve choque elétrico nos pés. O protocolo envolve o enriquecimento de sinaptossomos de quatro áreas do cérebro, ou seja, o córtex auditivo, o córtex frontal, o hipocampo e o estriado, em diferentes estágios do treinamento. Os padrões de expressão de proteínas sinápticas obtidos de camundongos treinados são comparados a controles ingênuos usando uma abordagem proteômica. Para atingir profundidade analítica suficiente, as amostras são fracionadas de três maneiras diferentes antes da espectrometria de massa, ou seja, 1D SDS-PAGE/digestão em gel, digestão em solução e enriquecimento de fosfopeptídeos. 
A análise proteômica de alta resolução em um espectrômetro de massa e a quantificação sem rótulo são usadas para examinar os perfis de proteínas sinápticas em frações depletadas de fosfo-peptídeos e enriquecidas com fosfo-peptídeos de amostras de proteínas sinaptossômicas. Um pacote de software comercial é utilizado para revelar proteínas e fosfopeptídeos com níveis de abundância sináptica relativa significativamente regulados (controles treinados/ingênuos). Foram observados modos de regulação comum e diferencial para o proteoma sináptico nas regiões cerebrais investigadas de camundongos após o treinamento. Posteriormente, meta-análises utilizando vários bancos de dados são empregadas para identificar funções celulares subjacentes e vias biológicas.

A Figura 1 resume o fluxo de trabalho completa do quantitativo de perfis proteoma sináptica de regiões do cérebro do rato depois de saber discriminação auditiva. Ele começa com o treinamento de animais em uma caixa de transporte. No exemplo mostrado na Figura 2, os murganhos começaram a mostrar significativa discriminação de tom de FM na sessão de treino 4 th, indicando aprendizagem eficiente. Os animais são sacrificados em momentos seleccionados para dissecção área do cérebro. O enriquecimento requerido de sinapses pode ser conseguido por a preparação de sinaptossomas ou, alternativamente, através da preparação de uma fracção enriquecida em PSD, ambos descritos em pormenor na Figura 3. O método PSD-enriquecimento foi desenvolvido para baixas quantidades de tecido, por exemplo, 1 - 2 fatias de hipocampo de cérebro de rato 12, 18. Ela exige pequenos tubos, pilões PTFE de montagem para estes tubos, e uma unidade de perfuração de laboratório para alimentar o pilão. Devido à composição de proteína particular de sinaptossomas, é altamente recomendável para realizar a preparação da amostra de duas maneiras diferentes mas complementares. Os andaimes de os PSDs são muitas vezes as proteínas de peso molecular muito elevado que ocorrem em alta estequiometria. Em resumo-solução é a melhor maneira de extrair de forma eficiente, mas pode levar a uma sobre-amostragem da mistura de péptidos gerada. A digest em gel realizada da mesma amostra em paralelo pode excluir essas proteínas de elevado peso molecular e favorecer a análise de proteínas com peso molecular médio e inferior. Para uma análise abrangente são recomendados os dois tipos de digestões proteolíticas. Os diferentes quantidades de tecidos de as áreas do cérebro investigadas requerem um ajustamento do material aplicado para uma melhor comparação. Dentro das quatro áreas do cérebro investigaram o córtex auditivo é geralmente o fato limitanteou. O material de todas as outras áreas do cérebro deve ser cuidadosamente ajustada com a quantidade de córtex auditivo após a preparação de sinaptossomas ou fracções enriquecidas-PSD (ver 3.1.1.). pesos típicos de áreas cerebrais recentemente preparadas a partir de ratinhos são como se segue: córtex auditivo (AC): ~ 50 mg; hipocampo (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg e córtex frontal (FC): ~ 100 mg. O método PSD-enriquecimento descrito na seção 2.3 permitiram a identificação de cerca de 1500 proteínas diferentes e cerca de 250 diferentes fosfo-péptidos por região do cérebro sobre o nível de um único animal (Tabela 1). Análise proteomic 24 h depois da primeira sessão de treino revelou que 7,3% das proteínas identificadas e 5,8% dos fosfo-péptidos mostraram aumentos significativos (p &lt;0,05) alterações quantitativas da sua expressão sináptica em comparação com controlos sem tratamento prévio (tabela 1). Uma tendência evidente para regula para baixoção de andaimes sinápticas podem apontar para um rearranjo pronunciada da arquitetura sináptica durante as fases iniciais da aprendizagem FMTD. A vasta maioria das proteínas reguladas foram alteradas de uma maneira específica para uma região do cérebro, ao passo que apenas 22% foram encontrados para ser regulada em duas ou mais áreas do cérebro. Seis exemplos seleccionados são mostrados na Figura 4. Meta-análise dos resultados complexos por IPA fornece evidência para a especial, a participação / manipulação das seguintes vias canônicas: &quot;mediada por Clathrin Endocytosis sinalização&quot;, &quot;axonal Orientação de sinalização&quot;, &quot;Sinalização de Cálcio&quot;, &quot;RhoA sinalização&quot;, &quot;Sinalização Notch &quot;,&quot; Reforma de epitelial junções aderentes &quot;,&quot; O glutamato Receptor Signaling &quot;,&quot; GABA Receptor Signaling &quot;,&quot; receptor de dopamina sinalização &quot;e&quot; Synaptic potenciação de longa duração &quot;. <p class="jove_content" fo:keep-together.withna página-= &quot;1&quot;&gt; análise de enriquecimento individuais revelou processos biológicos significativos sobre-representados no córtex frontal em matéria de transporte de proteínas, a adesão celular, a fosforilação, a endocitose, transporte mediado por vesícula, desenvolvimento do cérebro anterior e axonogenesis (Figura 5). Nos processos biológicos córtex auditivo, incluindo o transporte de íons, tradução, transporte mRNA, transporte de proteínas e aprendizagem eram perceptíveis. A análise da fracção de proteína do hipocampo detecta significativamente enriquecidos processos relacionados com o transporte de iões, do ciclo celular, a tradução, a fosforilação e desenvolvimento do sistema nervoso. No estriado, sobre-representados foram encontrados processos biológicos, incluindo o transporte de mRNA, transporte mediado por vesícula, axonogenesis, proteólise, transporte de proteínas e endocitose. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> Figura 1: Systematic Workflow da abordagem metodológica. Esta figura resume esquematicamente o fluxo de trabalho de alta resolução profiling quantitativa da composição de proteína sináptica área específica do cérebro. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplo do desempenho de ratos no tom FM Discriminação de tarefas. Animais mostram uma taxa crescente de visitas (curva azul) e uma taxa decrescente de falsos alarmes (curva preta) no decurso das sessões de treinamento. discriminação significativa ocorre a partir da quarta sessão. As barras de erro são fornecidos como SEM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver um lar</a>versão ger desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> Figura 3: Preparação da Fracção de sinaptosoma e o PSD-enriquecida. A: preparação de sinaptossomas. B: Preparação fracção enriquecida em PSD. Ambas as figuras explicar o fluxo de trabalho detalhado de preparação de sinaptossomas ou frações alternativamente PSD-enriquecido a partir de tecidos cerebrais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> Figura 4: Selecionado resultados quantitativos proteômica. As abundâncias sinápticas relativas de proteínas selecionadas são comparados entre tra ratosinada na tarefa FMTD (AV, n = 6) e ratinhos de controlo sem tratamento prévio (NV, n = 6) 24 h após a primeira sessão de treino. Os valores de abundância foram calculados como média das áreas dos picos dos três mais intensos péptidos de uma proteína. Proteínas com alterações significativas abundância (AV / NV; t-teste) são marcadas dentro dos lotes: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,005. As barras de erro são fornecidos como SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> Figura 5: Visualização de vias biológicas para córtex frontal por GeneCodis / Gephi. Somente os termos significativos do banco de dados Gene Ontology (GO) (http://geneontology.org) relacionadas com &quot;Processo biológico&quot; com um número de proteínas mínimo de três<html> são mostradas aqui. Nós representam termos GO, o tamanho do nó, a largura de linha e o número de ligações de um determinado nó representam o número de proteínas, que partilham este termo GO com outros nós. Devido ao método de &quot;Força Atlas&quot; de Gephi, nós relacionados se aglomeram em conjunto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> região do cérebro </td><td> CA </td><td> FC </td><td> QUADRIL </td><td><html> 000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> proteínas identificadas </td><td> 1435 </td><td> 1758 </td><td> 1572 </td><td> 1507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> proteínas reguladas (p &lt;0,05) </td><td> 59 </td><td> 130 </td><td> 162 </td><td> 108 </td><td>face = &quot;Calibri&quot; size = &quot;3&quot;&gt; 459 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 76 </td><td> 35 </td><td> 123 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 51 </td><td> 126 </td><td> 86 </td><td> 73 </td><td> 336 </td></tr><tr><td> phosphomoti identificados<html> fs </td><td> 197 </td><td> 361 </td><td> 273 </td><td> 278 </td><td> 1109 </td></tr><tr><td> phosphomotifs regulamentados (p &lt;0,05) </td><td> 8 </td><td> 22 </td><td> 21 </td><td> 14 </td><td> 65 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; 17 </td><td> 5 </td><td> 9 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 16 </td><td> 5 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resumo de um resultado Proteomic. Esta tabela resume uma experiência representativa de proteómica ratos treinados (AV, n = 6) 24 h após a primeira sessão de treino em relação aos seus controlos naive (NV, n = 6). osoma de 459 proteínas reguladas inclui regulamentos que se sobrepõem. 283 regulamentos diferentes foram determinadas como específica do cérebro. Em detalhe, 57 proteínas são regulados em duas regiões cerebrais, 18 regulamentos proteínas foram detectadas em três regiões do cérebro e apenas 2 proteínas são regulados em todas as quatro áreas do cérebro investigadas. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tolerâncias de erro </td></tr><tr><td> massa precursor (Fourier massa transformação espectrometria) </td><td> 10 ppm </td></tr><tr><td> massa fragmento de íons (ion trap linear) </td><td> 0.6 Da </td></tr><tr><td> Clivagens máximas perdidas por peptídeo </td><td> 3 </td></tr><tr><td> modificações fixos </td></tr><tr><td> no digerido-gel amostras </td><td> Carbamidomethylation de cisteína </td></tr><tr><td> para as amostras em solução digerido </td><td> MethylthiolatioN de cisteína </td></tr><tr><td> modificações variáveis </td><td> A oxidação de metionina </td></tr><tr><td></td><td> Deamidations de asparagina e / ou glutamina </td></tr><tr><td> Banco de dados </td><td> UniProt / Sprot </td></tr><tr><td> Taxonomia </td><td> rato </td></tr><tr><td> Ajustes estatísticos de identificação de aceitação </td></tr><tr><td> de novo médio de confiança local (ALC) </td><td> &gt; 50% </td></tr><tr><td> Peptide-falsa taxa de detecção (FDR, com base na est. Chamariz-fusion) </td><td> &lt;1% </td></tr><tr><td> A proteína de significância (-10logP, baseado em t-teste modificado) </td><td> &gt; 20 </td></tr><tr><td> péptidos únicos / proteína </td><td> 1 ≥ </td></tr><tr><td> Configurações de quantificação: </td></tr><tr><td> Os péptidos utilizados para a quantificação se: </td></tr><tr><td> Peptide significância (-10logP) </td><td> &gt; 30 </td></tr><tr><td> identificação péptido em </td><td> ≥ 50% das amostras </td></tr><tr><td> qualidade de sinal Péptido </td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td> área média Peptide </td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td> tolerância tempo de retenção Péptido </td><td> &lt;5 min </td></tr><tr><td> Normalização </td><td> pela corrente de íons total (TIC) </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Definições para a identificação de proteínas (passo 4.2.2).

A identificação de moléculas e vias que controlam a plasticidade sináptica e a memória ainda é um grande desafio na neurociência. Aqui, é descrito um fluxo de trabalho abordando a quantificação relativa de proteínas sinápticas supostamente envolvidas na reorganização molecular das sinapses durante a aprendizagem e consolidação da memória em um paradigma de aprendizagem auditiva.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

O objetivo geral dessa abordagem proteômica é a caracterização da reorganização molecular nas sinapses após a formação da aprendizagem e da memória, com o intuito de compreender os mecanismos básicos e as vias de sinalização. A principal vantagem dessa técnica é a abordagem livre de hipóteses, que permite a quantificação e caracterização em larga escala de modificações pós-traducionais nos proteomas sinápticos. Nosso fluxo de trabalho estabelecido permite uma correlação entre uma determinada alteração molecular e um comportamento específico.A aprendizagem e a formação da memória baseiam-se em mudanças na eficácia sináptica e, portanto, os estudos proteômicos devem focar mais na análise de estruturas sinápticas, como sinaptossomos, do que em homogenatos de tecido cerebral. Os resultados proteômicos representam conjuntos de dados altamente complexos e, por conseguinte, exigem processamento bioinformático. Inicie o treinamento colocando o camundongo-teste em uma caixa de passagem fracamente iluminada dentro de uma câmara à prova de som.Utilize um cronograma de aprendizagem totalmente controlado por computador para o aprendizado de discriminação auditiva. Inicie com um período de habituação de três minutos de silêncio antes de começar a sessão de treinamento. Durante os ensaios de resposta, o animal deve atravessar o obstáculo dentro de seis segundos após a apresentação do tom para obter um acerto.Durante os ensaios de não-ir, o animal deve permanecer no compartimento atual da caixa de transferência durante os seis segundos de apresentação do tom. Realize 30 ensaios de ir e 30 ensaios de não-ir em ordem pseudoaleatória, com um intervalo entre ensaios de 20 segundos, de modo que uma sessão consista em 60 ensaios e dure cerca de 25 minutos. Após a realização de todos os ensaios, devolva o camundongo treinado à gaiola de origem até o sacrifício.Após sacrificar o camundongo e remover o cérebro, localize o córtex auditivo utilizando marcos visuais, incluindo vasos sanguíneos e o formato da superfície. Em seguida, use um bisturi e uma agulha para dissecar bilateralmente o córtex auditivo na forma de um bloco de tecido retangular. Utilizando o quiasma óptico como marco, dissecar o córtex frontal como uma fatia cerebral entre Bregma 3,56 e 1,54.Disseque o estriado como uma fatia cerebral entre Bregma 1,54 e 0,5. E remova cuidadosamente o tecido cortical. Disseque o hipocampo estabilizando o cérebro com a agulha através do cerebelo e desenrolando o córtex a partir do lobo occipital.Congele rapidamente as amostras de cérebro dissecadas em nitrogênio líquido. Inicie a purificação de sinaptossomos transferindo o tecido cerebral dissecado para recipientes de homogeneização contendo um mililitro do Tampão A gelado. Em seguida, homogeneíze o tecido a 900 RPM utilizando aproximadamente 12 movimentos. Centrifugue as amostras a 1.000 × g por 10 minutos.Após a centrifugação, retenha os sobrenadantes. Re-homogeneíze o precipitado como anteriormente e combine os sobrenadantes. Centrifugue os sobrenadantes combinados por 20 minutos a 12.000 × g. Re-suspenda os precipitados em um mililitro de tampão de homogeneização e homogeneíze com seis movimentos a 900 rpm, seguido por centrifugação a 1.200 × g por 20 minutos.Durante a centrifugação para produzir os pellets P2, prepare gradientes de sacarose em etapas em tubos para ultracentrífuga. Comece com 2,5 mililitros de tampão de sacarose 1,0 molar e, em seguida, use uma pipeta de vidro de Pasteur para adicionar sob a camada 1,5 mililitro de tampão de sacarose 1,2 molar. Após a centrifugação, adicione 0,5 mililitro de tampão de sacarose 0,32 molar aos pellets P2.Em seguida, re-homogeneíze utilizando seis movimentos. Carregue as frações homogeneizadas sobre os gradientes. Coloque os gradientes carregados em um rotor de rotor oscilante e centrifugue a 85.000 vezes G por duas horas em uma ultracentrífuga.Após a conclusão da centrifugação, descarte a camada superior de sacarose 0,32 molar, incluindo o material na interface com o tampão de sacarose 1,0 molar. Colete os sínaptossomos na interface entre os tampões de sacarose 1,0 e 1,2 molar. Adicione tampão de sacarose 0,32 molar à fração sínaptossomal numa proporção de 1,1.Agite cuidadosamente e centrifugue a 150.000 ×g por uma hora. Os sinaptossomos estão no pellet e podem ser re-suspensos em um tampão para processamento adicional. Dissolva os sinaptossomos de cada área cerebral de um animal em 20 a 50 microlitros de ureia 8 molar, incubando no gelo por uma hora em banho ultrassônico.Dilua com um por cento de um detergente removível para garantir uma concentração final de dois molar de ureia. Após determinar as quantidades relativas de proteína usando SDS-PAGE, pipete um terço do restante de cada amostra em um tubo novo. Realize a digestão em solução adicionando DTT a dois milimolar e bicarbonato de amônio a 25 milimolar e vorte a amostra suavemente.Reduza as amostras por 45 minutos a 20 graus Celsius. Adicione iodoacetamida 10 milimolar para carboxiametilar resíduos de cisteína e misture. Incube por 30 minutos no escuro a 20 graus Celsius.Finalmente, adicione um microlitro de uma solução estoque de tripsina e incube a 20 graus Celsius por 12 horas. Para remover o detergente clivável por ácido, adicione ácido trifluoroacético até uma concentração final de um por cento e incube por mais uma hora a 20 graus Celsius. Após centrifugar as amostras a 16.000 ×g por 10 minutos, colete cuidadosamente os sobrenadantes.Coloque a coluna de extração em fase sólida em um suporte e equilibre a matriz com dois mililitros de metanol. Após a lavagem, adicione dois mililitros adicionais de Tampão B e aplique a amostra. Após três lavagens com Tampão B, elua os peptídeos adicionando 200 microlitros de acetonitrila a 70 por cento e ácido trifluoroacético a 0,1 por cento.Em seguida, seque as amostras purificadas em um centrifugador a vácuo. Neste exemplo, animais treinados na tarefa de discriminação de tons FM mostram uma taxa crescente de acertos e uma taxa decrescente de falsos alarmes ao longo das sessões de treinamento. A discriminação significativa ocorre a partir da quarta sessão.As abundâncias sinápticas relativas de proteínas selecionadas são comparadas entre camundongos treinados na tarefa de discriminação de tons FM e camundongos controle ingênuos, 24 horas após a primeira sessão de treinamento. Após o treinamento, os níveis da proteína CYFP2 são alterados em todas as regiões estudadas. Não se esqueça de que os animais frequentemente exibem variabilidades intra-individuais.Portanto, recomenda-se fortemente incluir pelo menos cinco ou mais réplicas biológicas de grupos de animais bem pareados no estudo. Uma vez estabelecida, esta técnica pode ser facilmente adaptada para outras espécies. Por exemplo, tem sido usada para monitorar alterações na expressão proteica dependentes de aprendizagem em cérebros individuais de moscas-das-frutas.

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de uma fatia de cérebro de camundongo para quantificar a distribuição de uma proteína pré-sináptica específica. O processo envolve o bloqueio de locais inespecíficos, a aplicação de anticorpos primários para a proteína-alvo e um marcador de referência, seguido pela marcação de anticorpos secundários e contracoloração nuclear. O marcador de referência garante uma quantificação precisa, fornecendo uma linha de base consistente, e a...

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