Quantificando a distribuição de uma proteína pré-sináptica no cérebro de camundongos usando imunofluorescência

Pegue uma fatia de cérebro de camundongo quimicamente fixada embutida em um meio de incorporação de tecido.

Lave a fatia com tampão para remover o meio.

Adicione uma solução que permeabilize as membranas e bloqueie locais de ligação não específicos.

Remova a solução.

Para visualizar proteínas sinápticas neuronais, incube a fatia com anticorpos primários.

Esses anticorpos têm como alvo uma proteína pré-sináptica expressa nas sinapses de regiões cerebrais específicas e uma proteína sináptica expressa de forma onipresente como marcador de referência.

Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Introduza anticorpos secundários marcados com fluoróforo que tenham como alvo os anticorpos primários.

Lave com tampão para remover anticorpos secundários não ligados.

Contra-corar os núcleos com um corante de ligação ao DNA.

Lave com tampão e monte a fatia usando um meio de montagem adequado.

Visualize a fatia sob um microscópio confocal.

Calcule as proporções médias de intensidade de fluorescência da proteína-alvo e do marcador de referência para analisar a distribuição da proteína-alvo em diferentes regiões do cérebro.

Para preparar as fatias para imunocoloração, use uma pipeta de plástico para remover a solução de PB de um poço sem aspirar as fatias de cérebro. Em seguida, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 250 microlitros de PB fresco para lavá-los do excesso de OCT. Repita essa lavagem para cada poço de cada vez para evitar o ressecamento das fatias.

Em seguida, use uma pipeta de plástico para remover a solução de PB do primeiro poço. Use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 250 microlitros de tampão de bloqueio por poço, funcionando bem por poço novamente. Incube a placa em temperatura ambiente em uma coqueteleira por três horas. Durante a incubação a 250 microlitros de tampão de anticorpos por poço para um tubo de reação.

Em seguida, use uma pipeta de 2 microlitros para adicionar a quantidade apropriada de anticorpo, pipetando-a diretamente na solução e pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes para misturar. Em seguida, bata esse anticorpo diluído para garantir a mistura adequada.

Funcionando bem por bem, remova o tampão de bloqueio com uma pipeta de plástico e adicione 250 microlitros de solução de anticorpo primário por poço. Incube a placa em uma coqueteleira a 4 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, remova a solução de anticorpos com uma pipeta de plástico. Lave as fatias com 300 microlitros de tampão de lavagem 1 por poço, três vezes 10 minutos cada lavagem em uma coqueteleira em temperatura ambiente. Durante a lavagem, trabalhando no escuro, dilua o anticorpo secundário acoplado ao fluoróforo em um tubo de reação da mesma forma que feito anteriormente com o anticorpo primário.

Após a lavagem, remova o tampão de lavagem com uma pipeta de plástico e adicione 250 microlitros de solução de anticorpos secundários por poço. Incube no escuro em temperatura ambiente por 90 minutos. Após a incubação completa, remova a solução de anticorpos com uma pipeta de plástico. Lave as seções três vezes com o tampão de lavagem 2 da mesma forma que com o tampão de lavagem 1.

Durante esta lavagem, dilua a coloração DAPI em 0,1 molar PB para atingir uma concentração de 1 a 2000. Depois de remover o tampão de lavagem da placa, adicione 250 microlitros de solução DAPI e incube em temperatura ambiente no agitador por 5 minutos.

Depois de remover a solução de DAPI com uma pipeta de plástico, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 500 microlitros de PB 0,1 molar por poço. Coloque uma lâmina de microscópio sob um estereoscópio. Use um pincel fino para adicionar três gotas separadas de 0,1 molar PB na lâmina. Usando o pincel, coloque uma fatia por gota na lâmina e, em seguida, alise e oriente as fatias.

Depois que todas as fatias estiverem posicionadas corretamente, use um lenço de papel para remover o excesso de PB e seque cuidadosamente sem secar completamente as fatias. Em seguida, adicione 80 microlitros de meio de incorporação na lâmina e cubra-a cuidadosamente com uma lamínula para incorporar as fatias de cérebro.

Cubra as lâminas para evitar a exposição à luz e deixe-as secar na hotte durante uma a duas horas e, em seguida, guarde-as numa caixa de lâminas de microscópio a 4 graus Celsius até estarem prontas para a microscopia confocal.

Depois de adquirir tecidos virtuais de toda a fatia do cérebro para diferentes canais, conforme descrito no manuscrito, carregue todos os canais únicos de uma imagem em Fiji clicando em Arquivo e depois em Abrir. Em seguida, use a ferramenta de seleção à mão livre para delinear um hemisfério no canal DAPI. Clique em Editar, depois em Seleção e em criar máscara para criar uma máscara da região selecionada.

Em seguida, clique em Analisar e, em seguida, em Medir partículas para determinar a intensidade média de fluorescência para canais únicos, certificando-se de selecionar canais diferentes para determinar os valores médios de intensidade de fluorescência para cada canal.

Depois disso, copie a intensidade média de fluorescência para os canais individuais em uma planilha. Para determinar a intensidade média de fluorescência para os canais individuais em uma área de interesse, delineie a área com a ferramenta de seleção à mão livre.