Projeto Experimental de Laser Microdissecção RNA-Seq: Lições de uma análise do desenvolvimento foliar do milho

O objetivo geral deste método é quantificar o acúmulo de transcritos em células ou domínios celulares específicos para que as comparações possam ser feitas entre diferentes domínios ou entre domínios equivalentes em amostras do tipo mutante e selvagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como como os domínios dos órgãos são especificados ou como mutações específicas afetam a expressão gênica. A principal vantagem dessa técnica é que o acúmulo de transcritos pode ser quantificado em domínios minúsculos e precisamente definidos que são muito pequenos para serem dissecados manualmente.

Antes de iniciar este procedimento, cultive planos de mudas de milho em condições padrão até duas semanas de idade. Para dissecar ápices de brotos para seções laterais, primeiro excise uma muda logo abaixo da linha do solo. Em seguida, use uma lâmina de barbear para remover fatias finas da base do caule até que um oval de calma circundado por uma ou duas folhas maduras seja visível.

Faça outro corte aproximadamente 10 milímetros acima da base. Este segmento de 10 milímetros contém o meristema apical da parte aérea em primórdios de folhas jovens. Gire o segmento de 10 milímetros para que a base fique voltada para cima.

Faça dois cortes paralelos ao eixo lateral para obter uma lâmina de tecido de dois a três milímetros de espessura. Descarte as duas partes externas e guarde a fatia central para fixação e incorporação. Mergulhe a fatia de tecido em aproximadamente 10 mililitros de agricultores fixos em um frasco de vidro no gelo.

Depois que todas as amostras tiverem sido dissecadas, aplique vácuo para remover as bolhas de ar e ajudar na penetração do fixador. Segure o aspirador por 10 minutos e, em seguida, solte lentamente o vácuo. Substitua o fixador e incube a quatro graus Celsius durante a noite com uma agitação suave.

No dia seguinte, continuar a processar os tecidos para inclusão conforme descrito no protocolo de texto. Para fundir blocos de parafina, coloque os moldes de incorporação em uma placa quente da estação de incorporação de tecidos e use uma pinça para transferir as amostras de tecido para os moldes de incorporação com a superfície de corte voltada para baixo. Coloque o anel de incorporação na parte superior do molde.

Complete cada molde com parafina derretida. Transfira os moldes para uma placa fria até que a parafina solidifique. Armazene os blocos de parafina em um recipiente hermético com sílica gel a quatro graus Celsius.

As seções são cortadas de blocos de parafina em um micrótomo seguindo procedimentos padrão, e as seções medianas que incluem o meristema apical do caule são selecionadas para montagem. Para montar as seções em slides, coloque slides sem RNase ou cozidos em um aquecedor de slides de 42 graus Celsius. Aplique várias gotas de solução de etanol a 50% para cobrir cada lâmina.

Coloque suavemente as seções na lâmina e flutue as seções na solução de etanol até que se expandam. Em seguida, incline a lâmina e remova o excesso de solução de etanol por aspiração com uma pipeta de transferência descartável. Use lenços sem fiapos para eliminar qualquer solução adicional de etanol.

Seque as lâminas a 42 graus Celsius por várias horas ou durante a noite. Quando as lâminas estiverem secas, guarde-as em um recipiente hermético com sílica gel a quatro graus Celsius. Desparafinizar as lâminas no dia da microdissecção.

Prepare três potes de vidro Coplin, dois potes que contêm cerca de 50 mililitros de xilenos 100% e um frasco contendo cerca de 50 mililitros de etanol 100%. Mergulhe as lâminas em xilenos um por dois minutos, xilenos dois por dois minutos e 100% de etanol por um minuto. Escorra as lâminas em lenços umedecidos sem fiapos e seque-as ao ar em temperatura ambiente.

Para iniciar este procedimento, prenda as lâminas no estágio do microscópio de microdissecção a laser. Um fator crítico no sucesso da microdissecção a laser em experimentos RNásicos é o uso de marcadores morfológicos e moleculares para selecionar domínios precisos para microdissecção. Examine as lâminas usando uma objetiva de 5X e identifique as cinco seções mais medianas em cada lâmina usando o ápice do meristema apical do broto como ponto de referência central.

Em seguida, use uma objetiva de 10X ou 20X para identificar a posição da lígula no primórdio de sete folhas do plastocrono de cada seção. A lígula será visível como uma protuberância que se projeta da superfície adaxial do primórdio foliar. Use a ferramenta de desenho do software de microdissecção a laser para marcar esta posição.

Selecione o ícone de desenho à mão livre, mova o cursor para a posição apropriada e clique e arraste o mouse para desenhar. O próximo passo é usar a régua e a ferramenta de desenho retangular para medir retângulos de 100 micrômetros de altura centrados em uma lígula de cada seção como amostras de lígula. Para usar a ferramenta de régua, selecione o ícone de régua, mova o cursor para uma extremidade da região a ser medida e clique e arraste para medir a região.

O comprimento da régua será mostrado na tela. Use a ferramenta régua para medir um segmento de 100 micrômetros centrado em uma lígula. Para desenhar um retângulo, selecione a ferramenta de desenho de linha reta e desenhe quatro linhas retas.

Da mesma forma, meça retângulos de 100 micrômetros posicionados 50 micrômetros acima e abaixo do retângulo da lígula. Estas serão as amostras de lâmina e bainha. Microdissecar os retângulos medidos usando a função de corte a laser para cortar a seção de tecido ao longo do contorno do domínio selecionado e a função de catapulta para impulsionar o retângulo do tecido para fora da lâmina para a tampa do tubo.

Colete amostras de lígula, lâmina e bainha em tubos separados. Use o mesmo procedimento para microdissecar amostras epidérmicas adaxiais de lâmina, lígula e bainha de primórdios de sete folhas de plastocrono. Por fim, aplique tampão de extração de RNA no tecido microdissecado e prossiga com a extração de RNA, amplificação de RNA, construção de biblioteca, sequenciamento e análise de bioinformática conforme descrito no manuscrito.

Quando o acúmulo de transcritos foi analisado e todas as camadas celulares das regiões da lâmina, lígula e bainha, foram encontrados 2.359 genes diferencialmente expressos. Nas regiões da lâmina epidérmica adaxial, lígula e bainha, foram encontrados 3.128 genes diferencialmente expressos. Microdissecção a laser, RLM, sequenciamento de RNA e análises de hibridização in situ forneceram resultados consistentes, conforme ilustrado por esses genes representativos.

Os desenhos animados à esquerda ilustram a LM de todas as camadas celulares, e os desenhos à direita ilustram apenas a LM da epiderme adaxial. As pontas das setas nas imagens indicam lígulas emergentes. O acúmulo de transcritos de Ligules one foi significativamente maior na lígula em todas as camadas celulares e LM epidérmico. A bainha estreita um foi significativamente regulada positivamente na região da lígula em todas as camadas celulares LM e na epiderme adaxial LM, e se acumula especificamente na ponta da lígula emergente.

Um gene de função desconhecida teve uma recontagem média mais alta na LM epidérmica da lígula do que em todas as camadas LM. O quarto gene, Zm PIN1a, não foi significativamente expresso diferencialmente na análise de todas as camadas celulares, mas foi significativamente regulado positivamente na lígula na análise somente da epiderme. Sua alta expressão no tecido vascular pode ter confundido as diferenças no acúmulo de transcritos na epiderme quando todas as camadas celulares foram coletadas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a escolha dos domínios celulares para microdissecar e comparar, e a precisão das microdissecações são cruciais para o sucesso dos experimentos.