Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

O objetivo geral deste procedimento é determinar a localização e a estrutura do evento de calcificação realizando uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica. Isso é feito monitorando o verme do tubo larval vivo durante a metamorfose, o estágio de vida responsável pela calcificação que pode ser detectado usando indicadores fluorescentes sensíveis ao pH intracelular e sinais de cálcio. A imagem de pH intracelular nos permite estudar a concentração de prótons dentro e fora do citoplasma no processo de calcificação.

Para começar, a imagem de pH intracelular nas larvas do verme do tubo marinho, as larvas nadadoras competentes são coradas com o corante indicador de pH intracelular, SNARF-1 AM. As larvas são então transferidas para um prato de IBMX contendo água do mar com uma janela de observação de vidro fino e colocadas em um microscópio fluorescente, onde são atingidas por luz a 488 nanômetros de comprimento de onda, que é absorvida pelo corante. São coletadas emissões de 580 nanômetros e 640 nanômetros do corante. Os valores de pH intracelular podem ser calculados a partir das proporções desses valores.

A microscopia óptica permite identificar o tempo e a região do tecido associados a um nível de pH mais alto. Este é o primeiro passo para determinar os pontos de interesse para análise posterior. Na segunda etapa, preservar o sem-fim tubular com fixadores nos pontos de tempo relevantes para a microscopia eletrônica.

Um estágio de vida recém-mineralizante é identificado usando o mapeamento SEM-EDS para sinal de cálcio. Em seguida, as regiões com alto sinal de cálcio são rastreadas usando MEV/EBSD, identificando a presença de mineral cristalino. Finalmente, usando um feixe de íons focalizado, o mineral é cortado, uma seção fina é preparada para observação MET.

Esta seção é usada para obter um padrão de difração de área seletiva. A principal vantagem desta técnica ou de métodos de teste convencionais, como a espectroscopia de difração de raios X em massa, é que ela fornece observação direta de estruturas específicas que foram observadas por métodos de microscopia óptica e eletrônica, portanto, eventos discretos de calcificação podem ser estudados diretamente nos níveis temporal e espacial. Quando a calcificação é estudada com cálcio e indicadores de pH intracelular, podemos identificar a escala de tempo desses eventos fisiológicos relevantes.

Preservar a amostra no momento certo é fundamental para uma análise frutífera de MEV. Ao procurar o primeiro evento de calcificação biológica, o MEV / EDX pode ser usado para rastrear a distribuição elementar do cálcio. Um local que possui mais cálcio pode indicar a presença de carbonato de cálcio, no entanto, apenas a presença de um padrão de difração de raios-X pode confirmar que existe uma estrutura cristalina.

Essas informações podem ser obtidas usando EBSD e TEM. A difração de elétrons retroespalhados é uma técnica de caracterização cristalográfica para identificar material cristalino ou policristalino, desde que a microestrutura e o ângulo REM dos elétrons satisfaçam a condição de difração de Bragg. Normalmente, os elétrons retroespalhados são coletados em um ângulo de inclinação de 70 graus em uma amostra polida com mapas de orientação de grãos ou cristais.

Para uma amostra não polida, gerar esse mapa a partir dessas superfícies irregulares é difícil, porque nem todas as séries de serviço atendem aos requisitos de ângulo EBSD. No entanto, na forma de ponto IG, um padrão de difração de Cacucci ainda pode ser coletado dessas superfícies irregulares, desde que o requisito de ângulo EBSD seja atendido. O padrão de difração de Cacucci fornece confirmação inequívoca de que o mineral cristalino está presente.

Nosso método é direto e rápido, e pode ser implícito em outros tecidos mineralizantes. Aqui, um feixe de íons focalizado é usado para fabricar uma microamostra, que também é um método muito direto de preparar uma seção MET. Para examinar o processo de metamorfose, vermes tubulares foram cultivados em laboratório por cerca de cinco dias.

As larvas competentes nadarão para a frente em vez de um movimento circular. Isso significa que eles estão prontos para a metamorfose. Incubar as larvas competentes na solução fluorescente na água do mar, cobrir os recipientes com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento e incubar os animais durante a noite.

As larvas do verme tubular são lavadas contra a malha de náilon que retém as larvas, mas permite a passagem da solução. Lave as larvas com água do mar filtrada duas vezes para remover o excesso de solução de corante. Pressione o filtro na placa de Petri para criar uma vedação firme antes de liberar a vedação para descartar a solução de lavagem.

Tome cuidado para não secar as larvas. Em seguida, coloque cada uma das 10 a 20 larvas em um prato fino com fundo de vidro com IBMX e cubra o prato até a imagem. Em seguida, insira os cubos de filtro adequados com os espelhos dicróicos apropriados para detectar os sinais fluorescentes.

Otimize o tempo do obturador para ser rápido o suficiente para capturar imagens para um organismo vivo. Em seguida, selecione os parâmetros de seccionamento óptico na opção Z-Stack, mova o estágio microscópico para cima e para baixo para definir a posição inicial e final da aquisição da imagem. Defina uma distância de um micrômetro entre as camadas.

Após a geração de imagens, exporte todos os dados como arquivos TIF em tons de cinza. Isso pode ser feito selecionando Arquivo, Exportar. Certifique-se de que os tipos de arquivo apareçam como imagens TIF e clique em Iniciar.

A imagem em tons de cinza em cada canal, em cada camada do Z-Stack, estará na mesma pasta de imagens, pronta para análise de imagens. Por fim, gere uma imagem composta para cada um dos canais fluorescentes, usando ImageJ. Os vídeos JoVE a seguir demonstram como realizar calibração e medições de pH intracelular.

Preservar os vermes tubulares em metamorfose utilizando um fixador de reticulação, utilizando uma solução de 4% de paraformaldeído em água do mar. Basta misturar uma parte de 16% de paraformaldeído em três partes de água do mar e permitir que a fixação ocorra durante a noite. Descarte o fixador primário e refixe a amostra por 30 minutos em solução aquosa de tetraóxido de ósmio a 1% para estabilizar ainda mais as estruturas do tecido.

Certifique-se de trabalhar em uma capela e ter garrafas de lixo separadas e claramente rotuladas, prepare formaldeídos e tetraóxido de ósmio. Em seguida, desidrate as amostras usando uma série graduada de etanol, permitindo cinco minutos entre as trocas. O próximo passo é desidratar as amostras com uma solução 1:1 de etanol e HMDS, apenas o suficiente para cobrir a amostra.

Aguarde até que a amostra evapore até secar na hotte e repita o procedimento com HMDS puro. Para criar uma fratura controlada da amostra, passe a lâmina de diamante contra o prato, envolvendo alguns indivíduos para fazer um corte triangular. Com a placa de Petri coberta, coloque a placa de cultura contra um toco de alumínio e pressione suavemente para fazer uma fratura controlada.

Observe usando um microscópio de dissecação, pegue cuidadosamente um pedaço de fratura que contenha alguns vermes tubulares intactos. Com tinta prateada, cole a amostra no suporte de amostra SEM, pinte nas bordas com tinta prateada para reduzir o carregamento. A amostra agora está pronta para ser fotografada para análise SEM-EDS.

Insira a amostra no suporte no microscópio. Oriente a amostra e coloque-a embaixo da coluna de elétrons. Analise a amostra no modo VP SEM.

Otimize o foco e o astigmatismo conforme necessário. Selecione a ampliação de modo que um único organismo preencha todo o campo de visão. Analise a distribuição elementar do cálcio na amostra adquirindo um mapa de todo o campo de visão, execute o mapa por 15 minutos ou mais ou até que os dados mostrem uma localização distinta do cálcio dentro do organismo.

Para obter a quantificação de pontos para uma região de interesse, selecione a opção ID do ponto usando a ferramenta Ponto único. Clique na área de interesse para realizar uma varredura. Registre cuidadosamente o local capturando uma série de imagens com ampliações decrescentes.

Para preparar as amostras para EBSD, remova a amostra do suporte plano de SEM e cole-a em um topo pré-inclinado de 45 graus usando tinta prateada. Usando as imagens de referência do SEM, localize o animal de interesse e a região exata do animal a ser examinado. Incline o estágio 25 graus para que a superfície da amostra esteja agora a aproximadamente 70 graus em relação ao feixe de elétrons.

Levante o palco. Selecione o modo EBSD no software AZtec. Escolha a aragonita como as fases de interesse.

Insira a câmera EBSD, defina as condições da câmera para obter um sinal de cerca de 90%Usando um raster de feixe rápido, adquira um plano de fundo e capture uma imagem em asteca. Usando a ferramenta Análise Pontual, clique no local da amostra que mostrou um sinal de cálcio mais alto. Digitalize para ver se os padrões de Cacucci são detectados.

Se os padrões estiverem presentes e corresponderem a qualquer uma das fases selecionadas no banco de dados, eles serão indexados automaticamente. Proteja a amostra de MEV preparada com uma camada de platina por revestimento por pulverização catódica antes de prosseguir com a preparação da microamostra usando feixe de íons focalizado. Insira a amostra na câmara FIB SEM, posicione a amostra e adquira uma imagem de elétrons secundários induzida por íons ao vivo.

Localize a área de interesse das imagens referenciadas conforme determinado anteriormente pelo mapeamento EDS no EBSD. Gire o palco conforme necessário para alinhar os recursos de interesse com a moldura da janela, ajuste a ampliação para mostrar a área para acomodar os recursos de interesse e, em seguida, defina uma caixa para depositar carbono e tungstênio. Capture um instantâneo FIB e, em seguida, desenhe um padrão de quatro caixas ao redor da tampa de tungstênio para definir o local da microamostragem.

Em seguida, incline o palco em 58 graus e corte a parte inferior da microamostra. Incline o stage de volta a zero, insira a sonda de microamostragem de tungstênio e abaixe-a até que entre em contato com a amostra. Conecte a sonda de tungstênio e a amostra depositando tungstênio entre a ponta da sonda e o revestimento de tungstênio, em seguida, faça o corte final, retire a microamostra do resto da ilha e levante a sonda com a microamostra anexada.

Coloque uma meia grade de cobre MET em um suporte de entrada lateral, abaixe a sonda de tungstênio até que a microamostra entre em contato com a grade MET. A microamostra é moída até se tornar transparente para elétrons. Antes da análise MET, encha ambos os dewars com nitrogênio líquido e ajuste a tensão de aceleração para 300 quilovolts.

Coloque a meia grade com as lamelas anexadas no suporte padrão do MET. Centralize o feixe na tela de fósforo, contraia e expanda o feixe e certifique-se de que todo o movimento do feixe seja concêntrico. Use os botões de movimento do palco para navegar e localizar a amostra, aumentar a ampliação na amostra e ajustar a altura Z até que a amostra esteja em foco.

Use as oculares ópticas conforme necessário. Insira a câmera e remova a tela de fósforo. Expanda o feixe conforme necessário para evitar a saturação excessiva da câmera.

Ajuste o foco e os parâmetros da câmera para capturar uma imagem. Para adquirir um padrão de difração, centralize o recurso de interesse, remova a abertura da objetiva e insira a abertura de difração. Mude para o modo de lente de difração.

Insira o blanker para evitar que o centro do padrão de difração queime a câmera ou a tela de fósforo. Capture uma imagem do padrão para análise cristalográfica. A seguir estão algumas observações do processo de calcificação durante a metamorfose do verme tubular.

Os valores de pH dos vermes tubulares aumentaram após a estimulação da metamorfose do IBMX e o pH intracelular começou a aumentar além de oito em 31 horas. O tecido relevante para a calcificação é a região do colarinho. Um mapa nos sinais SEM-EDS mostra que o verme tubular do primeiro dia tinha uma distribuição homogênea de cálcio, indicando que o processo de calcificação ainda não havia começado.

Dois dias após a estimulação da metamorfose, alguns vermes tubulares já haviam calcificado demais e não são mais adequados para observar materiais recém-calcificados. Em um espécime de verme tubular, como o usado neste exemplo, a calcificação ainda está em seu estágio inicial, então a quantificação do cálcio ajudou a determinar o local de interesse para caracterizar a presença de minerais. Quando examinada usando SEM-EBSD, a área localizada com o forte sinal de cálcio também tinha uma estrutura cristalina de aragonita.

Usando feixe de íons focalizados, o espécime foi preparado para MET e o padrão de difração do mineral aragonita foi analisado em maior detalhe cristalográfico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como localizar um evento de mineralização em um organismo multicelular. Quando a microscopia óptica e eletrônica são usadas juntas, podemos adquirir um grande nível de compreensão fisiológica e material sobre o processo de calcificação.