Name: Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Aprenda a caracterizar eventos de calcificação em Hydroides elegans usando microscopia óptica e eletrônica. Este método combina indicadores fluorescentes de pH intracelular e cálcio para análise detalhada da biomineralização em vermes marinhos.

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Os autores gostariam de enviar um grande agradecimento à Clemson Broadcast Productions, gravação de áudio de J. Bright, narração de A. D. McQuiston, adoçamento de áudio, K. Murphy, videografia de G. Spake, artes gráficas de T. Messervy, edição de vídeo de T. Messervy e E. Rodgers. A assistência técnica e o aconselhamento científico foram inspirados pelos conselhos de S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane e R. Dineshram. Este estudo foi financiado por três bolsas GRF do HKSAR-RGC (números de concessão: 705511P, 705112P e 17304914).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

imagiologia óptica vivo é um método útil para a observação de eventos celulares em um organismo multicelular. Aqui, os indicadores de pH e de iões de cálcio internos foram usados ​​para medir o fluxo de iões nos locais de mineralização. Nestas regiões, bombeamento ião activo é necessário para elevar o pH e a concentração de Ca2 + para permitir a calcificação 2, 3. Ao aplicar moléculas fluorescentes para estudar um organismo, que é crítico para assegur...

Biomineralização é uma complexa série de eventos, que liga um conjunto de actividades celulares, resultando na produção de minerais primorosamente pedidos 1. O desafio é caracterizar tanto o processo celular dinâmica e as estruturas minerais sofisticados usando uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica. Uma elevação do pH intracelular favorece a formação de cristais de CaCO3, por isso, identificando o estágio de vida, que tem um aumento de pH revela o tempo quando calcificação é susceptível de ser de ocorrência 2, 3. Os vermes tubulares da família Serpulidae são calcificadores comuns no oceano 4. É também um modelo de invertebrado marinho popular para investigação, especialmente na bio-incrustação 5, 6. Neste estudo, o processo de calcificação nos compartimentos mineralizantes during biomineralização é observado. O rápido processo de metamorfose inclui o aparecimento de estruturas de carbonato de cálcio 7, 8. Demonstramos como medições de pH interno pode ser realizada na tubeworm, e como fases da vida e tecidos relevantes para a calcificação pode ser rastreada. Após a fase de vida de interesse é identificado, o tecido responsável pela calcificação pode ser caracterizado em uma resolução maior utilização de métodos de microscopia eletrônica. Utilizando microscopia de fluorescência, determina-se o tempo necessário para o carbonato de cálcio a aparecer após a indução metamórfica. Um estágio de vida semelhante foi posteriormente visualizados com SEM-EDS para distribuição composição elementar, eo mineral depositado foi analisada utilizando dois métodos de microscopia eletrônica diferentes, especificamente SEM-EBSD e FIB-TEM.

<table><tbody><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio 2% Solução Aquosa</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina, Ácido Livre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 35 mm de diâmetro, tamanho do furo 27 mm, Vidro No.0, Sem revestimento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, éster acetoximetílico, acetato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH Cloreto de potássio, grau ACS</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído grau de reagente, cristalino</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M Ácido clorídrico para análise volumétrica</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>0,05 M Solução de hidróxido de sódio para análise volumétrica</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm de diâmetro, 0,45 &micro; m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>Água do mar artificial para tampões</td><td></td><td></td><td>por SOP06 do DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sódio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol (tris)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-aminopiridina</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH Orion 5 estrelas Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Micro Combinação Eletrodo de pH 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, Versão 4.6, Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td> ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA HRTEM H500 Hitachi SU6600 VPSEM Hitachi NB5000 Sistema de Feixe de Elétrons <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> e Íons Focalizados (FIB-SEM) Hitachi&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de calcificação eventos usando o live Óptica e microscopia eletrônica de técnicas em um tubeworm marinha

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caracterizar o primeiro evento de produção biológica de carbonato de cálcio requer uma combinação de abordagens de microscopia. Primeiro, a distribuição do pH intracelular e os íons de cálcio podem ser observados usando microscopia ao vivo ao longo do tempo. Isso permite a identificação do estágio de vida e do tecido com a característica de interesse para estudos adicionais de microscopia eletrônica. O estágio de vida e os tecidos de interesse são tipicamente mais altos em sinais de pH e Ca. 
Aqui, usando H. elegans, apresentamos um protocolo para caracterizar a presença de estruturas de carbonato de cálcio em um espécime biológico no microscópio eletrônico de varredura (MEV), usando espectroscopia de raios-X por dispersão de energia (EDS) para visualizar a composição elementar, usando difração de retroespalhamento de elétrons (EBSD) para determinar a presença de estruturas cristalinas e usando microscopia eletrônica de transmissão (MET) para analisar a composição e estrutura do material. Neste protocolo, um feixe de íons focalizado (FIB) é usado para isolar amostras com dimensão adequada para análise de MET. Como a FIB é uma técnica específica do local, demonstramos como as informações das técnicas anteriores podem ser usadas para identificar a região de interesse, onde os sinais de Ca são mais altos.

A seguir estão algumas observações do processo de calcificação durante a metamorfose da tubeworm. A Figura 1 mostra que os valores de pH perto da região de gola é mais elevado do que os outros tecidos após a metamorfose. Figura 2i mostra uma tubeworm com distribuição homogénea do Ca, sugerindo sem grandes eventos de calcificação começaram; Figura 2ii mostra uma tubeworm que calcificada por um longo período, o que sugere a calcificação fo...

Demonstramos o uso de vários métodos de microscopia que são úteis na observação da calcificação de um verme tubular, Hydroides elegans, bem como na localização e caracterização do primeiro material calcificado. A microscopia ao vivo e a microscopia eletrônica são usadas juntas para fornecer informações funcionais e materiais que são importantes no estudo da biomineralização.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a localização e a estrutura do evento de calcificação realizando uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica. Isso é conseguido monitorando a larva viva do verme tubular durante a metamorfose, o estágio de vida responsável pela calcificação, que pode ser detectado usando indicadores fluorescentes sensíveis aos sinais intracelulares de pH e cálcio. A imagem do pH intracelular permite-nos estudar a concentração de prótons entrando e saindo do citoplasma no processo de calcificação.Para começar, na imagem do pH intracelular em larvas de verme marinho tubular, as larvas natatórias competentes são coradas com o corante indicador de pH intracelular, SNARF-1 AM. As larvas são então transferidas para uma placa contendo água do mar com IBMX e uma janela de observação de vidro fino, e colocadas sob um microscópio fluorescente, onde são iluminadas com luz de comprimento de onda de 488 nanômetros, absorvida pelo corante. As emissões de 580 nanômetros e 640 nanômetros provenientes do corante são coletadas. Os valores de pH intracelular podem ser calculados a partir das razões entre esses valores.A microscopia óptica permite identificar o tempo e a região do tecido associados a um nível mais alto de pH. Esta é a primeira etapa para determinar os pontos temporais de interesse para análises posteriores. Na segunda etapa, conserve a larva tubular com fixadores nos pontos temporais relevantes para microscopia eletrônica.Um novo estágio de vida em mineralização é identificado utilizando mapeamento por SEM-EDS para o sinal de cálcio. Em seguida, as regiões com sinal elevado de cálcio são analisadas por SEM/EBSD, identificando a presença de mineral cristalino. Por fim, utilizando um feixe de íons focado, o mineral é extraído e uma seção fina é preparada para observação em MET.Esta seção é utilizada para obter um padrão de difração de área seletiva. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos de ensaio convencionais, como a espectroscopia de difração de raios X em massa, é que ela fornece observação direta de estruturas específicas que foram observadas por métodos de microscopia óptica e eletrônica; assim, eventos discretos de calcificação podem ser estudados diretamente em níveis temporal e espacial. Quando a calcificação é estudada com indicadores de cálcio e pH intracelular, podemos identificar a escala de tempo desses eventos fisiológicos relevantes.Preservar a amostra no momento certo é essencial para uma análise de MEV bem-sucedida. Ao procurar o primeiro evento de calcificação biológica, o MEV/EDX pode ser usado para analisar a distribuição elementar de cálcio. Um local com maior quantidade de cálcio pode indicar a presença de carbonato de cálcio; no entanto, somente a presença de um padrão de difração de raios X pode confirmar que há uma estrutura cristalina.Essas informações podem ser obtidas utilizando EBSD e TEM. A difração de elétrons retroespalhados é uma técnica de caracterização cristalográfica utilizada para identificar materiais cristalinos ou policristalinos, desde que a microestrutura e o ângulo de REM de elétrons satisfaçam a condição de difração de Bragg. Tipicamente, elétrons retroespalhados são coletados em uma inclinação de 70 graus em um espécime polido, com mapas de orientação de grãos ou cristais.Para uma amostra não polida, gerar tal mapa a partir dessas superfícies irregulares é difícil, porque nem todas as séries de superfície atendem aos requisitos angulares de EBSD. No entanto, na forma de ponto IG, um padrão de difração de Cacucci ainda pode ser coletado a partir dessas superfícies irregulares, desde que o requisito angular de EBSD seja satisfeito. O padrão de difração de Cacucci fornece confirmação inequívoca de que o mineral cristalino está presente.Nosso método é direto e rápido, e pode ser aplicado a outros tecidos mineralizados. Aqui, um feixe de íons focalizado é usado para fabricar uma microamostra, o que também é um método muito direto de preparar uma seção de MET. Para examinar o processo de metamorfose, minhocas-tubo foram cultivadas em laboratório por cerca de cinco dias.As larvas competentes nadarão em direção anterior em vez de um movimento circular. Isso indica que estão prontas para a metamorfose. Incube as larvas competentes na solução fluorescente em água do mar, cubra os recipientes com papel alumínio para evitar o desbotamento pela luz e incube os animais durante a noite.As larvas de verme tubular são lavadas contra uma malha de náilon que reterá as larvas, mas permitirá a passagem da solução. Lave as larvas duas vezes com água do mar filtrada para remover o excesso de solução do corante. Pressione o funil contra a placa de Petri para criar um selo apertado antes de liberar o selo e descartar a solução de lavagem.Tenha cuidado para não desidratar as larvas. Em seguida, coloque cada uma das 10 a 20 larvas em um recipiente com fundo de vidro fino contendo IBMX e cubra o recipiente até a aquisição de imagens. A seguir, insira os cubos de filtro apropriados com os espelhos dicróicos adequados para detectar os sinais fluorescentes.Otimize o tempo de obturação para ser rápido o suficiente para capturar imagens de um organismo vivo. Em seguida, selecione os parâmetros de seccionamento óptico na opção Z-Stack, mova o estágio do microscópio para cima e para baixo para definir as posições inicial e final da aquisição de imagens. Defina uma distância de um micrômetro entre as camadas.Após a aquisição de imagens, exporte todos os dados como arquivos TIF em escala de cinza. Isso pode ser feito selecionando Arquivo, Exportar. Certifique-se de que os tipos de arquivo apareçam como imagens TIF e, em seguida, clique em Iniciar.A imagem em escala de cinza em cada canal, em cada camada da pilha Z, estará na mesma pasta de imagens, pronta para análise de imagem. Por fim, gere uma imagem composta para cada um dos canais fluorescentes, utilizando o ImageJ. Os seguintes vídeos do JoVE demonstram como realizar calibração e medições para o pH intracelular.Preserve as larvas tubulares em metamorfose utilizando um fixador de reticulação, com uma solução de 4% de paraformaldeído em água do mar. Basta misturar uma parte de paraformaldeído a 16% com três partes de água do mar e deixar a fixação ocorrer durante a noite. Descarte o fixador primário e refixe o espécime por 30 minutos em solução aquosa de 1% de tetróxido de ósmio para estabilizar ainda mais as estruturas teciduais.Certifique-se de trabalhar em uma capela de exaustão e de ter frascos separados para resíduos devidamente rotulados, preparando formaldeído e tetróxido de ósmio. Em seguida, desidrate as amostras utilizando uma série crescente de etanol, com intervalos de cinco minutos entre cada troca. O próximo passo é desidratar as amostras com uma solução 1:1 de etanol e HMDS, na quantidade suficiente para cobrir o espécime.Aguarde a amostra secar por evaporação na câmara de fluxo laminar e, em seguida, repita o procedimento com HMDS puro. Para criar uma fratura controlada da amostra, passe a lâmina de diamante sobre a placa, envolvendo alguns indivíduos para fazer um corte triangular. Com a placa de Petri tampada, posicione o recipiente de cultura contra um suporte de alumínio e pressione suavemente para provocar uma fratura controlada.Observe utilizando um microscópio estereoscópico, levante cuidadosamente um fragmento de fratura que contenha alguns vermes tubulares intactos. Com tinta de prata, fixe a amostra ao suporte da amostra para MEV, pintando as bordas com tinta de prata para reduzir o acúmulo de carga. A amostra está agora pronta para ser analisada por MEV-EDS.Insira a amostra no suporte no microscópio. Oriente a amostra e posicione-a abaixo da coluna eletrônica. Analise a amostra no modo MEV de pressão variável.Optimize o foco e o astigmatismo conforme necessário. Selecione a magnificação de modo que um único organismo preencha todo o campo de visão. Analise a distribuição elementar de cálcio na amostra adquirindo um mapa de todo o campo de visão; execute o mapa por 15 minutos ou mais, ou até que os dados mostrem uma localização distinta de cálcio dentro do organismo.Para obter a quantificação pontual de uma região de interesse, selecione a opção ID do Ponto utilizando a ferramenta de Ponto Único. Clique na área de interesse para realizar um escaneamento. Registre cuidadosamente a localização capturando uma série de imagens com reduções de magnificação progressivas.Para preparar as amostras para EBSD, remova a amostra do suporte plano do MEV e fixe-a em um suporte pré-inclinado a 45 graus utilizando tinta de prata. Usando as imagens de referência do MEV, localize o animal de interesse e a região exata do animal a ser examinada. Incline o estágio em 25 graus, de modo que a superfície da amostra fique agora aproximadamente a 70 graus em relação ao feixe de elétrons.Eleve a platina. Selecione o modo EBSD no software AZtec. Escolha a aragonita como as fases de interesse.Insira a câmera EBSD, ajuste as condições da câmera para obter um sinal de cerca de 90%. Usando uma varredura rápida do feixe, adquira um fundo e, em seguida, capture uma imagem no Aztec. Com a ferramenta de Análise Pontual, clique na posição da amostra que apresentou um sinal mais alto de cálcio. Faça uma varredura para verificar se padrões de Cacucci são detectados.Se estiverem presentes padrões que correspondam a qualquer das fases selecionadas no banco de dados, eles serão automaticamente indexados. Proteja o espécime de MEV preparado com uma camada de platina por meio de pulverização catódica antes de prosseguir para a preparação da microamostra utilizando feixe de íons focado. Insira a amostra na câmara de MEV com FIB, posicione a amostra e obtenha uma imagem ao vivo de elétrons secundários induzidos por íons.Localize a área de interesse a partir das imagens de referência previamente determinadas pelo mapeamento EDS no EBSD. Gire o estágio conforme necessário para alinhar as características de interesse com o quadro da janela, ajuste a ampliação para exibir a área de forma a acomodar as características de interesse e, em seguida, defina uma caixa para depositar carbono e tungstênio. Capture uma imagem instantânea de FIB e, depois, desenhe um padrão de quatro caixas ao redor da tampa de tungstênio para definir a localização da microamostragem.Em seguida, incline a platina em 58 graus e corte a parte inferior da microamostra. Retorne a platina à posição zero, insira a sonda microanalítica de tungstênio e abaixe-a até que entre em contato com a amostra. Conecte a sonda de tungstênio à amostra depositando tungstênio entre a ponta da sonda e o revestimento de tungstênio, faça o corte final, separe a microamostra do restante da ilha e levante a sonda com a microamostra acoplada.Coloque uma grade de cobre de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) em um suporte de entrada lateral, abaixe a sonda de tungstênio até que a microamostra entre em contato com a grade de TEM. A microamostra é então usinada até se tornar transparente aos elétrons. Antes da análise em TEM, encha ambos os dewars com nitrogênio líquido e ajuste a tensão de aceleração para 300 quilovolts.Coloque a grade metade com lâminas acopladas no suporte padrão de MET. Centralize o feixe na tela de fósforo, contraia e expanda o feixe e certifique-se de que todo movimento do feixe seja concêntrico. Utilize os botões de movimentação da platina para navegar e localizar a amostra, aumente a magnificação sobre a amostra e ajuste a altura Z até que a amostra esteja em foco.Utilize as lentes oculares conforme necessário. Insira a câmera e remova a tela de fósforo. Amplie o feixe conforme necessário para evitar a saturação excessiva da câmera.Ajuste o foco e os parâmetros da câmera para capturar uma imagem. Para adquirir um padrão de difração, centralize a característica de interesse, remova a abertura objetiva e insira a abertura de difração. Altere para o modo Lente de Difração.Insira o bloqueador para evitar que o centro do padrão de difração queime a câmera ou a tela de fósforo. Capture uma imagem do padrão para análise cristalográfica. A seguir, algumas observações do processo de calcificação durante a metamorfose do verme tubular.Os valores de pH dos vermes tubulares aumentaram após a estimulação da metamorfose com IBMX e o pH intracelular começou a aumentar além de oito às 31 horas. O tecido relevante para a calcificação é a região do colarinho. Um mapa dos sinais de MEV-EDS mostra que o verme tubular do primeiro dia apresentava uma distribuição homogênea de cálcio, indicando que o processo de calcificação ainda não havia começado.Dois dias após a estimulação da metamorfose, alguns vermes tubulares já haviam calcificado em excesso e não eram mais adequados para observar materiais recém-calcificados. Em um espécime de verme tubular, como o utilizado neste exemplo, a calcificação ainda está em estágio inicial, de modo que a quantificação de cálcio auxiliou na determinação da localização de interesse para caracterizar a presença de minerais. Ao ser examinada por MEV-EBSD, a área localizada com forte sinal de cálcio também apresentava uma estrutura cristalina de aragonita.Utilizando feixe de íons focado, o espécime foi preparado para MET e o padrão de difração do mineral aragonita foi analisado com maior detalhe cristalográfico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como localizar um evento de mineralização em um organismo multicelular. Quando a microscopia óptica e a microscopia eletrônica são usadas em conjunto, podemos obter um alto nível de compreensão fisiológica e material sobre o processo de calcificação.

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Biologia

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Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

Aqui, os protocolos para executar a imagem latente do tomography computado do raio X do microfoco (microct) de três animais marinhos do invertebrados são explicados em detalhe. Este estudo descreve etapas tais como a fixação da amostra, a mancha, a montagem, a exploração, a reconstrução da imagem, e as análises de dados. Sugestões sobre como o protocolo pode ser ajustado para diferentes amostras também são fornecidos.

Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Relatado aqui é um sistema de imagem de cálcio em se comportar livremente Caenorhabditis elegans com vibração bem controlada e não localizada. Este sistema permite que os pesquisadores evoquem vibrações não localizadas com propriedades bem controladas no deslocamento em nanoescala e quantifiquem as correntes de cálcio durante as respostas de C. elegans às vibrações.

Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotofilosiologia fotossiológica II e produtividade primária. Aqui descrevemos um protocolo para medir a fotofisiologia PSII de algas epizoicas, Colacium sp. em zooplâncton substrato usando FRRf tipo cuvette.

Medindo fotofisiologia do estágio anexado de Colacium sp. por um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.

Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

Aqui, apresentamos protocolos e ferramentas para visualizar o cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial usando um repórter de cálcio geneticamente codificado expresso na linha germinativa do nematóide modelo C. elegans.

Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

Aprenda a caracterizar eventos de calcificação em Hydroides elegans usando microscopia óptica e eletrônica. Este método combina indicadores fluorescentes de pH intracelular e cálcio para análise detalhada da biomineralização em vermes marinhos.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

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