Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de pólipos de coral de um a dois milímetros de espessura em 3D para entender a estrutura fina, bem como os pigmentos de coral e sua localização. Isso é conseguido primeiro incorporando a amostra em cera e, em seguida, cortando a amostra em seções de um mícron usando um micrótomo. Em seguida, uma técnica de face de bloco serial projetada sob medida é usada para obter imagens dos pólipos de coral e reconstruir a imagem 3D.

Usando várias imagens 2D, são obtidos resultados que mostram a capacidade da técnica de resolver detalhes estruturais finos do tecido do coral sem comprometer sua integridade estrutural. Demonstrando o procedimento. Hoje será o Dr. Maunde Siva guru, um colaborador do meu grupo de pesquisa.

Para preparar a cera de pré-filtração, derreta 3,6 gramas de novilho em flocos em um copo de vidro em uma placa quente. Em seguida, adicione 400 miligramas de Sudão. Quatro para minimizar a fluorescência do fundo da cera, misture bem e espere até que uma solução translúcida vermelha seja obtida.

Em seguida, adicione 81 gramas de parafina e misture bem. Em seguida, adicione 15 gramas de barra VI granular branca e derreta completamente no mesmo copo. Depois de derretido, misture novamente para obter uma solução de cera completamente misturada.

Agora adicione a mistura a uma garrafa de vidro e feche frouxamente com uma tampa. Coloque a garrafa de vidro em um forno de convecção a 60 graus Celsius para manter os ingredientes em estado líquido e para que todas as infiltrações ocorram. Esta solução pode ser feita em 200 mililitros e dividida em duas garrafas de 100 mililitros.

Um para a infiltração e outro para incorporação final, amostras de corais de construção de recifes caribenhos foram coletadas da UA e fixadas em paraformaldeído no campo. Para incorporar os tecidos de coral para SBFI, primeiro lave os pólipos de coral coletados no campo e armazene-os a quatro graus Celsius em paraformaldeído. Depois, lave-os em PB S3 vezes por cinco minutos de cada vez, quando estiverem prontos para serem fotografados.

Descalcificar os pólipos em solução ex Cal dois durante 24 horas ou até que os pólipos estejam totalmente desprovidos de carbonato de cálcio. Incube vários pólipos de coral descalcificados como um único bloco em uma série de 25, 50, 75 e 100% de etanol seguido por um x xileno. Substitua por 30 minutos em cada sessão para desidratar as amostras.

Em seguida, coloque os pólipos processados em xileno 100%. Substitua em forno a 65 graus Celsius por 30 minutos. Depois, substitua por uma solução nova e incube por mais 30 minutos.

Oriente os pólipos com os topos voltados para baixo e a superfície o mais plana possível. Faça soluções de dois para um, um para um e um para dois. Substituto de xileno e cera de pré-filtração.

Em tubos Falcon de 50 mililitros, incube os pólipos de coral com essas três concentrações crescentes de cera de pré-filtração, seguidas por três incubações em cera de pré-filtração a 100% por 30 minutos a uma hora de cada vez. Agora transfira a amostra para a cera de incorporação. Remova a cera de incorporação após 30 minutos, substitua por cera de incorporação nova e continue a incubação por no mínimo quatro horas a 65 graus Celsius.

Depois, fotografe o quarteirão. Isso é necessário porque, uma vez incorporada na cera, a localização da amostra se tornará invisível, pois a cera vermelha incorporada é opaca. Em seguida, coloque pequenas gotas de cera de alto ponto de fusão ao redor do novo molde de incorporação de aço inoxidável pré-aquecido e deixe-o esfriar.

Despeje um pequeno volume de cera recém-derretida e de cama da segunda alíquota e posicione o pólipo de coral voltado para baixo sobre o ponto de cera branca rapidamente. Em seguida, coloque um porta-amostras de plástico na bandeja de aço inoxidável e despeje mais cera de incorporação para que a cera chegue à superfície do molde de plástico. Agora retire toda a configuração do forno a 65 graus Celsius e deixe esfriar em uma bancada ou superfície fria até que a cera endureça completamente.

Depois disso, coloque o bloco desidratado em uma geladeira a quatro graus Celsius, protegido da luz para armazenamento de longo prazo para seccionar o bloco. Primeiro, corte-o e corte seções de um mícron. Usando um micrótomo, capture a imagem da face do bloco liso, que contém a amostra.

Todas as vezes. Quando uma seção é removida, a amostra aparece quando a cera branca começa a desaparecer. Em seguida, capture as imagens com uma câmera monocromática usando um filtro fluorescente fitzy para captar a autofluorescência dos cromatóforos ou imagem de pólipo de coral, três a quatro núcleos descalcificados de cada amostra.

Para realizar imagens de fluorescência de dois fótons, coloque os núcleos de pólipos de coral lavados em formaldeído a 4% de cabeça para baixo em um prato de fundo de vidro coberto usando um laser de dois fótons a 780 nanômetros de imagem de excitação de três a quatro pólipos em duas ampliações diferentes usando uma objetiva de 10 x. Em seguida, use o modo de varredura de bloco para coletar aproximadamente 25 a 100 imagens por plano focal em XY em intervalos de 10 ou 20 mícrons. Em seguida, colete de 50 a 100 imagens através do eixo Z em intervalos de 10 ou 20 mícrons, o que será em torno de 5.000 a 10.000 imagens no total por pólipo de coral.

Após essa imagem, três a quatro áreas de pólipos para representar um núcleo e uma espécie de coral. Em seguida, armazene todas as imagens em formato de dados brutos no disco rígido do sistema. Neste procedimento, corte os dados 2D para reduzir o tamanho do arquivo, concentrando-se em um único pólipo usando a ferramenta de corte quadrado e compile-o como um único arquivo TIF.

No software de aquisição. Abra os arquivos montados dos dados SBFI ou as múltiplas pilhas Z lado a lado de duas seções ópticas de fótons no módulo do programa EMERIS superam no projeto de algoritmo de volume, os dados SBFI renderizados em 3D. Usando uma projeção de sombra, crie um modo ISOSURFACE em que os voxels são threshold para criar um padrão de superfície sólida.

Visualize as projeções 3D usando um algoritmo simples de recorte nos modos ortogonais XY, xz e YZ para revelar a estrutura 3D e a forma dos corais. Em seguida, anime as projeções usando um módulo de animação de quadro-chave. No mesmo programa erris, gere arquivos de vídeo com compactação de 5% e gere clipes de filme em formato VI usando as modalidades de volume 3D e isosuperfície.

Aqui estão as duas imagens 3D de fluorescência de fótons de pólipos de coral de M Anis e M fa Lata. Essas duas imagens foram capturadas sem separação espectral de componentes usando excitação de 780 nanômetros do laser de dois fótons com o sinal óptico coletado de 450 a 700 nanômetros, e essas duas imagens foram coletadas com a mesma excitação, mas dois detectores de tubo fotomultiplicador foram usados simultaneamente para coletar os dados de dois componentes, um de 500 a 550 nanômetros e outro de 650 a 720 nanômetros. Estas são imagens revestidas de profundidade.

O vermelho é o mais raso e o azul são os componentes mais profundos em 2D. Sim. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar a amostra de cera vermelha incorporada adequadamente. A combinação de imagens faciais em bloco serial e microscopia fluorescente de dois pés permite a análise da pigmentação do coral e da estrutura celular em uma variedade de escalas de lentes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como lidar e visualizar os corais construtores de recifes e suas propriedades espectrais em três dimensões.