Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

O objetivo geral deste procedimento é isolar células satélites de músculos representativos originados a partir do primeiro, segundo e quarto arcos branquiais, para seu cultivo em uma matriz extracelular. Manchas de gel. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos músculos masseter, digástrico e levantador do véu palatino de uma rata jovem adulta.

No segundo passo, as células satélites de cada amostra muscular são isoladas por digestão enzimática, e duração. As células são então cultivadas em géis de matriz extracelular. Em última análise, o estado dinâmico da miogênese das culturas de células satélites pode ser acompanhado por meio de coloração para os marcadores musculares de interesse.

A fissura labial e palatina é uma das malformações craniofaciais mais comuns em humanos. Quando há uma fissura, é necessária uma correção cirúrgica para fechar o defeito e permitir o desenvolvimento normal da fala. No entanto, a fibrose e a regeneração muscular defeituosa podem comprometer a recuperação funcional dos músculos do palato mole. Após a correção da fissura palatina, pode-se demonstrar um método inovador para o cultivo de células satélites recém-isoladas, utilizando revestimentos de gel de matriz extracelular em manchas de tamanho milimétrico.

Isso evita a necessidade de expansão. Um dia antes do isolamento, coloque oito lâminas com câmara de poços em uma placa de Petri de 100 milímetros e transfira a placa para uma superfície fria. Após 10 minutos, use uma micropipeta pré-cheia para dispensar uma única gota de 10 µL de gel de matriz extracelular em cada poço.

Após resfriar as lâminas por mais sete minutos, remova completamente o gel restante e seque os poços a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Para dissecar o músculo masseter, remova a pele da cabeça de um rato com nove semanas de idade e use agulhas hipodérmicas para fixar a cabeça de lado. Sobre uma placa de silicone, isole a glândula parótida e o nervo facial e remova a glândula.

Em seguida, utilizando uma lâmina de bisturi número 15, remova cuidadosamente o nervo facial. Identifique a cabeça superficial do músculo masseter. A seguir, use uma pinça reta para separar o tendão de sua origem no processo zigomático, seguido pelo corte cuidadoso do tendão com tesoura de dissecação.

Usando o bisturi, dissecar a porção superficial do músculo masseter até sua inserção no ângulo e metade inferior da superfície lateral do ramo da mandíbula. Para dissecar o ventre posterior do músculo digástrico, fixar a cabeça em posição supina com agulhas e remover a gordura subcutânea que recobre as glândulas sublingual e submandibular. Expor os ventres anterior e posterior do músculo digástrico, então, segurando o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, cortar e dissecar cuidadosamente o tendão até sua origem na bolha timpânica.

Para dissecar o músculo levatador palatino, localize o músculo estilofaríngeo. Puxe-o lateralmente e remova cuidadosamente o tecido muscular. Em seguida, localize o tendão do levatador palatino que se insere na bolha timpânica e dissecione-o com cuidado.

Em seguida, levante o esôfago de trás da traqueia. Identifique a região do palato mole onde o músculo levatador do palato está inserido e corte-o solto. Em seguida, submerja o músculo em etanol 70% e transfira-o para PBS frio adicionado de antibióticos.

Para isolar as células satélites, transfira cada músculo para poços individuais de uma placa de seis poços e corte os tecidos em pequenos fragmentos de dois milímetros. Tendo cuidado para não picar os músculos em excesso. Em seguida, incube cuidadosamente os fragmentos de tecido em 2,5 mililitros de solução de pronase 0,1% por poço a 37 graus Celsius durante 60 minutos, com agitação suave a cada 20 minutos.

Quando os feixes de fibras do Exemplo A apresentarem aparência solta, adicione 2,5 mililitros de DMEM suplementado com soro de cavalo e antibióticos a cada poço e transfira os tecidos digeridos para tubos cónicos individuais de 15 mililitros. Centrifugue as suspensões teciduais e remova os sobrenadantes. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio a cada tubo e homogeneíze o tecido com uma pipeta plástica de 10 mililitros.

Centrifugue novamente os tecidos e transfira os sobrenadantes para novos tubos cónicos de 15 mililitros. Em seguida, adicione mais cinco mililitros de meio aos tubos e triture novamente os fragmentos de tecido até que os pedaços passem facilmente pela pipeta. Após outra centrifugação, recolha os sobrenadantes nos tubos correspondentes apropriados e filtre as suspensões celulares através de filtros de 40 micrômetros para tubos individuais de 50 mililitros.

Lave os filtros com um mililitro de DMEM para recuperação máxima das células. Em seguida, centrifugue as células, re-suspenda os pellets em meio fresco e conte as células para cultivar os mioblastos isolados. A seguir, dilua as suspensões celulares para 1,5 vezes 10 elevado a três células por 10 microlitros de meio de cultura.

Em seguida, adicione 10 microlitros de células sobre cada ponto de gel de matriz extracelular previamente preparado e incube os géis a 37 graus Celsius após seis horas. Adicione cuidadosamente 400 microlitros de meio de cultura a cada ponto de gel e retorne as lâminas ao incubador. Após três dias, inicie a diferenciação das células com a adição do meio de cultura apropriado imediatamente após o isolamento.

Mais de 90% das células satélites recém-isoladas expressam Pax7. No quarto dia, Pax7 e MyoD são expressos pelas células satélites de todos os grupos musculares. MyoG é altamente expresso no sétimo dia em todos os grupos musculares. Quatro dias após a semeadura na matriz extracelular, pontos em gel, as células proliferativas começam a se fundir e formar pequenos miotubos multinucleados, que expressam cadeia pesada da miosina no sétimo e décimo dia.

Mios tubos longos e bem organizados são evidentes no dia 10. Também pode-se observar a contração espontânea dos mios tubos. Este protocolo permite o estudo de células satélites originadas de músculos da cabeça de brer e oferece novas possibilidades para o tratamento de fissura palatina.