Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

O objetivo geral deste procedimento é isolar células satélites de músculos representativos originários do primeiro, segundo e quarto arcos braquiais para sua cultura em uma matriz extracelular. Manchas de gel. Isso é conseguido dissecando primeiro os músculos do massacre, digástrico e levada vili palatino de um rato adulto jovem.

Na segunda etapa, as células satélites de cada amostra de músculo são isoladas por enzimática, digestão e duração. As células são então cultivadas nos géis da matriz extracelular. Em última análise, o estado dinâmico de miogênese das culturas de células satélites pode ser rastreado por meio de coloração para os marcadores musculares de interesse.

A fissura labiopalatina é uma das malformações craniofaciais mais comuns em humanos. Quando uma fissura está presente, o reparo cirúrgico é necessário para fechar o defeito e permitir um desenvolvimento normal da fala, a fibrose e a regeneração muscular defeituosa, no entanto, podem dificultar a recuperação funcional dos músculos do palato mole. Após o reparo da fenda palatina, você pode demonstrar um método inovador para a cultura de células satélites recém-isoladas usando revestimentos de gel de matriz celular exo de tamanho de apenas milímetros.

Isso evita a necessidade de expansão. Anding essas células Um dia antes do isolamento, coloque oito lâminas de câmara de poço em uma placa de Petri de 100 milímetros e transfira a placa para uma superfície fria. Após 10 minutos, use uma micropipeta pré-cheia para dispensar uma única gota de 10 microlitros de gel de matriz extracelular em cada poço.

Depois de resfriar as lâminas por mais sete minutos, remova completamente o gel restante e seque os poços a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Para dissecar o músculo do massacre, remova a pele da cabeça de um rato de nove semanas e use agulhas hipodérmicas para fixar a cabeça de lado. Em uma almofada de silicone, isole a glândula parótida e o nervo facial e remova a glândula.

Em seguida, usando uma lâmina de bisturi número 15, remova cuidadosamente o nervo facial. Identifique a cabeça superficial do músculo masseter. Em seguida, use uma pinça reta para separar o tendão de sua origem no processo zigomático, seguido de um corte cuidadoso do tendão com uma tesoura de dissecação.

Com o bisturi, dissecar a cabeça superficial do massacre até sua inserção no ângulo e na metade inferior da superfície lateral do ramo da mandíbula. Para dissecar o ventre posterior do músculo digástrico, fixe a cabeça em decúbito dorsal com agulhas e remova a gordura subcutânea que recobre as glândulas sublingual e submandibular. Exponha as barrigas dos músculos di gástricos anterior e posterior, em seguida, segurando o tendão anterior da barriga posterior com uma pinça reta cortada em dissecar cuidadosamente o tendão até sua origem no buller timpânico.

Para dissecar o músculo levada do olho, localize o músculo hallóide estilo. Puxe-o lateralmente e remova cuidadosamente o tecido muscular. Em seguida, localize o tendão da levada vli palatino que insere que o buller timpânico e disseque-o cuidadosamente.

Em seguida, levante o esôfago de trás da traqueia. Identifique a área do palato mole onde o palato da levada está inserido e solte o músculo. Em seguida, mergulhe o músculo em etanol a 70% e transfira-o para PBS gelado suplementado com antibióticos.

Para isolar as células satélites, transfira cada músculo para poços individuais de uma placa de seis poços e corte os tecidos em pequenos pedaços de dois milímetros. Tomando cuidado para não picar muito os músculos. Em seguida, incube cuidadosamente os fragmentos de tecido em 2,5 mililitros de solução de pronase a 0,1% por poço a 37 graus Celsius por 60 minutos com agitação suave a cada 20 minutos.

Quando os feixes de fibras exibem uma aparência solta a 2,5 mililitros de DMEM suplementado com soro de cavalo e antibióticos para cada poço e transferem os tecidos digeridos para tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Gire as pastas de tecido e decanta os sobrenadantes. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio a cada tubo e homogeneize o tecido com uma pipeta de plástico de 10 mililitros.

Gire os tecidos novamente e transfira os sobrenadantes para novos tubos cônicos de 15 mililitros. Em seguida, adicione mais cinco mililitros de meio aos tubos e trirate os pedaços de tecido novamente até que os fragmentos passem facilmente pela pipeta. Após outra centrifugação, puxar os sobrenadantes para os tubos correspondentes apropriados e filtrar as suspensões celulares através de filtros de 40 micrómetros em tubos individuais de 50 mililitros.

Lave os filtros com um mililitro de DMEM para recuperação máxima das células. Em seguida, gire as células, ressuspenda os pellets em fresco, médio e conte as células para cultivar as células satélites isoladas. Em seguida, dilua as suspensões celulares para 1,5 vezes 10 elevado a três células por 10 microlitros de meio de cultura.

Em seguida, adicione 10 microlitros de células em cada ponto de gel de matriz extracelular previamente preparado e incube os géis a 37 graus Celsius após seis horas. Adicione cuidadosamente 400 microlitros de meio de cultura a cada mancha de gel e devolva as lâminas à incubadora. Após três dias, iniciar a diferenciação das células com a adição do meio de cultura apropriado imediatamente após o isolamento.

Mais de 90% das células satélites recém-isoladas expressam o pacote sete No quarto dia, o pacote sete e o MyoD são expressos pelas células satélites de todos os grupos musculares. Meu GO é altamente expresso no sétimo dia em todos os grupos musculares. Quatro dias após a semeadura na matriz extracelular, manchas de gel, as células em proliferação começam a se fundir e formar pequenos tubos de mio multinucleados, que expressam a cadeia pesada da miosina no sétimo e 10º dia.

Tubos myo longos e bem organizados são evidentes no dia 10. Contrações do tubo Myo também podem ser observadas. Este protocolo permite o estudo de células satélites originárias dos músculos da cabeça brer e oferece novas possibilidades para o tratamento da fenda palatina. Pacientes.