Name: Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda o isolamento de células-satélite de músculos branquiométricos de cabeça em ratos e sua cultura em géis de matriz extracelular. Este método permite estudar a miogênese e regeneração muscular sem expansão celular.

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Este estudo foi financiado por uma bolsa Mosaic (017.009.009) da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) e uma bolsa Start (S-13-167C) para jovens pesquisadores da Fundação AO. ZYR é apoiado pelo National Institutes of Health (concessão # AG021566, AG035377, NS090051).

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Conselho local para Experimentação Animal da Radboud University Nijmegen, em conformidade com as leis e regulamentos (RU-dezembro 2013-205) Holandês. 1. Pontos de Matriz Extracelular gel <ol><li> Execute os seguintes passos um dia antes do isolamento: <ol><li> Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (100 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir a 1:10 em meio de Eagle modificado por Dulbecco; com 4500 mg / L de glicose, 4 mM de L-glutamina, e 110 mg / ml de piruvato de sódio (DMEM). Manter o gel da matriz extracelular, a 4 ° C em todos os momentos. Nota: mudanças bruscas de temperatura irá resultar em revestimento irregular e formação de cristais. </li><li> Manter a solução em gel de matriz extracelular diluído em gelo durante 15 min. </li><li> Pré-descontrair uma micropipeta 20 l para 10 min. </li><li> Coloque lâminas de câmaras de 8 poços para uma placa de Petri de 100 milímetros e transferir o prato sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min.</li><li> Utilizar a micropipeta pré-arrefecido a colocar uma gota de 10 ul de gel de matriz extracelular em cada cavidade. Manter a placa de Petri sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A). </li><li> Remover completamente o restante gel de matriz extracelular (Figura 1B), e secar os poços, a 37 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção de Cabeça Músculos (músculo masseter, digástrico, e músculo levantador do véu palatino) <ol><li> Antes de dissecção, preparar 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 2% de Penicilina-Estreptomicina (P / S). Manter em gelo. </li><li> Após a eutanásia de um rato adulto jovem (9 semanas) com CO 2 / O 2, decapitar a cabeça e retire a pele da cabeça. Transferir a cabeça de PBS arrefecido em gelo suplementado com 2% de P / S em um tubo de 50 ml. </li><li> Músculo masseter (derivado do primeiro arco branquial) <ol><li> Coloque a cabeça com um lateral-se sobre uma almofada de silicone e corrigir com hipodérmica needles (Figura 2A). </li><li> Identificar a glândula parótida e nervo facial (Figura 2A). Expor a fascia profunda cobrindo a glândula. Corte a fáscia e remover a glândula usando tesouras de dissecação. Identificar o conduto auditivo externo. Trace o nervo facial do forame estilomastóideo e retire cuidadosamente os ramos temporais, zigomáticos, e bucais com uma lâmina de bisturi n ° 15. </li><li> Livre a cabeça superficial do músculo masseter, removendo a fáscia. Identificar cabeças tanto superficial e profunda do músculo masseter. Traçar a cabeça superficial até sua aponeurosis tendinosa grossa inserido no processo zigomático da maxila. </li><li> Separa-se o tendão a partir da sua origem no processo de zigomática com uma pinça rectas. Cortá-la com uma lâmina de bisturi n º 15 ou tesouras de dissecação e cuidadosamente vida dele (Figura 2B). </li><li> Dissecar a cabeça superficial do músculo masseter até sua inserção no ângulo e metade inferior de tele Superfície lateral do ramo da mandíbula com uma lâmina de bisturi n ° 15 (Figura 2C). Agora, remover completamente o músculo. </li></ol></li><li> Ventre posterior do músculo digástrico (derivado do 2º branquial arco) <ol><li> Coloque a cabeça em uma posição supina sobre a almofada de silicone e corrigir com agulhas hipodérmicas (Figura 3A). </li><li> Retire a gordura subcutânea que recobre tanto sublingual e submandibular. Em seguida, remova a fáscia superficial e glândulas usando tesouras de dissecação. Expor o músculo digástrico (anterior e posterior da barriga). </li><li> Segure o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, cortá-la, e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (Figura 3B). Fazer a mesma no lado contralateral. </li></ol></li><li> Levator músculo do véu palatino (derivado do quarto arco branquial) <ol><li> Após a dissecção do ventre posterior do músculo digástrico, Localizar o músculo stylohyoid, puxe-o lateralmente e, cuidadosamente, remova-a (Figura 4A). </li><li> Localize o tendão do músculo levantador do véu palatino que insere na bula timpânica (Figura 4A). Dissecá-lo com cuidado e corte-o em ambos os lados. </li><li> Procure a traquéia eo esôfago que corre atrás dele. Levantar o esófago, e expor a faringe, laringe e o palato mole. </li><li> Localize a área do palato mole, onde é inserido o levantador do véu palatino e cortá-lo solto (Figura 4B). Nota: Diretamente após a dissecação, remova cuidadosamente tendões e tecido conjuntivo de cada músculo sob o microscópio estéreo. Submerge todas as amostras rapidamente em etanol a 70%, e transferi-los para PBS arrefecido em gelo suplementado 2% de P / S em um tubo de 15 ml. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de células satélites <ol><li> Execute as seguintes etapas de preparação para SC isolamento a partir de 3 grupos de músculos: <ol><li>Prepare a 7,5 ml de 0,1% de pronase em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água durante 10 minutos antes do isolamento. </li><li> Preparar 35 ml de DMEM suplementado com 10% de Soro de Cavalo (HS) e 1% de P / S. Também pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. </li><li> Preparar 15 ml de meio de cultura, que consiste em DMEM suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS), 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha (CEE). Pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. </li><li> Pré-revestimento seis pipetas de plástico (10 ml) com HS e secas durante pelo menos 10 minutos antes da utilização. </li></ol></li><li> Na capa de cultura, transferir cada músculo em um poço de uma placa de 6 poços. Usando as tesouras de dissecação, cortados do músculo em pedaços pequenos de cerca de 2 mm. Tenha cuidado para não picar o tecido muito. </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 2,5 ml de solução de pronase a 0,1% a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 60 min. Agite ligeiramente a placa após 20, 40 e 60 min. Nota: O duratio exatan da incubação depende de fatores como idade e estirpe dos animais. </li><li> Monitorar sob o microscópio. Confira os fragmentos musculares e parar a digestão enzimática quando os feixes de fibras ter uma aparência solta (Figura 5). </li><li> Adicionar 2,5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar os tubos a 400 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante por decantação. </li><li> Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipetar a solução para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml em plástico (trituração) por pelo menos 20 vezes para homogeneizar o tecido. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 min. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipeta de novo com uma pipeta de plástico de 10 mL até os fragmentos de tecido passa facilmente através da pipeta. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 minutos e recolher o sobrenadante num tubo de 15 ml. </li><li> Put um filtro de células (40 ^ M) para um tubo de 50 ml e transfere-se o sobrenadante contendo as células dissociadas sobre o filtro. Lavar com 1 ml DMEM para a recuperação das células máxima. </li><li> Centrifugar os tubos a 1000 x g durante 10 minutos e descarta-se o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Ressuspender o sedimento em 300 ul de meio de cultura e contar as células num hemocitómetro. </li></ol> 4. A diferenciação das células satélites em Spots de Matriz Extracelular Tapetes <ol><li> Dilui-se a suspensão de células para se obter 1,5 x 10 3 células em 10 ul de meio de cultura. </li><li> Fixe as tampas das câmaras de slides com fita e marcar os pontos com um marcador preto no lado inferior do vidro objeto. </li><li> Usando uma micropipeta, coloque uma gota de suspensão de células 10 ul para o ponto gel matriz extracelular. Verificar se ao microscópio a gota da suspensão de células foi colocada correctamente no local. Incubar durante seis horas a 37 ° C. </li><li> Cuidadosoly adicionar 400 uL de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S a 1% e CEE) e incuba-se durante três dias a 37 ° C. Nota: Neste ponto, recentemente isoladas SC são submetidos a um trauma severo (digestão enzimática e trituração dura) e que eles precisam para se recuperar. Não perturbar as células durante os primeiros três dias 37. A seguir, o meio de cultura pode ser alterada dependendo do tipo de experiência. Os pontos de gel da matriz extracelular podem ser semeadas com uma densidade celular elevada (1,5-2,5 x 10 3/20 l) para o ensaio de diferenciação. O meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) pode ser substituído a cada três dias. </li><li> Alternativamente, se a expansão ea passagem é desejada seguir os seguintes passos: <ol><li> Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (500 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir 1:10 em DMEM e siga as recomendações no ponto 1.1.1. </li><li> Pré-arrefecer uma pipeta de 10 mL durante 10 min a 4 &amp;# 176; C. </li><li> Transferir três frascos T75 sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min. </li><li> Use a pipeta pré-refrigerados para colocar 1 ml de gel de matriz extracelular em cada frasco. Verifique se a superfície é coberta completamente. Manter os frascos sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A). </li><li> Remover completamente o gel matriz extracelular restante com uma pipeta de 10 ml, e secar os poços, a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a contagem, ressuspender as SCs isolados de fresco em 10 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) e as sementes em frascos T75 pré-revestidos. </li><li> Depois de três dias, alterar a forma (e cada terceiro dia) até 80% de confluência é atingido. Para passaging, lavar os frascos T75 três vezes com PBS. Em seguida adicionar 1 ml de solução de tripsina a 0,25% e incubar durante três minutos a 37 ° C. Ressuspender em 9 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / Se 1% de extracto de embrião de galinha) e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Desprezar o sobrenadante. Após a contagem, ressuspender 1 x 10 6 células em 1000 uL de meio de cultura e congelar as células. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

SCs de diferentes músculos da cabeça branquiométrico foram isolados a partir de um de 9 semanas de idade de ratos Wistar e cultivadas directamente em manchas de gel de matriz extracelular sem a expansão e passagem em antes. Após o isolamento, as células foram contadas e semeadas à mesma densidade celular. Para o isolamento paralela de três músculos diferentes, este método leva cerca de 4 horas. Para evitar a contaminação da cultura, um passo crítico é a rápida lavagem em álcool a 70% após a dissecação dos músculos. Durante SC isolamento é importante para cortar o tecido muscular em pequenos pedaços (cerca de 2 mm), mas evitar o excesso de picagem pois isso irá resultar num rendimento de célula pequena por causa de danos celulares. Além disso, a duração da digestão enzimática deve ser verificado cuidadosamente sob o microscópio para evitar mais danos. O objectivo da digestão é de dissociar as miofibras. Uma vez que mais de 90% das células isoladas expressam Pax7, não é necessária mais purificação (Figuras 6-8).Isto evita passos de purificação adicionais em outros métodos, tais como pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fraccionamento em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41,43. Por trituração é essencial induzir cisalhamento entre os fragmentos de tecido e a abertura da ponta da pipeta como este permite que a libertação mecânica do SC. Se a trituração com uma pipeta 10 ml (dentro de ponta diâmetro: 1 mm), é difícil, de 5 ml (dentro ponta diâmetro: 2 mm) pipeta pode ser utilizada pela primeira vez. Alternativamente, pipetas de Pasteur de vidro pode ser cortado no diâmetro desejado e ser utilizado. Este método é simples, eficiente e permite o isolamento em simultâneo de SC a partir de diferentes amostras do músculo. As placas de cultura para SCS também pode ser revestida com gelatina ou colagénio, mas os nossos estudos anteriores mostram que o gel de matriz extracelular é muito melhor para a manutenção do potencial miogénica de colagénio 38. As manchas extracelulares da matriz de geltamanho milímetros (10 ul / S de 2 mm ou 20 ul de E / S 4 mm) permite o estudo da proliferação e diferenciação de SCS com um número limitado de células. Para o ensaio de diferenciação de cerca de 8 a 20 vezes menos células são necessários em comparação com uma placa de 24 poços (Ø 15,6 milímetros), e cerca de 80 a 200 vezes menos comparado até 35 mm pratos Petri (Ø 35 mm) 14,38. Desde gel de matriz extracelular é caro, este método também é mais eficiente em termos de custos. Além disso, as lâminas de câmara pode ser substituído por cobertura de plástico desliza para reduzir ainda mais os custos. Para a preparação do gel matriz extracelular acaba de secagem durante a noite das lâminas de câmaras é essencial. À medida que as manchas de gel de matriz extracelulares são transparentes, é necessário marcar os pontos no lado inferior utilizando iluminação traseira. As câmaras de slides são fixados em uma placa de Petri para a manipulação fácil. A expansão adicional de cultura de células não é necessário, o que oferece a possibilidade de estudar o SCs de smalLER músculos ou amostras musculares pequenos. Alternativamente, por exemplo, para PCR ou músculo constrói se são necessários mais células, as SCs de isolados de fresco pode ser primeiro expandida em frascos T75, tal como indicado acima. SCs isolado utilizando este protocolo, não são adequados para a purificação adicional com a citometria de fluxo imediatamente após o isolamento. A digestão com pronase provoca extensa digestão de antigénios da superfície 14. De soro de cavalo e soro fetal bovino que são utilizados para a cultura de células tem de primeiro ser adequadamente caracterizados, antes do isolamento, como diferentes números de lote diferencialmente afectada mioblastos proliferação e diferenciação. Nos últimos anos, há um crescente interesse nos músculos derivados dos arcos branquiais e da mesoderme da cabeça (por exemplo, os músculos extra-oculares) 24. Tem sido claramente demonstrado que músculos da cabeça e dos membros possuem propriedades altamente diferentes. Músculo masséter de animais velhos parece retain sua capacidade regenerativa, em comparação com os músculos dos membros 25,26. SCs dos músculos extra-oculares possuem uma robusta capacidade de proliferação e diferenciação comparável ao SCs de músculos da cabeça, e mostrar um potencial maior do que o enxerto muscular de membros SCs 24. A composição de distribuição do tipo de fibra e miosina varia entre os grupos musculares e também entre as espécies. Músculos originários a partir do primeiro arco branquial em humanos contêm fibras tanto lentas e rápidas (IIA e IIX subtipos), myosins neonatais e myosins típicos para o desenvolvimento de músculo cardíaco. Em roedores estes músculos contêm cerca de 95% IIA fibras rápidas miosina e IIb) 44-46. Estudos sobre os músculos aviário mostram que a SCS a partir de diferentes tipos de fibras musculares variar em capacidade de diferenciação. SCs de fibras rápidas única diferenciar em fibras musculares rápidas, enquanto SCs de fibras lentas podem se diferenciar em ambos os tipos de fibras 47. Além disso, a percentagem de CT no músculo rápidofibras é menor do que na fibras musculares lentas 48,49. Isto indica que a distribuição do tipo de fibra deve ser tida em conta para os estudos sobre os músculos na área craniofacial. Similar aos músculos fenda palatina, o LVP em roedores contém quase exclusivamente fibras rápidas 50. Por essa razão, SCs da LVP são adequados para estudos pré-clínicos no campo da fenda palatina. Este protocolo oferece novas possibilidades para estudar SCs derivadas de músculos da cabeça branquiométrico ou outros músculos menores ou amostras de músculos menores. Isto irá facilitar o desenvolvimento de novas terapias para melhorar a regeneração dos músculos da região maxilofacial em condições tais como fenda palatina mas também em outras condições que afectam os músculos menores.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Cerca de 1: 500 a 1: 1.000 recém-nascidos apresentam uma fissura envolvendo o lábio e / ou palato (CLP); assim, esta é a malformação congênita mais comum em humanos uma. Os músculos do palato mole são essenciais para o funcionamento do palato mole durante a fala, deglutição e sucção. Se uma fenda do palato mole está presente, estes músculos são anormalmente inserido na extremidade posterior do osso palatino. O palato mole move para cima e para baixo durante a fala, impedindo que o ar escape através do nariz. Crianças com uma fenda no palato não têm essa função de controle, resultando em um fenômeno conhecido como disfunção velofaríngea 2,3. Embora os protocolos de tratamento são variáveis, a reparação cirúrgica do palato mole tem lugar na primeira infância (6-36 meses de idade) 4. Os músculos anormalmente inseridos do palato mole pode ser corrigido cirurgicamente 5-7, no entanto, disfunção velopharyngeal persistir em 7% a 30%dos pacientes 2,3,8-10. A capacidade do músculo esquelético para regenerar-se através da acção de células satélites (SCS) está bem estabelecida 11,12. Após a lesão muscular, SCs são activados e migram para o local da lesão. Eles então proliferar, diferenciar, e se fundem para formar novas fibras musculares ou reparar danificado os 13. Quiescentes SCs expressam o fator de transcrição Pax7 14,15, enquanto a sua progênie, os mioblastos proliferação, adicionalmente expressar o fator de determinação miogênica 1 (MyoD) 16. Mioblastos diferenciadores começam a expressar miogenina (MyoG) 17. A diferenciação terminal de mioblastos é marcada pela formação de miofibras, e a expressão de proteínas específicas de músculo, tais como cadeia pesada de miosina (MyHC) 16,18. Recentemente, várias estratégias têm sido utilizadas em medicina regenerativa para melhorar a regeneração do músculo dos músculos do membro 19-23. Estudos específicos sobremúsculos da cabeça branquiométrico também são importantes, pois foi demonstrado recentemente que eles diferem de outros músculos em vários aspectos 24. Em contraste com os músculos dos membros, tem sido sugerido que os músculos da cabeça branquiométrico contêm menos SCs 25, regenerar mais lento, e tecido conjuntivo mais fibrosa é formada após a lesão 26 Além disso, a proliferação de músculos SCs cabeça branquiométrico também expressar outros factores de transcrição. Por exemplo, Tcf21, um fator de transcrição para a formação muscular craniofacial é fortemente expresso na regeneração de músculos da cabeça, mas dificilmente na regeneração de músculos dos membros 25. Os músculos do palato mole de pacientes CLP são geralmente menores e menos bem organizada em comparação com músculos palatinos normais 27,28. Fibras lentas e rápidas estão presentes nos músculos do palato mole, mas as fibras lentas são mais abundantes. Em contraste, os músculos fissura contêm uma maior proporção de fibras rápidas e também uma fonte capilar reduzidaem comparação com os músculos do palato mole normais 29-31. Fibras rápidas são mais propensas a contração induzida por lesão 31-33. O pobre suprimento capilar de acompanhamento também pode promover a fibrose 34,35. Todos estes aspectos podem contribuir para o mau regeneração dos músculos moles do palato após o fecho cirúrgico fenda 36. Em vista disso, um protocolo para o isolamento e caracterização de músculo cabeça branquiométrico SCs é crucial. Isto proporciona a possibilidade de estudar a biologia dos músculos SC cabeça branquiométrico. Além disso, novas terapias com base em engenharia de tecidos podem ser desenvolvidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia em CRE e outras condições comprometedoras da área craniofacial. Em geral, SCs pode ser obtido após dissociação do tecido muscular 14. Picar, digestão enzimática e trituração geralmente são obrigados a liberar SCs de seu nicho. SCs pode ser purificado por meio de pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fractionation em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41-43. Aqui nós apresentamos um novo protocolo econômico e rápido para o isolamento de células satélites de músculos da cabeça branquiométrico de ratos adultos jovens. Este protocolo baseia-se num manuscrito anterior 14 e especificamente adaptado para pequenas amostras de tecido. O isolamento de SCs de músculos representativos provenientes do 1 º, 2 º e 4 º arcos branquiais são descritos. Após o isolamento, baixo número de células satélites são cultivadas em gel matriz extracelular manchas de tamanho milímetro para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a necessidade para a expansão e passaging de SCs.

<table><tbody><tr><td>Agulha Hipodérmica 25&nbsp; G 0,5&nbsp; x&nbsp; 25&nbsp; m</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Braun</td><td>BC154R</td><td></td></tr><tr><td>Micro fórceps reta</td><td>Braun</td><td>BD330R</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico Nº.&nbsp; 15</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Álcool 70%</td><td>Denteck</td><td>2,010,005</td><td></td></tr><tr><td>Permanox Slide, 8 Câmaras</td><td>Thermo Scientific</td><td>177445</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (100 x 20 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico estéril de 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga cônico estéril de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40 &mu; m)</td><td>Gibco</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &micro; l FT20</td><td>Greiner bio-one</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Livre de Fenol-Vermelho</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>10&nbsp; KU</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, alta glicose, Suplemento GlutaMAX, piruvato&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>3600511</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de soro de cavalo</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>de extrato de embrião de galinha</td><td>MP Biomedicals</td><td>2850145</td><td>20 ml</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato cabeça branquiométrico

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

A fibrose e a regeneração muscular defeituosa podem dificultar a recuperação funcional dos músculos do palato mole após o reparo da fenda palatina. Isso causa problemas persistentes na fala, deglutição e sucção. Sistemas de cultura in vitro que permitem o estudo de células satélites (células-tronco miogênicas) dos músculos da cabeça são cruciais para o desenvolvimento de novas terapias baseadas na engenharia de tecidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia. Esses sistemas oferecerão novas perspectivas para o tratamento de pacientes com fissura palatina. Um protocolo para o isolamento, cultura e diferenciação de células satélites dos músculos da cabeça é apresentado. O isolamento é baseado na digestão enzimática e trituração para liberar as células satélites. Além disso, este protocolo compreende um método inovador usando revestimentos de gel de matriz extracelular de tamanho milimétrico, que requer apenas um baixo número de células satélites para ensaios de diferenciação.

Usando este protocolo, o músculo masseter (um lado) produz 0,8-1 x 10 6 células, o músculo digástrico (barriga posterior) produz 1,5-2 x 10 5 células, e levator veli rendimentos musculares palatini 1-1,5 x 10 5 células. Rendimentos celulares dependem do tipo muscular, estirpe e idade do animal. Para a comparação entre os três grupos musculares, SCs isolados de fresco foram semeadas à mesma densidade de células (1,5 x 10 3/10 ul). Imediatamente após o isolamento, mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 6). Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7, MyoD, MyoG e MyHC immunostaining. Cinco campos arbitrários foram contadas por cultura usando uma objetiva de 20X. No dia 4 Pax 7 e Myo D é expresso em todos os grupos musculares (Figuras 6 e 7 e 8), porém a descendência de SatCs do masseter e os músculos digástrico começar exprescante miogenina mais cedo do que o músculo levantador do véu palatino (Figura 9). No dia 10, a expressão de MyoG é fortemente reduzida em todos os grupos (Figura 9). Alguns dias após a semeadura das manchas do gel matriz extracelular, as células em proliferação começar a fundir e formar miotubos multi-nucleadas, que expressam miosina de cadeia pesada. Pequenas miotubos são claramente visíveis no dia 7 (Figura 10). No dia 10, espasmos dos myotubes pode ser observada (Video 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figura 1:. Manchas extracelulares da matriz de gel em uma lâmina de câmara (A) Para a manipulação fácil, colocar a corrediça câmara de 8 poços para uma placa de Petri 100 milímetros. Pipeta 10 ul gel matriz extracelular em cada câmara e coloque-o sobre uma superfície fria (7 min). (B) Câmara slide após o excesso de matriz extracelular gel é removido. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissecção do músculo masseter (A) Cabeça do animal em uma visão lateral. Orelha (E), a glândula parótida (P) e do nervo facial (VII). (B) tendíneas aponeurosis (Te) da cabeça superficial do músculo masseter (Ms) e do músculo temporal (T). Separa-se a sua inserção a partir de tendão com um fórceps. (C) dissecar cuidadosamente o músculo até sua inserção no ramo da mandíbula. E: orelha, P: glândula parótida, VII: nervo facial, T: músculo temporal, Ms: cabeça superficial do músculo masseter, Te: tendão, Mp: cabeça profunda do músculo masseter. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figura 3: Dissecção do ventre posterior do músculo digástrico (.A) Cabeça do animal em decúbito dorsal. Localizar a glândula submandibular (SG), músculo masseter (M), nervo facial (VII) e músculo esternocleidomastóideo (SCM). Remover a glândula submandibular. (B) Localize o anterior digástrico muscular (AD) e ventre posterior (DP). Com uma pinça reta, tomar o tendão anterior do ventre posterior, cortá-lo e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (ty). E: orelha, Sg: glândula submandibular, VII: nervo facial, M: músculo masseter, SMC: esternocleidomastoideu, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, Ty: bula timpânica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figura 4:. Dissecção do músculo elevador do véu palatino (A) Vista geral após a dissecação do músculo digástrico (ventre posterior). Músculo stylohyoid (St) e tendão do músculo levantadorvéu palatino pode ser localizada. Nota da traquéia (T) e esôfago (Es) correndo atrás dele. (B) Depois de levantar a traqueia e o esófago da faringe (P) fica exposto. A inserção do músculo levantador do véu palatino no palato mole é agora visível. A seta indica o palato mole dissecados com os músculos palatino levator Veli em ambos os lados. E: orelha, St: músculo stylohyoid, VII: nervo facial, M: músculo masseter, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, T: traqueia, Es: esôfago, P: faringe, * levator músculo do véu palatino . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figura 5: Aparência do tecido muscular (A) antes e (B), após a digestão enzimática com pronase. Note-se que feixes musculares parecem ser solta após a digestão enzimática. Figura 6: 7 Pax imunocoloração SCs recentemente isoladas, aplicado a gel de matriz extracelular no final do isolamento (cerca de 6 horas após a digestão inicial do tecido).. Cinco campos arbitrárias foram contadas utilizando uma objectiva de 10x com uma média de 210 células por campo. Aproximadamente 90% das células são positivas Pax 7. DAPI: azul, Pax7: vermelho. Barra de escala, 100 mm. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7:. Pax 7, MyoD immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. (A - C) e (D - F) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 a partir de culturas do músculo masséter. (L e H </strong&gt;) O número de Pax7 + e MyoD + núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). DAPI: azul, Pax7: vermelho, e MyoD: verde. Escalas bar, 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figura 8:. Distribuição de Pax7 ± / ± MyoD em culturas de células mononucleares nas culturas a partir do músculo masseter palatina, digástrico e levator veli (A - C) Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. O número total de células é baseada na do número total de núcleos (DAPI). (D) quantificação de dados de Pax7 ± / ± cel MyoDls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figura 9:. Immunostaining Miogenina Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Miogenina. (A - D) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 culturas do músculo levantador do véu palatino. (E) O número de MyoG + núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). Quantificação (F) Dados de células MyoG +. DAPI: azul, Miogenina: verde. Escalas bar, 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figur</a>e. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figura 10:. Myosin Cadeia Pesada immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina (MyHC). Fotomicrografias representativas dos dias 4, 7 e 10 culturas do músculo digástrico (DIG). No dia 7, as pequenas myotubes estão presentes, enquanto no dia 10 myotubes longas e bem organizados são evidentes. Escalas bar, 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1:.. Miotubo contraindo Exemplos de dois campos representativos com myotubes contraindo são mostrados para o dia 10 culturas de músculo digástrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

Este protocolo descreve o isolamento de células de satélite a partir de músculos da cabeça branquiométrico de um rato 9 semanas de idade. Os músculos são originários de diferentes arco branquial. Subsequentemente, as células satélites são cultivadas em um revestimento local de tamanho milímetros para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a expansão e passagem em células de satélite.

Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células satélites de músculos representativos originados a partir do primeiro, segundo e quarto arcos branquiais, para seu cultivo em uma matriz extracelular. Manchas de gel. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos músculos masseter, digástrico e levantador do véu palatino de uma rata jovem adulta.No segundo passo, as células satélites de cada amostra muscular são isoladas por digestão enzimática, e duração. As células são então cultivadas em géis de matriz extracelular. Em última análise, o estado dinâmico da miogênese das culturas de células satélites pode ser acompanhado por meio de coloração para os marcadores musculares de interesse.A fissura labial e palatina é uma das malformações craniofaciais mais comuns em humanos. Quando há uma fissura, é necessária uma correção cirúrgica para fechar o defeito e permitir o desenvolvimento normal da fala. No entanto, a fibrose e a regeneração muscular defeituosa podem comprometer a recuperação funcional dos músculos do palato mole. Após a correção da fissura palatina, pode-se demonstrar um método inovador para o cultivo de células satélites recém-isoladas, utilizando revestimentos de gel de matriz extracelular em manchas de tamanho milimétrico.Isso evita a necessidade de expansão. Um dia antes do isolamento, coloque oito lâminas com câmara de poços em uma placa de Petri de 100 milímetros e transfira a placa para uma superfície fria. Após 10 minutos, use uma micropipeta pré-cheia para dispensar uma única gota de 10 µL de gel de matriz extracelular em cada poço.Após resfriar as lâminas por mais sete minutos, remova completamente o gel restante e seque os poços a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Para dissecar o músculo masseter, remova a pele da cabeça de um rato com nove semanas de idade e use agulhas hipodérmicas para fixar a cabeça de lado. Sobre uma placa de silicone, isole a glândula parótida e o nervo facial e remova a glândula.Em seguida, utilizando uma lâmina de bisturi número 15, remova cuidadosamente o nervo facial. Identifique a cabeça superficial do músculo masseter. A seguir, use uma pinça reta para separar o tendão de sua origem no processo zigomático, seguido pelo corte cuidadoso do tendão com tesoura de dissecação.Usando o bisturi, dissecar a porção superficial do músculo masseter até sua inserção no ângulo e metade inferior da superfície lateral do ramo da mandíbula. Para dissecar o ventre posterior do músculo digástrico, fixar a cabeça em posição supina com agulhas e remover a gordura subcutânea que recobre as glândulas sublingual e submandibular. Expor os ventres anterior e posterior do músculo digástrico, então, segurando o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, cortar e dissecar cuidadosamente o tendão até sua origem na bolha timpânica.Para dissecar o músculo levatador palatino, localize o músculo estilofaríngeo. Puxe-o lateralmente e remova cuidadosamente o tecido muscular. Em seguida, localize o tendão do levatador palatino que se insere na bolha timpânica e dissecione-o com cuidado.Em seguida, levante o esôfago de trás da traqueia. Identifique a região do palato mole onde o músculo levatador do palato está inserido e corte-o solto. Em seguida, submerja o músculo em etanol 70% e transfira-o para PBS frio adicionado de antibióticos.Para isolar as células satélites, transfira cada músculo para poços individuais de uma placa de seis poços e corte os tecidos em pequenos fragmentos de dois milímetros. Tendo cuidado para não picar os músculos em excesso. Em seguida, incube cuidadosamente os fragmentos de tecido em 2,5 mililitros de solução de pronase 0,1% por poço a 37 graus Celsius durante 60 minutos, com agitação suave a cada 20 minutos.Quando os feixes de fibras do Exemplo A apresentarem aparência solta, adicione 2,5 mililitros de DMEM suplementado com soro de cavalo e antibióticos a cada poço e transfira os tecidos digeridos para tubos cónicos individuais de 15 mililitros. Centrifugue as suspensões teciduais e remova os sobrenadantes. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio a cada tubo e homogeneíze o tecido com uma pipeta plástica de 10 mililitros.Centrifugue novamente os tecidos e transfira os sobrenadantes para novos tubos cónicos de 15 mililitros. Em seguida, adicione mais cinco mililitros de meio aos tubos e triture novamente os fragmentos de tecido até que os pedaços passem facilmente pela pipeta. Após outra centrifugação, recolha os sobrenadantes nos tubos correspondentes apropriados e filtre as suspensões celulares através de filtros de 40 micrômetros para tubos individuais de 50 mililitros.Lave os filtros com um mililitro de DMEM para recuperação máxima das células. Em seguida, centrifugue as células, re-suspenda os pellets em meio fresco e conte as células para cultivar os mioblastos isolados. A seguir, dilua as suspensões celulares para 1,5 vezes 10 elevado a três células por 10 microlitros de meio de cultura.Em seguida, adicione 10 microlitros de células sobre cada ponto de gel de matriz extracelular previamente preparado e incube os géis a 37 graus Celsius após seis horas. Adicione cuidadosamente 400 microlitros de meio de cultura a cada ponto de gel e retorne as lâminas ao incubador. Após três dias, inicie a diferenciação das células com a adição do meio de cultura apropriado imediatamente após o isolamento.Mais de 90% das células satélites recém-isoladas expressam Pax7. No quarto dia, Pax7 e MyoD são expressos pelas células satélites de todos os grupos musculares. MyoG é altamente expresso no sétimo dia em todos os grupos musculares. Quatro dias após a semeadura na matriz extracelular, pontos em gel, as células proliferativas começam a se fundir e formar pequenos miotubos multinucleados, que expressam cadeia pesada da miosina no sétimo e décimo dia.Mios tubos longos e bem organizados são evidentes no dia 10. Também pode-se observar a contração espontânea dos mios tubos. Este protocolo permite o estudo de células satélites originadas de músculos da cabeça de brer e oferece novas possibilidades para o tratamento de fissura palatina.

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra o isolamento de células satélites dos tecidos musculares branquioéricos da cabeça de rato por meio de dissecção tecidual, digestão enzimática e subsequente purificação mecânica e centrífuga. As células são então semeadas em poços revestidos com matriz extracelular para diferenciação em mioblastos e, eventualmente, em miotubos e fibras musculares maduras.

Uma técnica para isolar células satélites do tecido muscular da cabeça de rato

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a...

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

A identificação precisa de células satélites é essencial para estudar as suas funções sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Este artigo apresenta um protocolo para identificar células satélites em seções de músculo esquelético adulto baseado em imunofluorescência manchando.

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&amp;RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda o isolamento de células-satélite de músculos branquiométricos de cabeça em ratos e sua cultura em géis de matriz extracelular. Este método permite estudar a miogênese e regeneração muscular sem expansão celular.

Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

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