Name: Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a isolar células miogênicas e fibroblastos de biópsias musculares humanas usando separação imunomagnética por CD56. Esta técnica permite alta viabilidade e rendimento para análise de marcadores fenotípicos e fatores de transcrição por imunofluorescência quantitativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Carl Hobbs e Lindsey Majoram por sua assistência técnica e ao professor Pat Doherty pelo uso das instalações de microscopia. O Dr. Agley foi apoiado por uma bolsa de estudos do King's College London. O financiamento do Spurrell Trust também é reconhecido.

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+the+Muscle+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche.</a> Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
<li>Timpl, R., Kvonder Mark, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+fibronectin+in+selecting+myogenic+versus+fibrogenic+cells+from+skeletal+muscle+cells+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in.</a> 117, 628-635 (1986).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Meth. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+O+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+Focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+seeing+is+not+believing%3A+improving+the+visibility+of+your+fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um procedimento de triagem immunomagentic para o enriquecimento selectivo de precursores derivadas de músculos humanos a partir de pequenas amostras de material de biópsia do músculo. Esta técnica tem sido valiosa no nosso laboratório para superar a perda de culturas derivadas de músculos humanos para fibroblastos, mas também para a compreensão do comportamento exclusivo das populações distintas de células progenitoras derivadas de músculos. Uma vez que as células miogénicas purificados podem ser investi...

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites 1, as células estaminais miogï¿½icas 2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado 3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática 4 e suas propriedades pode ser subsequentemente miogï¿½icas estudado em cultura primária 5. A eficiência deste processo de isolamento em conta tanto o rendimento e a pureza da população celular depende dos métodos utilizados e podem variar de amostra para amostra. Os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são as células satélites (células miogénicas agora denominadas células precursoras ou músculo), inicialmente identificadas como células CD56 + / desmina, e mufibroblastos derivados de LECSA, identificadas como CD56 - e TE7 + 5 células. Os fibroblastos têm uma taxa de proliferação rápida e não sejam submetidos a parada do crescimento irreversível e diferenciação terminal em cima do contato célula-célula, como as células miogênicas; assim, em populações mistas, os fibroblastos podem invadida células miogênicas a dominar a cultura. Os fibroblastos têm sido muitas vezes visto como uma irritação para os biólogos musculares, no entanto, agora há um interesse crescente em fibroblastos como células dignos de estudo em seu próprio direito, nomeadamente no que eles foram mostrados para ter um papel de cooperação com células miogênicas durante a reparação muscular 6 . O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de ambos os tipos de células em cultura. Activada por fluorescência de células (FACS) é um método pelo qual as células podem ser classificadas para estudo adicional e / ou contados eanalisado. FACS tem sido demonstrado de forma fiável para enriquecer células miogénicas humanos, mas o rendimento de células para cultura posterior, até agora não tem tido grande 7. Dado o potencial de replicação limitado de células somáticas, tais como células derivadas de células-satélite Miogênicos e os muito pobres proliferação e diferenciação associados à senescência 4, abordagens mais suaves são obrigatórios. Culturas de fibras musculares individuais oferecem uma outra, menos agressivo, os meios de obtenção de células satélites murino ainda residente em seu nicho sublaminal e após a sua ativação em cultura 8,9. No entanto, isso muitas vezes não é possível a partir de material da biópsia do músculo humano (porque as fibras raramente pode ser obtido a partir de tendão para tendão) o que significa que esta técnica pode não ser acessível a muitos laboratórios de pesquisa interessados ​​em estudar as células derivadas de músculos humanos. Além disso, a técnica de uma única fibra apenas fornece o número de células muito limitadas. Aqui nós descrevemos um sistema de triagem com base no gendigestão enzimática tle de células utilizando colagenase e dispase seguido por duas rondas sucessivas de triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (&gt; 95% de células miogénicas) e rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tecido) para experimentos em cultura. CD56 é considerado o marcador de superfície padrão de ouro para a identificação de células satélites humanos in situ e in vitro 10 11 e proporciona o marcador de superfície candidato ideal para a fixação do grânulo. Nesta abordagem, os anticorpos CD56 conjugado com óxido de ferro superparamagnético e grânulos contendo polissacáridos estão ligados às células e passado através de uma coluna de separação de células magnético de gradiente elevado colocada num campo magnético forte 12,13. As colunas de separação são cheios com uma matriz de lã de aço ou de ferro ferromagnéticos esferas que servem para concentrar as linhas de campo magnético para a sua superfície gerar fortes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) 14. Nestas colunas mesmo células ligeiramente magnéticas são atraídas e adsorvido à sua superfície 14. Unbound (CD56 -) células passam através da coluna enquanto que as células CD56 + marcadas com microesferas magnéticas são mantidos até a retirada do campo magnético 12,15. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada a uma densidade desejada para posterior experimentação. Após um determinado intervenção os constituintes celulares podem ser identificados usando imunocitoquímica, fotografada usando de campo amplo ou microscopia de fluorescência confocal e analisados ​​quantitativamente usando uma abordagem de análise de imagem que permite a rápida medição objectivo de todas as células marcadas em qualquer imagem. Em nosso laboratório temos usado essa abordagem triagem imunomagnï¿½ica duplo seguido por análise de imagem 16 para demonstrar que CD56 - fibroblastos humanos prontamente transdiferenciam em adipócitos, enquanto célula miogênicas de origem satélite são altamente resistentes a esta conversão adipogênica 5.

<table><tbody><tr><td>Colagenase&nbsp; D</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>Deve ser esterilizado por filtro antes do uso</td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td> <td>(Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &# 956; filtro de células m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Solução de colágeno (3 mg/ml em ácido acético a 0,1%)</td> <td>Sigma, Dorset, Reino Unido</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa Minisart SRP15 (0,2 &#956; m)</td> <td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>Membrana de politetrafluoretileno (PTFE)</td></tr><tr><td>CD56 microesferas humanas</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>Esteja ciente da vida útil limitada das microesferas</td></tr><tr><td>Microesferas anti-fibroblastos, humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtros de pré-separação</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Large Cell Collumns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>Estas colunas vêm com um resistor de fluxo. O uso do resistor de fluxo não é necessário para obter as altas purezas miogênicas descritas aqui.</td></tr><tr><td>Colunas LS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Seperator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>Este separador se encaixa na coluna de células grandes, mas não na coluna LS.&nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Deve ser esterilizado por filtro antes do uso</td></tr><tr><td>Óleo Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Seril fosfato</td><td>Sigma</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>No. 42, Ashless. Para preparar o filtro, dobre o papel de filtro circular para fazer um semicírculo e, em seguida, dobre o semicírculo ao meio novamente para formar uma forma de cone. Encaixe o cone em um funil para filtragem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sondas Moleculares de Reagente Antidesvanecimento ProLong Gold</td><td>, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Isso pode ser comprado com ou sem DAPI e não extingue a fluorescência inicial.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Contact Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe (comprado da Pugh Computers)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e quantitative immunocytochemical caracterização de células miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites, que são as células estaminais musculares residente. Estes podem ser isolados a partir de amostras de biópsia do músculo humano, utilizando a digestão enzimática e as suas propriedades miogï¿½icas estudadas em cultura. Quantitativamente, os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são: (i) as células satélites (denominados células miogénicas ou células precursoras do músculo), inicialmente identificadas como CD56 + e mais tarde como células CD56 + / + e desmina (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 - e TE-7 +. Os fibroblastos proliferam de forma muito eficiente na cultura e nas populações de células mistas essas células podem invadir células miogênicas para dominar a cultura. O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de qualquer um dos tipos de células em cultura. Aqui nós descrIBE um sistema de triagem baseada na digestão enzimática suave de células utilizando colagenase e dispase seguido por triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (&gt; 95% de células miogénicas) e um bom rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 5 x 10 células / g de tecido depois de 7 dias in vitro) para experiências em cultura. Esta abordagem baseia-se na incubação da população mista de células derivadas do músculo com microesferas contas magnéticas conjugadas com um anticorpo contra CD56 e, em seguida, passando células embora um campo magnético. As células CD56 + ligadas a microesferas são mantidas pelo campo enquanto que CD56 - células transitar livremente através da coluna. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada e cultivadas. Após um determinado intervenção, morfologia celular, e a expressão e localização de proteínas, incluindo os factores de transcrição nuclear pode ser quantificada utilizando rotulagem de imunofluorescência com anticorpos específicos e uma imagem pRATAMENTO e pacote de análise.

As células miogénicas purificada e fibroblastos podem ser cultivadas em meio de diferenciação adipogênica durante três dias, seguidos de meio de nutrição adipogénica de qualquer lugar entre 7-30 dias, para avaliar o seu potencial para a adipogénese. Usando as populações de células purificadas, Oil Red O coloração em combinação com a imunomarcação para marcadores de linhagem adipogï¿½icas e miogï¿½icas mostrou que apenas a fracção de fibroblastos era capaz de diferenciação de adipócitos (Figura 2). A acu...

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

O objetivo geral deste procedimento é separar as duas principais populações de células obtidas a partir de amostras de biópsia muscular humana com alta eficiência e rendimento para permitir a avaliação de marcadores fenotípicos e de fatores de transcrição específicos. Isso é conseguido pela primeira dissociação, uma amostra de biópsia de músculo humano em uma única suspensão de célula na segunda etapa. Após uma cultura de sete dias, as células são separadas por esferas imunomagnéticas classificadas em CD 56 positivas, que são células miogênicas e frações CD 56 negativas, que são os fibroblastos.As células são então coradas e fotografadas para os marcadores fenotípicos e proteicos desejados de interesse. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência e a análise quantitativa de imagens podem ser usadas para medir a intensidade de fatores de transcrição localizados nucleares selecionados dentro das populações de células classificadas. As principais vantagens desta técnica, que usa classificação de células imunomagnéticas em relação aos métodos existentes, como classificação de células ativadas por fluorescência, são que ela é suave, permite excelente classificação de células musculares primárias humanas com alto rendimento e viabilidade e pode ser realizada rapidamente.As implicações desta técnica se estendem ao aumento de nossa compreensão da base celular da degeneração do músculo fibrogorduroso observada no envelhecimento, bem como em uma série de patologias musculares Para isolar as células precursoras derivadas do músculo o mais rápido possível após a obtenção da biópsia. Primeiro, determine o peso da amostra de tecido e, em seguida, inche o músculo em meio basal várias vezes para lavar a amostra sem excesso de sangue. Deixe o músculo sedimentar à temperatura ambiente por 30 a 60 segundos e, em seguida, aspire todos, exceto os dois a três mililitros finais do meio, do tubo.Em seguida, inverta o tubo em uma placa de Petri estéril para permitir que o fluido restante carregue o músculo para a placa. Agora limpe a amostra de quaisquer pedaços visíveis de qualquer gordura ou tecido conjuntivo óbvio. Em seguida, gire o prato para mobilizar o meio restante e, em seguida, aspire todo o meio e adicione três mililitros de uma solução enzimática de colagenase e disbe por 100 a 400 miligramas de tecido e corte a amostra de músculo em pedaços cúbicos muito pequenos de um a dois milímetros.Quando a amostra estiver suficientemente picada. Use uma pipeta larga de 25 mililitros para transferir os fragmentos de tecido e a solução enzimática para um tubo cônico estéril de 10 a 20 mililitros. Lave a placa com mais três mililitros de solução enzimática e, em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir quaisquer fragmentos musculares restantes para o tubo.Coloque o tubo a 37 graus Celsius por 60 minutos. Refazer a suspensão de tecido a cada 15 minutos com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, termine a dissociação enzimática com pelo menos uma quantidade equivalente de meio de crescimento reaquecido fresco.Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de 100 micrômetros para remover quaisquer pedaços grandes de detritos e, em seguida, centrifugue as células novamente. Suspender o sedimento em sete a oito mililitros de meio de cultura e, em seguida, incubar as células num balão de cultura de tecidos T 25 não revestido. A 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por sete dias.No final da semana, a tripsina examina a monocamada celular por três minutos. Quando as células se desprenderem, adicione cinco a 10 mililitros de crescimento muscular esquelético, meio para evitar a digestão excessiva e aplique as células por centrifugação. Então, após a contagem, reserve algumas das células para caracterização do marcador de linhagem celular e lave as células restantes em 15 mililitros de ganho de centrífuga PBS.Desta vez, ressuspenda o pellet em 170 microlitros de tampão de classificação máximo em temperatura ambiente e pipete suavemente para resus. Suspenda as células em 35 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti CD 56 bem misturados. Misturar a solução celular algumas vezes com pipeta e incubar a mistura durante 15 minutos a quatro graus Celsius com vegetação suave.Na metade do caminho após a incubação, lave a solução da célula e do grânulo com 10 mililitros de centrífuga tampão de classificação e reus. Suspenda o pellet em um mililitro de tampão de triagem fresco. Em seguida, lubrifique o filtro e a coluna de pré-separação com 500 microlitros de tampão de fornecimento.E então misture e transfira imediatamente todo o mililitro de suspensão celular através do filtro de separação pres e para a coluna, enxágue a coluna três vezes com um mililitro de lavagem de energia de tampão de origem, coletando a fração de fibroblastos não retém, passando pela coluna em um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo uma pequena quantidade de meio de crescimento. Em seguida, remova a coluna do ímã e pressione o êmbolo no topo da coluna para coletar a fração de célula positiva CD 56. Em um tubo cônico separado de 50 mililitros contendo crescimento quente, meio de crescimento médio é emitido a partir desta etapa.Se a classificação dupla for realizada, considere as frações celulares coletadas positivas e negativas. Se for necessário um fornecimento duplo para pureza extra, não coloque o meio no tubo de coleta positiva CD 56 na primeira classificação, mas repita as etapas a partir da lubrificação do filtro e da coluna no ponto final experimental apropriado. Fixe as culturas de células positivas para CD 56 em seu meio de cultura, usando um volume equivalente de formaldeído gelado a 8%.Os 10 minutos com vegetação suave. Em seguida, aspire o fixador e lave as células duas vezes com PBS para imunocorar os antígenos da superfície celular. Bloqueie as células por pelo menos uma hora em 1% BSA em PBS e, em seguida, rotule as células com os anticorpos primários e secundários relevantes.Otimize o ganho do detector, a potência do laser e as configurações de exposição relevantes para o seu microscópio e coloração. Antes da imagem, as células tiram as imagens das células no número desejado de canais de detecção e em mais de seis campos de visão diferentes. Para análise, abra os arquivos de imagem TIFF apropriados e arraste as imagens umas para as outras para sobrepor os canais correspondentes apropriados.Cada canal aparecerá como uma camada separada no painel de camadas. Em seguida, na janela de análise, escolha selecionar pontos de dados e, em seguida, personalizar e selecione as medidas desejadas. Para analisar a intensidade da fluorescência nuclear, abra a caixa de diálogo intervalo de cores e selecione as cores amostradas no menu suspenso.Em seguida, segurando a tecla shift, selecione os tons específicos dos núcleos rotulados. Clique em salvar para armazenar esta máscara de seleção de intervalo de cores para uso com outras imagens selecionadas na mesma sessão. Uma vez que os núcleos tenham sido selecionados, escreva, clique e selecione preencher.Em seguida, escolha preto no menu suspenso e confirme se a opacidade está definida como 100%Em seguida, clique em selecionar e inverter. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e escolha Preencher novamente e escolha um preenchimento branco no menu suspenso. Execute um algoritmo de bacia hidrográfica para separar quaisquer núcleos parcialmente sobrepostos na camada nuclear agora binária.Vá para selecionar, em seguida, intervalo de cores e, em seguida, sombras para selecionar os núcleos individuais separados. Em seguida, transfira a seleção para a camada que contém uma imagem em escala de cinza de 16 bits do marcador desejado e clique em registrar medidas. Por fim, exporte as medições selecionadas como arquivos de texto para o software de análise apropriado para processamento posterior de óleo.A coloração vermelha das populações de células purificadas em combinação com a coloração imuno para marcadores de linhagem adipogénica e miogénica revela que apenas a fração de fibroblastos é capaz de uma diferenciação epigénica, sendo visível a olho nu a acumulação maciça de gordura pelos fibroblastos e com mais demonstração da sua transformação completa pela forte expressão de PPAR gama nuclear por estas células no dia 15 de tratamento, essas células liberaram qualquer antígeno de tecido conjuntivo TE seven A restante em seu substrato. Por outro lado, as células miogênicas mantêm seu fenótipo normal, incluindo sua expressão de desmina e cadeia pesada de miosina sem regulação positiva da expressão nuclear de PPAR gama. Nesta figura, um exemplo da análise quantitativa de um campo de células miogênicas positivas para Desmond e o campo do qual esses dados foram obtidos são mostrados, ilustrando a variação da expressão miogênica em núcleos individuais nesta densidade de semeadura específica e ponto de tempo.Neste gráfico, é demonstrada a utilidade do método para comparar diretamente os níveis de fator de transcrição em diferentes tipos de células em um nível de célula por célula. Por exemplo, esses fibroblastos musculares negativos para CD 56 expressam um alto nível do fator de transcrição adipogênico nuclear, PPAR gama, enquanto as células miogênicas positivas para CD 56 mantêm apenas níveis muito baixos de fator de transcrição do receptor nuclear após a exposição ao meio indutor de adipócitos. Essa técnica permite que pesquisadores no campo da biologia muscular explorem os mecanismos de decisões de destino celular em amostras de músculos humanos saudáveis ou patológicos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter, em primeiro lugar, uma boa compreensão de como obter altos rendimentos de células derivadas de músculos humanos purificados e bem caracterizados e, em segundo lugar, como realizar uma análise quantitativa objetiva dos constituintes celulares identificados por coloração imunofluorescente.

isolation-quantitative-immunocytochemical-characterization-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo.  Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita.  Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo.  os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Esse protocolo descreve o isolamento de fibras musculares únicas intactas do sóleo oxidativo e o estabelecimento de culturas de mioblast altamente purificadas derivadas dessas fibras. O procedimento otimizado gera de forma confiável aproximadamente 300–500 miofibras intactas por camundongo, permitindo análises moleculares e celulares posteriores.

Ensaio de Isolamento de Fibra Única para Avaliação do Comportamento da Miofibra Oxidativa

Aprenda a isolar células miogênicas e fibroblastos de biópsias musculares humanas usando separação imunomagnética por CD56. Esta técnica permite alta viabilidade e rendimento para análise de marcadores fenotípicos e fatores de transcrição por imunofluorescência quantitativa.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Explorar mais vídeos