Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

O objetivo geral deste procedimento é separar as duas principais populações de células obtidas a partir de amostras de biópsia muscular humana com alta eficiência e rendimento para permitir a avaliação de marcadores fenotípicos e de fatores de transcrição específicos. Isso é conseguido pela primeira dissociação, uma amostra de biópsia de músculo humano em uma única suspensão de célula na segunda etapa. Após uma cultura de sete dias, as células são separadas por esferas imunomagnéticas classificadas em CD 56 positivas, que são células miogênicas e frações CD 56 negativas, que são os fibroblastos.

As células são então coradas e fotografadas para os marcadores fenotípicos e proteicos desejados de interesse. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência e a análise quantitativa de imagens podem ser usadas para medir a intensidade de fatores de transcrição localizados nucleares selecionados dentro das populações de células classificadas. As principais vantagens desta técnica, que usa classificação de células imunomagnéticas em relação aos métodos existentes, como classificação de células ativadas por fluorescência, são que ela é suave, permite excelente classificação de células musculares primárias humanas com alto rendimento e viabilidade e pode ser realizada rapidamente.

As implicações desta técnica se estendem ao aumento de nossa compreensão da base celular da degeneração do músculo fibrogorduroso observada no envelhecimento, bem como em uma série de patologias musculares Para isolar as células precursoras derivadas do músculo o mais rápido possível após a obtenção da biópsia. Primeiro, determine o peso da amostra de tecido e, em seguida, inche o músculo em meio basal várias vezes para lavar a amostra sem excesso de sangue. Deixe o músculo sedimentar à temperatura ambiente por 30 a 60 segundos e, em seguida, aspire todos, exceto os dois a três mililitros finais do meio, do tubo.

Em seguida, inverta o tubo em uma placa de Petri estéril para permitir que o fluido restante carregue o músculo para a placa. Agora limpe a amostra de quaisquer pedaços visíveis de qualquer gordura ou tecido conjuntivo óbvio. Em seguida, gire o prato para mobilizar o meio restante e, em seguida, aspire todo o meio e adicione três mililitros de uma solução enzimática de colagenase e disbe por 100 a 400 miligramas de tecido e corte a amostra de músculo em pedaços cúbicos muito pequenos de um a dois milímetros.

Quando a amostra estiver suficientemente picada. Use uma pipeta larga de 25 mililitros para transferir os fragmentos de tecido e a solução enzimática para um tubo cônico estéril de 10 a 20 mililitros. Lave a placa com mais três mililitros de solução enzimática e, em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir quaisquer fragmentos musculares restantes para o tubo.

Coloque o tubo a 37 graus Celsius por 60 minutos. Refazer a suspensão de tecido a cada 15 minutos com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, termine a dissociação enzimática com pelo menos uma quantidade equivalente de meio de crescimento reaquecido fresco.

Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de 100 micrômetros para remover quaisquer pedaços grandes de detritos e, em seguida, centrifugue as células novamente. Suspender o sedimento em sete a oito mililitros de meio de cultura e, em seguida, incubar as células num balão de cultura de tecidos T 25 não revestido. A 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por sete dias.

No final da semana, a tripsina examina a monocamada celular por três minutos. Quando as células se desprenderem, adicione cinco a 10 mililitros de crescimento muscular esquelético, meio para evitar a digestão excessiva e aplique as células por centrifugação. Então, após a contagem, reserve algumas das células para caracterização do marcador de linhagem celular e lave as células restantes em 15 mililitros de ganho de centrífuga PBS.

Desta vez, ressuspenda o pellet em 170 microlitros de tampão de classificação máximo em temperatura ambiente e pipete suavemente para resus. Suspenda as células em 35 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti CD 56 bem misturados. Misturar a solução celular algumas vezes com pipeta e incubar a mistura durante 15 minutos a quatro graus Celsius com vegetação suave.

Na metade do caminho após a incubação, lave a solução da célula e do grânulo com 10 mililitros de centrífuga tampão de classificação e reus. Suspenda o pellet em um mililitro de tampão de triagem fresco. Em seguida, lubrifique o filtro e a coluna de pré-separação com 500 microlitros de tampão de fornecimento.

E então misture e transfira imediatamente todo o mililitro de suspensão celular através do filtro de separação pres e para a coluna, enxágue a coluna três vezes com um mililitro de lavagem de energia de tampão de origem, coletando a fração de fibroblastos não retém, passando pela coluna em um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo uma pequena quantidade de meio de crescimento. Em seguida, remova a coluna do ímã e pressione o êmbolo no topo da coluna para coletar a fração de célula positiva CD 56. Em um tubo cônico separado de 50 mililitros contendo crescimento quente, meio de crescimento médio é emitido a partir desta etapa.

Se a classificação dupla for realizada, considere as frações celulares coletadas positivas e negativas. Se for necessário um fornecimento duplo para pureza extra, não coloque o meio no tubo de coleta positiva CD 56 na primeira classificação, mas repita as etapas a partir da lubrificação do filtro e da coluna no ponto final experimental apropriado. Fixe as culturas de células positivas para CD 56 em seu meio de cultura, usando um volume equivalente de formaldeído gelado a 8%.

Os 10 minutos com vegetação suave. Em seguida, aspire o fixador e lave as células duas vezes com PBS para imunocorar os antígenos da superfície celular. Bloqueie as células por pelo menos uma hora em 1% BSA em PBS e, em seguida, rotule as células com os anticorpos primários e secundários relevantes.

Otimize o ganho do detector, a potência do laser e as configurações de exposição relevantes para o seu microscópio e coloração. Antes da imagem, as células tiram as imagens das células no número desejado de canais de detecção e em mais de seis campos de visão diferentes. Para análise, abra os arquivos de imagem TIFF apropriados e arraste as imagens umas para as outras para sobrepor os canais correspondentes apropriados.

Cada canal aparecerá como uma camada separada no painel de camadas. Em seguida, na janela de análise, escolha selecionar pontos de dados e, em seguida, personalizar e selecione as medidas desejadas. Para analisar a intensidade da fluorescência nuclear, abra a caixa de diálogo intervalo de cores e selecione as cores amostradas no menu suspenso.

Em seguida, segurando a tecla shift, selecione os tons específicos dos núcleos rotulados. Clique em salvar para armazenar esta máscara de seleção de intervalo de cores para uso com outras imagens selecionadas na mesma sessão. Uma vez que os núcleos tenham sido selecionados, escreva, clique e selecione preencher.

Em seguida, escolha preto no menu suspenso e confirme se a opacidade está definida como 100%Em seguida, clique em selecionar e inverter. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e escolha Preencher novamente e escolha um preenchimento branco no menu suspenso. Execute um algoritmo de bacia hidrográfica para separar quaisquer núcleos parcialmente sobrepostos na camada nuclear agora binária.

Vá para selecionar, em seguida, intervalo de cores e, em seguida, sombras para selecionar os núcleos individuais separados. Em seguida, transfira a seleção para a camada que contém uma imagem em escala de cinza de 16 bits do marcador desejado e clique em registrar medidas. Por fim, exporte as medições selecionadas como arquivos de texto para o software de análise apropriado para processamento posterior de óleo.

A coloração vermelha das populações de células purificadas em combinação com a coloração imuno para marcadores de linhagem adipogénica e miogénica revela que apenas a fração de fibroblastos é capaz de uma diferenciação epigénica, sendo visível a olho nu a acumulação maciça de gordura pelos fibroblastos e com mais demonstração da sua transformação completa pela forte expressão de PPAR gama nuclear por estas células no dia 15 de tratamento, essas células liberaram qualquer antígeno de tecido conjuntivo TE seven A restante em seu substrato. Por outro lado, as células miogênicas mantêm seu fenótipo normal, incluindo sua expressão de desmina e cadeia pesada de miosina sem regulação positiva da expressão nuclear de PPAR gama. Nesta figura, um exemplo da análise quantitativa de um campo de células miogênicas positivas para Desmond e o campo do qual esses dados foram obtidos são mostrados, ilustrando a variação da expressão miogênica em núcleos individuais nesta densidade de semeadura específica e ponto de tempo.

Neste gráfico, é demonstrada a utilidade do método para comparar diretamente os níveis de fator de transcrição em diferentes tipos de células em um nível de célula por célula. Por exemplo, esses fibroblastos musculares negativos para CD 56 expressam um alto nível do fator de transcrição adipogênico nuclear, PPAR gama, enquanto as células miogênicas positivas para CD 56 mantêm apenas níveis muito baixos de fator de transcrição do receptor nuclear após a exposição ao meio indutor de adipócitos. Essa técnica permite que pesquisadores no campo da biologia muscular explorem os mecanismos de decisões de destino celular em amostras de músculos humanos saudáveis ou patológicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter, em primeiro lugar, uma boa compreensão de como obter altos rendimentos de células derivadas de músculos humanos purificados e bem caracterizados e, em segundo lugar, como realizar uma análise quantitativa objetiva dos constituintes celulares identificados por coloração imunofluorescente.