Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de Drosophila Junção Neuromuscular Morfologia

O objetivo geral deste procedimento é quantificar automaticamente as características morfológicas da junção neuromuscular de Drosophila usando macros de software morfométricas. Este método pode ajudar a identificar reguladores do desenvolvimento das sinapses, uma questão-chave na neurobiologia. A principal vantagem dessa técnica é a quantificação automática de vários recursos da JNM.

Isso permite uma análise objetiva da morfologia da JNM. Decidimos desenvolver esta metodologia para poder investigar a morfologia da JNM em uma grande quantidade de modelos de doenças. Pensamos em maneiras de prevenir suas diferenças pessoais e como acelerar significativamente o processo de quantificação.

A demonstração visual desse método é muito útil. As configurações de macro apropriadas são cruciais e algumas etapas podem ser difíceis para novos usuários, especialmente quando não estão familiarizados com o software VT. Para este protocolo, gere pilhas de imagens de NMJs e salve-as como arquivos TIFF individuais, onde o canal um mostra a coloração DLG1 ou um marcador semelhante e o canal dois mostra a coloração BRP.

Para começar, crie projeções C e hiperpilhas dos arquivos de imagem NMJ. Abra as opções do plugin e selecione Drosophila NMJ Morphometrics. Agora, identifique a string de arquivo exclusiva que o microscópio atribuiu à série de imagens ao armazená-las como TIFF.

Isso estará no final do nome da imagem. Copie e cole a string fornecida ao plano e número de canal mais baixos na janela de configuração de string de arquivo exclusiva. Em seguida, selecione a submacro converter em pilha e escolha o diretório ou pasta onde as imagens estão localizadas.

Para cada arquivo de imagem, dois novos arquivos são criados com os nomes padrão stack e flat stack, seguidos pelo nome da imagem original. Os arquivos originais podem ser excluídos para economizar espaço de armazenamento. Em seguida, na interface Drosophila NMJ Morphometrics, selecione a submacro definir ROI e escolha o diretório do arquivo de imagem.

Quando a primeira projeção for aberta, selecione a ferramenta de seleções à mão livre. Em seguida, use o mouse para definir uma região contendo um terminal NMJ completo de interesse. Uma vez selecionado, clique em OK na janela de definição de terminal.

Continue fazendo isso até que os terminais NMJ sejam definidos em todas as projeções. A macro avança o processo automaticamente. Para cada arquivo de imagem, um novo arquivo é feito com os nomes padrão ROI seguidos pelo nome da imagem original.

Para quantificar os recursos do NMJ, primeiro vá para a interface Drosophila NMJ Morphometrics e defina a escala. Por exemplo, se um pixel na imagem corresponder a 0,72 mícrons, defina os pixels de escala como um e a distância de escala como 0,072. Em seguida, selecione a submacro analisar e, se houver duas imagens de canal, alterne também o peso.

Pressione OK e, quando solicitado, selecione o diretório do arquivo de imagem. O tempo de processamento pode ser de vários minutos por sinapse. Após a análise, novos arquivos de imagem para cada sinapse analisada são armazenados na pasta parental e as medições quantitativas são os resultados.

arquivo txt. Inspecione todas as imagens e exclua imagens com erros de segmentação. Por exemplo, partes do terminal sináptico podem não estar incluídas no contorno amarelo.

Partes do plano de fundo podem ser incluídas no terminal sináptico. Uma linha de esqueleto azul pode se estender além do terminal sináptico. Pode haver muitas zonas ativas ou algumas zonas ativas podem permanecer não detectadas.

Se mais de 5% das imagens apresentarem erros de segmentação, explore diferentes algoritmos de análise para melhorar o processamento da imagem. As próximas seções de vídeo descrevem como definir muitas dessas configurações de análise de macro. Para ajustar o valor do raio da bola rolante para a macro, selecione três projeções NMJ Z que sejam representativas do conjunto de dados da imagem.

Exclua o nome da imagem res resultante e o nome da imagem da pilha de duas zonas ativas, criados anteriormente pela análise de submacro. Abra os arquivos de nome de imagem de pilha para cada imagem selecionada e, na barra de ferramentas, selecione dividir canais para criar uma imagem do canal um e uma imagem do canal dois e salve esses arquivos. Abra a imagem pertencente ao canal um, que neste caso corresponde à imunomarcação DLG um.

Agora, execute o filtro subtrair plano de fundo, encontrado na guia processo. Defina o raio da bola rolante para um valor que aumente o contraste entre a sinapse e o plano de fundo. Crie uma projeção Z com um tipo de projeção como intensidade máxima e salve a imagem.

Em seguida, execute o algoritmo de subtração de fundo com o novo raio da bola rolante em todas as projeções Z e salve os resultados. Para determinar os melhores limites automáticos para a macro, abra as projeções C salvas e execute o limite automático com a opção tentar tudo. A partir das imagens resultantes, encontre o algoritmo mais adequado para as imagens e continue usando essa configuração de limite ao executar a macro para outras imagens.

Definir os diferentes limites automáticos é fundamental para a segmentação adequada da imagem pela macro. Por esse motivo, para quantificar adequadamente oito dos parâmetros de sinalização, é importante estar familiarizado com as 16 opções de limite automático oferecidas pelo software. Pressione o botão de adição para ampliar a imagem de resultado do limite automático.

Os nomes dos algoritmos estão localizados abaixo de cada imagem de resultado. Neste exemplo, o melhor algoritmo de limite automático para a configuração do limite de contorno NMJ é Huang. Para o limite do esqueleto, a melhor configuração é Li e a melhor configuração para o limite da zona ativa é Huang.

Para definir o valor máximo de tolerância ao ruído para a macro, retorne às imagens NMJ representativas originais. Abra o canal BRP. Vá para a guia de plug-ins no menu pop-up e selecione 3D máximo.

Após um curto período de tempo, uma nova imagem aparecerá e fechará a imagem original. Em seguida, use o comando 3D mínimo. Em seguida, feche o máximo de pilhas C2 sinapse uma imagem e selecione a imagem recém-criada mínima de máximo de sinapse de pilha C2 um.

Agora use o comando find maxima. Na nova janela, selecione a seleção do ponto de visualização e defina a tolerância de ruído para 50. Os pontos máximos são então indicados com pequenas cruzes, que devem cobrir apenas as zonas ativas da sinapse.

Se forem feitos muitos cruzamentos, aumente o valor de tolerância ao ruído. Se algumas das zonas ativas não estiverem anotadas, diminua o valor de tolerância ao ruído. Use o valor de limite derivado para o campo de tolerância de ruído find maxima da macro.

Escolhendo o valor máximo de tolerância ao ruído, é importante quantificar adequadamente o número de zonas ativas. Às vezes, é necessário tentar valores diferentes para definir o valor adequado. Agora ajuste todos os valores derivados nos algoritmos de limite na interface de macro e execute a análise de submacro nas imagens representativas que foram originalmente usadas para definir as configurações de macro.

Um novo arquivo com as zonas ativas indicadas por pontos brancos será criado. Abra este arquivo arrastando e soltando-o na barra de ferramentas e selecionando o projeto Z com um tipo de projeção como algumas fatias. Assim, é feito um arquivo de projeção.

O próximo passo é ajustar o limite. Na nova janela de limite, deslize a barra superior para escolher um valor limite onde todos os focos desejados são lidos. Esses são os pontos positivos do BRP.

Use esse valor como limite inferior do ponto BRP. Agora, execute novamente a análise nas imagens NMJ representativas originais usando os valores definidos anteriormente, algoritmos e, em seguida, o novo valor de limite inferior do ponto BRP. As imagens resultantes devem atender aos critérios de análise crítica.

Agora use as configurações de definição para executar a macro em todas as imagens NMJ obtidas nas mesmas condições. A macro morfométrica Drosophila NMJ foi usada para validar diferentes defeitos sinápticos conhecidos em três genótipos mutantes. Ankyrin dois mutantes são conhecidos por terem fundido boutons e NMJs menores.

Usando a macro, a área e o perímetro de panuronil e quirina dois RNAI knock down NMJs foram medidos e considerados significativamente menores do que os controles. O GTPase Rab3 é necessário para a distribuição adequada de bruckpila. Quando interrompido, há menos zonas ativas.

Usando o macro panuronil, as moscas knock down tiveram uma média de 138 zonas ativas por terminal NMJ em comparação com 290 detectadas nos controles. O fio alto é um importante regulador do crescimento da JNM, e quando mutantes, as JNMs têm ramificações estendidas em seus terminais. Usando o macro panuronil, as linhas de derrubada de RNAI de fio alto mostraram aumentos significativos em vários parâmetros derivados do esqueleto em seus NMJs, incluindo comprimento total, comprimento de ramificação mais longo, número de ramificações e número de pontos de ramificação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como operar e ajustar as configurações da macro morfométrica Drosophila NMJ. Uma vez dominada, a análise de 50 sinapses pode ser feita em uma hora. Isso economiza aproximadamente 15 minutos de tempo de quantificação por sinapse.

É importante adquirir imagens de boa qualidade do NMJ. Quanto melhores as imagens, melhor será o desempenho da macro. Esta técnica ajudará os pesquisadores no campo da neurobiologia a quantificar com eficiência os parâmetros morfológicos da Drosophila NMJ.