Name: Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de Drosophila Junção Neuromuscular Morfologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda dois algoritmos de análise de imagem para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular de Drosophila. Este método computacional permite análise de alta vazão e objetiva em modelos de doenças.

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Reconhecemos centro de estoque de Viena Drosophila Resource Center e Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) para fornecer linhagens de Drosophila. Agradecemos Jack Fransen do Microscopical Imaging Center de apoio especializado em imagem. Este estudo foi apoiado por VIDI e concede superior (917-96-346, 912-12-109) da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), por duas bolsas de doutoramento DCN / Universidade Radboud Medical Center, pela Deficiência Mental rede alemã financiado pelo programa NGFN + do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) e pela Gencodys da União Europeia FP7 larga escala integrada de rede (Saúde-241995) para aS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

1. Requisitos Antes de Processamento de Imagem <ol><li> Executar Drosophila preparações livro aberto de larvas de terceira instar de errante (L3), como previamente descrito 19. </li><li> Co-immunolabel terminais Drosophila JNM usando uma combinação de dois marcadores: Dlg-1 ou em conjunto com HRP Brp para análise com &quot;Drosophila JNM Morfometria&quot;, e SYT ou CSp em conjunto com Brp para análise com &quot;Drosophila JNM Bouton Morfometria&quot; 20. NOTA: Os anticorpos da mesma espécie, podem ser combinados por pré-marcação um com um kit de anticorpo-conjugação tal como o Zenon Alexa Rotulagem Kits 17. </li><li> Imagem terminais MNJ usando um microscópio de escolha, por exemplo, fluorescência (com ou sem ApoTome) ou microscopia confocal. <ol><li> Adquirir uma pilha de 2-canal do terminal JNM. <ol><li> Ajustar as configurações de microscópio de um modo que o canal 1adquire do terminal JNM immunolabeled com Dlg-1 (ou de hrp, SYT, CSP) e o canal 2 do terminal JNM immunolabeled com Brp. </li><li> Opcionalmente, analisar imagens de um canal (de sinapses imunomarcadas com um único anticorpo) com as macros. NMJs imagem immunolabeled exclusivamente com Dlg-1 ou de hrp para análise com &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot;, ou SYT ou Csp para &quot;Drosophila MNJ Bouton Morfometria&quot;. NOTA: Não é possível analisar sinapses imunomarcadas com apenas anti-Brp. </li></ol></li><li> Exportar as imagens obtidas como .tiff individuais&#39;. Inverter a ordem dos canais, antes de executar as macros se não for adquirida como indicado. </li></ol></li></ol> 2. Requisitos e instalação de software <ol><li> Baixar as macros: &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot; e &quot;Drosophila MNJ Bouton Morfometria&quot; no seguinte site: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 21. </li><li> Mova o cursor para a pasta &quot;update Macros 1&quot; e clique na opção &quot;view&quot; que aparece. Uma lista com o conteúdo desta pasta irá aparecer. A pasta contém as macros &quot;Drosophila MNJ morfometria&quot; e &quot;Drosophila MNJ Bouton morfometria&quot;. NOTA: Ambas as macros são compatíveis com versões Fiji 1.4, que também é fornecido na mesma pasta. As macros podem não funcionar em versões recentes. Por favor utilize o fornecido versão 1.4. É problemático para começar esta versão, mesmo em computadores com um mais recente versão Fiji disponível. </li><li> Clique em &quot;Baixar todos&quot;. O conteúdo da pasta será baixado para o computador como um arquivo .zip. Descompacte o arquivo baixado. </li><li> Copie os arquivos de Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm e Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm para o diretório Fiji.app/plugins/. Quando reiniciar o programa, as macros aparecerá na parte inferior da Pluginsmenu suspenso. </li></ol> 3. Run Sub-macro &quot;Converter para Stack&quot; para criar Z-projeções e Hyperstacks das imagens MNJ <ol><li> Inicie a interface gráfica, selecionando Plugins na barra de ferramentas e escolha &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot; no menu suspenso. </li><li> Definir a configuração &quot;String Arquivo Único&quot; na interface gráfica do macro. NOTA: O software microscópio usa uma assinatura de identificação para organizar planos e canais ao armazenar pilhas como .tiff individuais&#39;. A configuração de string de arquivo exclusivo entrou precisa especificar a assinatura atribuído pelo software para o primeiro plano do primeiro canal (importante: menor avião e número do canal precisa ser indicado). </li><li> Selecione apenas a sub-macro &quot;Converter para empilhar&quot; e clique em &quot;ok&quot; e selecione a pasta onde as imagens estão localizadas. Se um diretório principal com várias subpastas é selecionada, todos individuais&#39; .tiff arquivos dentroo diretório principal e subpasta correspondem aos critérios de cordas de arquivo exclusivo será processado. <ol><li> Se o z-pilha contém apenas um canal, seleccionar a opção &quot;canal só um&quot;. </li></ol></li><li> Observe que dois novos arquivos por imagem MNJ, por padrão denominado como stack_image_name e flatstack_image_name aparecerá. Armazenar apenas estes pilha e flatstack para análise posterior. A série .tiff pode ser excluído neste momento, minimizando as capacidades de armazenamento necessários e evitando fontes de erro potenciais. </li></ol> 4. Executar Sub-macro &quot;Definir ROI&quot; para delinear o Terminal MNJ de Interesse <ol><li> Inicie a interface gráfica de &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot;. </li><li> Seleccione apenas a opção &quot;Definir ROI&quot; e pressione &quot;OK&quot; e selecione o diretório principal onde as imagens direito flatstack_name são armazenados e pressione &quot;Selecionar&quot;. O sub-macro &quot;Definir ROI&quot; procura automaticamente através de todas as subpastasdentro do diretório principal selecionado. </li><li> Como a primeira projeção se abre, selecione a opção &quot;seleções Freehand&quot; ferramenta na barra de ferramentas. Usando o mouse desenhe uma seleção que contém exclusivamente o terminal completa MNJ de interesse e clique em &quot;OK&quot; na janela &quot;Definir terminal&quot;. A macro irá prosseguir com o próximo projecção. </li><li> Delinear a próxima ROI e repetir até que todas as ROIs são definidos. O arquivo de imagem ROI, chamado &quot;roi_image_name&quot;, serão armazenados no mesmo diretório que as imagens de pilha e de projeção anteriormente geradas para cada uma das imagens processadas. A saída deste sub-macro é uma imagem binária do ROI em branco sobre um fundo preto. </li></ol> 5. Run Sub-macro &quot;Analisar&quot; para Quantificar Características MNJ Terminal <ol><li> Vá para a barra de ferramentas, selecione &quot;Plugins&quot; e uso: &quot;Drosophila _NMJ_Morphometrics&quot; quando analisando sinapses imunomarcadas com anti-Dlg-1 ou anti-HRP (canal 1), juntamentecom anti-Brp (dois canais), ou &quot;Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics&quot; quando analisam sinapses imunomarcadas com anti-SYT ou anti-CSP (canal 1), juntamente com o Brp (canal 2). <ol><li> Quando um canal de pilhas de imagens são para ser analisada (o canal estrutural Dlg-1 ou HRP para &quot;Drosophila_ NMJ_Morphometrics&quot;, ou SYT ou CSp para &quot;Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics&quot;), seleccionar o quadro &quot;Canal apenas 1&quot;. </li></ol></li><li> Ajustar a escala correspondente para as imagens a serem analisadas. Se um pixel da imagem corresponde a 2,5 mm, indicam Escala Pixels-= 1, escala-Distância em? M = 2,5. No caso de ambas as configurações são deixados em 0, a área MNJ, perímetro, comprimento e maior comprimento ramo será expressa em número de pixels. </li></ol><ol start="3"><li> Se necessário, ajuste as configurações de análise padrão da macro. Realizar ajustes apenas se a sub-macro &quot;Analisar&quot; (esta seção com resultados insatisfatórios, e determined melhores configurações na secção 6) foi executado. </li><li> Marque as caixas &quot;Analisar&quot; e &quot;Wait&quot; e pressione &quot;OK&quot;. <ol><li> Selecione a caixa de seleção &quot;Wait&quot; ao executar a sub-macro &quot;Analisar&quot; em 2 imagens dos canais. Caso contrário, erros na contagem zona ativa pode ocorrer devido a capacidades de computador limitados. </li></ol></li><li> Como uma nova janela &quot;Escolha uma Directory&quot; se abre, selecione o diretório onde as imagens estão localizadas e pressione &quot;select&quot;. A macro irá analisar todas as imagens armazenadas no diretório principal e, se aplicável, as pastas subsequentes (usando os três arquivos de executar os sub-macros anteriores: stack_image_name, flatstack_image_name e roi_image_name). Os macroprocessos cada imagem individual e consecutivamente. Isso pode levar vários minutos por pilha de imagens (dependendo da capacidade do computador). </li><li> Depois de executar a macro, note que um novo arquivo de imagem chamado res_image_name para cada analisados ​​sinapse armazenado será created na pasta dos pais. As medições quantitativas serão armazenados como arquivo &quot;results.txt&quot;. </li><li> Inspecione todas as imagens de resultado para detectar e excluir fotos com erros de segmentação. Erros de segmentação possíveis são descritos na Tabela 3, juntamente com conselhos como ajustar as definições para contornar estes. Imagens resultado com tais erros de segmentação são fornecidos como exemplos na Figura 4. NOTA: Ao executar o macro com as configurações padrão observados na interface do usuário, houve uma precisão de cerca de 95% quando a avaliação macro foi comparado com avaliação manual 17. </li></ol> 6. Ajuste as configurações de macro para as Imagens <ol start="1"><li> Quando mais de 5% das imagens mostram erros de segmentação, explorar os diferentes algoritmos para definir / escolher as configurações de macro mais adequados para as imagens. </li><li> Ajuste rolando valor de raio bola NOTA: O raio de bola rolandofunção subtrai o fundo da imagem. Esta função é de importância crucial quando se trabalha com imagens adquiridas em microscópios de fluorescência e / ou quando as imagens têm de ruído elevado ruído de fundo. A subtração do fundo vai ajudar etapas auto-thresholding do macro para produzir segmentação adequada dos terminais MNJ. <ol><li> Selecione três Z-projeções MNJ (imagens flatstack_image_name gerados pelo sub-macro &quot;Converter para empilhar&quot;) que são representativos do conjunto de dados de imagem. </li><li> Na barra de ferramentas, selecione Imagem | Cor | canais de Split. Duas imagens será criado, um representando um canal e o outro canal 2. </li><li> Manter somente a imagem que pertence a um canal aberto, que corresponde a Dlg-1, de hrp, SYT ou CSp imunomarcação, e descartar a imagem do canal Brp fechando a imagem. </li><li> Execute o filtro &quot;background Subtrair&quot; selecionando &quot;Processo&quot; na barra de ferramentas, seguido de &quot;Background Subtrair ...&quot; no menu suspenso. </li><li> Clique na caixa de pré-visualização em que a janela e ajustar o raio da esfera de rolamento para o valor que aumentar o contraste entre o fundo e sinapse como no painel (Figura 5A&#39;). NOTA: Veja a Figura 5 para um exemplo. Em Figure5A, partes da sinapse são mostrando os mesmos níveis de cinzento como o fundo, ao passo que na Figura 5A&#39; o &#39;rolamento raio da esfera&#39; definida como 500 gera um forte contraste entre a sinapse e o fundo. </li><li> Quando o valor apropriado para o raio bola rolar é definido, execute o algoritmo de &quot;background Subtrair&quot; nos Z-projeções selecionados com o mesmo valor de raio bola rolando e salvá-los (em qualquer diretório). NOTA: O valor do raio bola rolando para 8 bits ou imagens RGB deve ser pelo menos tão grande como o raio do maior objeto na imagem que não faz parte do plano de fundo. Para imagens de 16 bits e 32 bits do raio deve ser inversely proporcional à faixa de valor de pixel 22. </li></ol></li><li> Determinar as diferentes auto-limiares que serão usados <ol><li> Abra os Z-projeções salvos na etapa anterior (6.2.6) e Selecionar imagem | Ajuste | AutoThreshold | Tente todos. </li><li> Como uma imagem resultado thresholded binário aparecerá com todos os diferentes algoritmos de auto-limiar, determinar o algoritmo mais adequado para as imagens. <ol><li> Ao executar o macro mais tarde, alterar o limite nas configurações de macro em conformidade. </li><li> Use limites mais restritivos como &quot;RenyiEntrophy&quot; ou &quot;Momentos&quot;, como o limite de contorno MNJ e limiares mais permissivas, como &quot;Li&quot; para determinar o esqueleto MNJ, e &quot;Huang&quot; para determinar zonas ativas. Quando as imagens são muito nítidas com pouco ou nenhum fundo, use &quot;Huang&quot; como&quot; limiar esboço MNJ. Caso contrário partes da sinapse pode estar faltando depois de segmentação de imagens. </li><li> Ver Figura 5B para um exemplo. adequada segmentação da sinapse é obtido com auto-limiares destacadas por caixas verdes. Alguns exemplos de limiares não-adequados são realçadas por caixas vermelhos (vá sinapses em alta ampliação). Neste último, tanto as partes da sinapse estão faltando ou partes do fundo estão incluídos. Ver referência 23 para mais informações. </li></ol></li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Determinar o tamanho máximo das partículas pequenas NOTA: Esta função irá excluir todas as partículas detectadas pelo limiar esboço MNJ e limite de esqueleto que são menores do que o valor definido na &quot;definição pequenas partículas&quot; da análise. Este valor é definido em pixels. Esta função serve como um filtro de ruído e é muito útil quando as altas taxas de fundo não uniforme (como cristais / pó) estão presentes nas imagens obtidas. <ol><li> Abra os Z-projecções guardados no passo 6.2.6. e definira escala para detectar número de pixels através Analisar | Set Scale. Aplicar as seguintes configurações: distância em pixels = 1, conhecida distância = 1, proporção de pixel = 1, unidade de comprimento = pixels e pressione &quot;Ok&quot;. Clique na ferramenta &quot;seleção Oval&quot; na barra de ferramentas. </li><li> Utilizando o rato desenhar uma selecção circundante estreitamente partículas individuais que estão presentes no imunocoloração mas não pertencem ao MNJ. Pressione Ctrl + m para um usuário do Windows ou CMD + m para usuários de Mac. Uma janela de resultado será aberta, indicando a área das partículas seleccionadas em número de pixels. </li><li> Repetir os passos anteriores várias vezes com vários artefactos presentes nas imagens para determinar a maior área de contaminação da partícula / artefato. Este será o valor a ser definido na configuração durante a execução do macro mais tarde. Ao executar a macro definir a &quot;partículas de tamanho pequeno&quot; como o menor tamanho de partícula pus observada uma margem de 25%. </li><li> Ver Figura 5D para um exemplo. A maior cristal detectared tem uma área de 112 pixels. A configuração &quot;tamanho Pequenas partículas&quot;, ao processar esta imagem com o macro, deve ser definida a 125 - 150. </li></ol></li></ol><ol start="5"><li> Determine o tamanho mínimo bouton NOTA: Esta função irá excluir todos os boutons detectados pelo limiar esboço MNJ que são menores do que o valor definido a partir da análise. Este valor é definido em pixels. <ol><li> Seguir os mesmos passos como descrito na secção 6.4, mas neste caso estabelecer uma selecção circundante as menores boutons presentes no terminal JNM. Escolha a menor área correspondente ao menor bouton dos mais medidas. Este é o valor a ser definido na definição de tamanho mínimo bouton ao executar a macro mais tarde. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Definir &quot;Encontrar máximos de ruído tolerância&quot; valor <ol><li> Utilizar os Z-hyperstacks seleccionados na secção 6.2.1. </li><li> Na barra de ferramentas, selecione Imagem | Cor | canais de divisão para create 2 pilhas (para os canais 1 e 2) e manter a imagem que corresponde ao canal Brp aberta. Descartar a imagem outro canal fechando-o. </li><li> Vá até a aba plugins no menu pop-up, selecione Processo | Máxima (3D), e quando o maximum_image_name aparece (que pode levar até alguns minutos), feche a pilha imagem original. </li><li> Selecione a Máxima ... image_name (a pilha imagem obtida) e selecione Plugins | processo | Mínimo (3D), feche o máximo ... pilha image_name. </li><li> Na barra de ferramentas, selecione Processo | Encontrar maxima .... Uma nova janela &quot;Encontrar maxima ...&quot; será aberta. Clique no botão &quot;seleção de ponto de visualização ...&quot; caixa de seleção e preencher a caixa de &quot;tolerância Noise&quot; com a configuração 50. Os pontos máximos será indicado na imagem como pequenas cruzes macro padrão. <ol><li> Aumentar o valor &quot;tolerância Noise&quot; se observar um excesso de zonas ativas anotados, ou seja cruzes que não estão no topo de zonas ativas que estão emse concentrar no plano pilha selecionada, ou zonas ativas falsos que são detectados no fundo. <ol><li> Por outro lado, se observando incompleta anotada zonas ativas, ou seja, zonas ativas em foco não ser rotulado reconhecido, diminua o valor &quot;tolerância Noise&quot;. Continue tentando valores diferentes seguintes este procedimento até que as cruzes são rotular adequadamente zonas ativas em foco. Encha o &quot;Find a tolerância de ruído máximos&quot; com este valor. </li><li> Ver Figura 5C para um exemplo. Muitas zonas ativas são detectados. Na Figura 5C&#39; apenas as zonas ativas em foco são detectados. </li></ol></li></ol></li><li> Execute o sub-macro &quot;Analisar&quot; para as imagens representativas selecionados na etapa 5.1, com as configurações definidas em todas as etapas anteriores. </li></ol></li><li> Ajuste-Brp pontos lacrimais limiar superior e inferior <ol><li> Observe que um novo arquivo será exibido após a execução do macro de acordo com a etapa 6.6, chamado 2_active_zone_stack_image_name. Nesta imagem empilhar as zonas activas detectados pela função &quot;Encontrar máximos&quot; são indicadas por pontos brancos em cada avião. </li><li> Abrir este arquivo, arrastando e soltando-o na barra de ferramentas e selecione Imagem | Stack | Zproject | Tipo de projecção = fatias Sum. será obtida uma projecção do 2_active_zone_stack_image_name. </li><li> Selecionar Imagem | Ajuste | Limite. Uma nova janela &quot;Threshold&quot; será aberta. Deslizar a barra superior para escolher um valor limiar, onde, todos os pontos / focos desejado Brp-positivos são visualizados no vermelho. NOTA: Se o limite é muito baixo, um excesso de zonas ativas serão contadas. Se for definido muito alto, uma fração das zonas ativas serão perdidas. <ol><li> Ver Figura 5E para um exemplo. Quando limiar é ajustado para 400, a maior parte das zonas activas (simbolizados como um pixel de focos 1) não estão incluídos na segmentação, uma vez que eles não são destacadas em vermelho (Figura 5E). Quando limiar é ajustado a um valor de 50 todas as zonas activas são destacadas em vermelho (Figura 5E). </li></ol></li><li> Definir esse valor como limite mínimo. Deixar &quot;limiar puncta superior&quot; no valor máximo. </li><li> Execute novamente o sub-macro &quot;Analisar&quot; para as imagens representativas com as configurações definidas em todas as etapas anteriores desta seção. Avaliar criticamente os arquivos de imagem resultantes e certificar-se de que a segmentação é feito corretamente. Se este não é o caso reajustar as definições de acordo com a natureza dos erros de segmentação (Figura 4, Tabela 3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li>
<li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li>
<li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li>
<li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+form+to+function%3A+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li>
<li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li>
<li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic%2Flarval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function%2C+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li>
<li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li>
<li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li>
<li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li>
<li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhof%2C+B+%22Drosophila+NMJ+Morphometrics%22">Drosophila NMJ Morphometrics</a>. , figshare 
 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
">https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
</a> (2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html</a> (2014).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/Auto_Threshold">http://fiji.sc/Auto_Threshold</a> (2014).</li>
<li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li>
<li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3%3A+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li>
<li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li>
<li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-type+specific+functions+of+DNT1%2C+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902(2013).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

&quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot; e &quot;Drosophila MNJ bouton Morfometria&quot; são ferramentas poderosas para pesquisadores interessados em avaliar a morfologia sinapse. avaliação manual dos parâmetros MNJ é trabalhoso; estima-se que as macros iria salvar um investigador experiente até 15 min / MNJ gasto em segmentação de imagem manual. Com uma a duas dezenas de sinapses avaliadas por condição ou genótipo, este rapidamente resume a uma quantidade considerável de tempo economizado, mesmo em estudos de pequena escala. Ao realizar telas grandes, o ganho do uso de análise de alto rendimento, em comparação com a avaliação manual e quantificação, pode ser imenso. Além do aumento de taxa de transferência, as macros prontamente fornecer análise objectiva; excluem preconceitos pessoais que de outra forma exigem experimentos cegos, bem como diferenças interpessoais que ocorrem quando vários pesquisadores estão envolvidos na análise. Finalmente, as macros fornecem uma uma sensível e precisoANÁLISE das características JNM, permitindo a identificação de reguladores sinápticos que provocam, em vez subtil do que defeitos JNM dramáticas e até agora não apreciado permaneceram pelo olho do investigador. Informações detalhadas sobre procedimentos de validação e os algoritmos utilizados nas macros são encontrados na publicação Nijhof et al. 17. A funcionalidade das macros foi validado para medir apropriadamente características morfológicas de Drosophila melanogaster NMJs no músculo 4. Subsequentemente, foi demonstrado que as macros foram também adequado para analisar as sinapses em outros músculos neste organismo. É provável que as macros também pode ser utilizado para medir os parâmetros morfológicos de JNM com estrutura semelhante, em outras espécies, incluindo outras espécies de Drosophila e outros insectos. Mesmo NMJs muito distantes em evolução, por exemplo, NMJs de ratinhos, apresentam uma conformação estrutural muito semelhante 29. As macros não foram testados sobre os preparativos MNJ de outras espécies, mas potenciais utilizadores são encorajados a testar as macros para tais fins. É muito importante que o usuário explora as diferentes auto-limiares e algoritmos para definir / escolher as configurações de macro mais adequados para as imagens. Com estas definições, uma precisão de cerca de 95% é alcançado quando a avaliação macro foi comparada à avaliação manual. Ajustar as configurações de macro para adequadamente segmento 100% das imagens pode ser um procedimento muito trabalhoso ou mesmo impossível. Portanto, a exclusão de imagens não devidamente segmentadas é recomendado se seus números são inferiores a 5%. Evidentemente, se a qualidade das imagens é baixo, as macros irá gerar índices mais elevados de segmentações imagem insatisfatórios. imagens de baixa qualidade irá influenciar semelhante avaliação manual e não pode, portanto, ser associado ao desempenho das macros. No entanto as macros são bastante robustos como eles foram projetados para a imagems gerados em um alto conteúdo microscópio (um microscópio de fluorescência automatizada que permite imagens de um grande número de amostras) 17. Um ponto crítico é que o utilizador inspecciona visualmente todas as imagens resultados gerados por as macros. Isso permitirá detectar e excluir fotos com segmentação insatisfatória. Na secção 6 deste protocolo, o usuário é guiado como ajustar as configurações de segmentação de imagem correta ao executar a sub-macro &quot;Analisar&quot;. Para familiarizar rapidamente com as exigências das macros e como ajustar as configurações de macro uma pasta chamada &quot;Examples_adjusting configurações de macro&quot; está incluído no macro repositório https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Treze subpastas, cada um com exemplos de imagens obtidas em diferentes plataformas de microscópio (microscópios elevado teor / confocal / fluorescência) e diferentes colorações imunológicas, são fornecidos. A PDF intitulado “Exemplos guia” está incluído na mesmapasta onde as configurações necessárias para cada exemplo são fornecidos, juntamente com um documento de texto fornecendo os resultados esperados e imagens resultados. As macros foram projetadas para processar imagens guardadas como .tiff arquivos separados, no entanto alguns usuários podem ter salvo suas imagens em um formato diferente. A seguir https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a website 21 contém uma pasta chamada &quot;Drosophila MNJ&quot;, onde três arquivos de exemplo (Exemplo 1-3) eo &quot;Guia de exemplos&quot; do documento com instruções detalhadas sobre como importar imagens para o macro se não for armazenado como .tiff arquivos separados também podem ser encontradas na mesma pasta. Juntos, &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot; e &quot;Drosophila MNJ bouton morfometria&quot; macros quantificar dez diferentes características MNJ: área MNJ, perímetro MNJ, Número de boutons, área bouton MNJ, comprimento MNJ, MNJ mais longo comprimento ramo, Número de islaNDS, número de agências, número de pontos de ramificação e número de zonas ativas. Isto proporciona uma grande vantagem sobre as ferramentas até agora disponíveis, que pode avaliar apenas uma ou algumas características sinápticas 30, 31. Análise quantitativa multiparamétricas tem grande potencial para novas descobertas, por exemplo, para identificar novos reguladores que controlam um até vários aspectos da biologia sinapse. Ele também proporciona a resolução necessária para determinar genes que coregulate exactamente as mesmas características ou sobrepostos JNM e assim são susceptíveis de operar em vias moleculares comuns. Finalmente, ele abre a possibilidade de investigar como diferentes parâmetros sinápticas se correlacionam com o outro em condições não perturbadas 17 e que genes garantir tais correlações morfométricas coordenadas. Tomados em conjunto, este protocolo ilustra como usar as duas macros &quot;Drosophila MNJ Morfometria&quot; e&quot;Drosophila JNM Bouton Morfometria&quot;, que executam a quantificação objectivo e sensível de dez características morfológicas JNM de um modo de elevado rendimento.

Distúrbios cognitivos tais como deficiência mental, perturbação do espectro do autismo e esquizofrenia são frequentemente caracterizadas por função anormal sináptica 1, 2, 3. morfologia e função sinapse são firmemente interligados; defeitos morfológicas pode causar mau funcionamento sináptica e, inversamente, a transmissão sináptica aberrante terá impacto maturação sináptica e morfologia 4, 5, 6. Uma série de organismos modelo têm sido empregadas, a fim de melhor compreender a biologia sinapse e lançar luz sobre como as mudanças sinápticas afetar a função cerebral na saúde e na doença 7, 8, 9. A Drosophila JNM é um extensivamente estudada e bem estabelecido modelo in vivo para sy glutamatérgicanapse biologia 10, 11. Nas últimas décadas, este modelo tem sido utilizado para estudos fisiológicos e focada para o gene, assim como para rastreios genéticos grande escala, com o objectivo de detectar diferenças morfológicas entre NMJs. Em particular, telas para a frente genéticas identificaram muitos reguladores cruciais e mecanismos subjacentes ao desenvolvimento sinapse e funcionar 12, 13, 14, 15, 16. No entanto, a maior parte destes ecrãs baseado na avaliação visual da JNM morfologia terminal e na detecção qualitativa das alterações sinápticas ou de pontuação semi-quantitativo de algumas características morfológicas. Como consequência, anormalidades morfológicas sinápticas em vez sutis que não são óbvias para o olho humano são facilmente perdidas. A fim de ser capaz de detectar de forma abrangente diferenças quantitativas, asJNM tem de ser avaliado de forma precisa por quantificação sistemática dos parâmetros morfológicos de interesse. Medindo características JNM manualmente é trabalhoso, especialmente quando há vários recursos JNM de interesse e / ou ao realizar rastreios genéticos de grande escala. A fim de apoiar multiparamétrica, análise morfológica de alto rendimento e para conseguir a quantificação objectivo, dois macros &quot;Drosophila JNM Morfometria&quot; e &quot;Drosophila JNM Bouton Morfometria&quot; foram desenvolvidos 17. Ambas as macros executar no open source software de análise de imagem Fiji 18, e pode quantificar ambas as imagens confocal e nonconfocal. Medidas &quot;Drosophila JNM Morfometria&quot; terminais JNM imunocoradas com o disco pós-sináptica marcador grande-1 (Dlg-1) ou a peroxidase de rábano pré-sináptico (HRP), co-marcadas com o marcador bruchpilot zona activa (Brp). Ele quantifica nove Parame morfológicaters (descrito abaixo): área JNM, perímetro JNM, Número de boutons, comprimento JNM, JNM maior comprimento dos ramos, número de ilhas, número de ramos, número de pontos de ramificação e número de zonas activas no terminal sináptico (Figura 1) . Embora um algoritmo para determinar o número de boutons está presente nesta macro, não satisfazer os critérios de precisão 17. Para avaliar correctamente o número de boutons, é necessário usar a macro &quot;Drosophila JNM Bouton Morfometria&quot;, o qual é especificamente concebido para quantificar boutons usando preparações JNM imunocoradas pelo anti-sinaptotagmina (SYT) ou proteína de cadeia anti-cisteína (CSP), e co-immunolabeled com Brp. A macro &quot;Drosophila MNJ Bouton Morfometria&quot; quantifica os seguintes parâmetros: número de boutons, área bouton MNJ, comprimento MNJ, MNJ maior comprimento ramo, número de ilhas, número de agências, número de pontos de ramificação e número de zo ativanes (Figura 2). As macros consistem em 3 sub-macros: (I) &quot;Converter para empilhar&quot; identifica todos os arquivos de imagem disponíveis e cria Z-hyperstacks e projeções de intensidade máxima de ambos os canais. Como saída, esta macro irá gerar dois novos arquivos por sinapse chamado &quot;stack_image_name&quot; e &quot;flatstack_image_name&quot;. II) &quot;define ROI&quot; vai abrir todas as imagens de projecção máximos &quot;flatstack_image_name&quot; consecutivamente e apresentá-los com o pedido para definir manualmente a região de interesse (ROI) no qual o terminal sináptico específico de interesse está presente. Isto foi implementado para permitir a exclusão de sinapses de ligação para músculos adjacentes e / ou outros tipos de terminais sinápticos (tais como 1s) que podem estar presentes nas imagens 11. (III) &quot;Analisar&quot; Aplica-se totalmente automatizado de análise para todas as regiões das imagens dentro das fronteiras do ROI. Comoresultado desta etapa, o usuário obterá dois novos arquivos: &quot;Results.txt&quot; onde toda a medida numérica será anotada e um &quot;res_image_name.tif&quot; onde as segmentações imagem subjacente produzidos pela macro será ilustrado. Durante a análise de imagem três estruturas são derivados a partir de cada terminal sináptico: o contorno JNM, o esqueleto JNM, e o número de zonas activas Brp-positivos. O contorno JNM é usada para determinar a área JNM e do seu perímetro e uma bacia de separação subsequente fornece o número de boutons. A partir do esqueleto, cinco características MNJ são deduzidos: o comprimento total MNJ, a soma do comprimento do mais longo caminho contínuo de conectar os dois pontos finais (maior comprimento de ramo), o número de compartimentos desconexos por MNJ (referido como &quot;ilhas&quot; ), o número de ramos, e o número de pontos de ramificação (um ponto de ramificação liga três ou mais ramificações). O número de zonas activas é determinado no Brp-canal por contagemmanchas BRP-positivos. O contorno anotada JNM (linha amarela), o esqueleto JNM (linha azul), e o número de zonas activas Brp-positivas (indicados por focos branco) são mostrados numa imagem de resultados e as medições dos parâmetros são processados ​​para uma (. txt) ficheiro de saída (Figura 3). Drosophila JNM Morfometria&quot; e &#39;Drosophila JNM Bouton Morfometria&#39; foram descritos pela primeira e extensivamente validado por Nijhof et ai. 17. Este manuscrito centra-se na metodologia para análise da morfologia JNM usando as macros &#39;Drosophila JNM Morfometria&#39; e &#39;Drosophila JNM Bouton Morfometria&#39;. no entanto, antes de análises macro-assistida, dissecações JNM e imunomarcações precisam ser executadas. Estes são passos cruciais, e a combinação de marcadores utilizados para imuno-histoquímica têm de ser adequados para análises macro. Estes passos são brevemente mencionado em sEç ã o 1 do presente protocolo e direccionar o utilizador para referências que descrevem em detalhe os protocolos para executar estes procedimentos.

<table><tbody><tr><td><forte>Imunocoloração</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Diluição</forte></td></tr><tr><td>Camundongo anti-discos grandes 1</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (em conjunto com o Kit de Rotulagem Zenon Alexa Fluor 528)</td></tr><tr><td>Peroxidase de Coelho anti-rábano</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Coelho anti-Sinaptotagmina</td><td>Presente de Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Proteína de corda anti-cisteína de camundongo</td><td>Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (conjuntamente usando o Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal ou microscópio de fluorescência</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>Mac ou PC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dois algoritmos para métodos de alta capacidade e multi-paramétrico quantificação de<em&gt; drosophila</em&gt; junção neuromuscular morfologia

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

morfologia sináptico é fortemente relacionada com a eficácia sináptica, e em muitos casos defeitos sinapse morfológicas em última análise, conduzir a mau funcionamento sináptica. A junção neuromuscular Drosophila larval (JNM), um modelo bem estabelecido para as sinapses glutamatérgicas, tem sido extensivamente estudado ao longo de décadas. Identificação de mutações que causam defeitos morfológicas JNM revelou um repertório de genes que regulam o desenvolvimento e função sinapse. Muitos deles foram identificados em estudos de grande escala que se concentravam em abordagens qualitativas para detectar anormalidades morfológicas da Drosophila MNJ. A desvantagem de análises qualitativas é que muitos jogadores sutis que contribuem para a morfologia MNJ provável passar desapercebido. Considerando análises quantitativas são necessários para detectar as diferenças morfológicas mais sutis, tais análises ainda não são comumente realizados porque são trabalhoso. Este protocolo descreve em detalhe dois algoritmos de análise de imagem &quot;Drosophila </em&gt; MNJ Morfometria&quot; e &#39;Drosophila MNJ Bouton Morfometria&#39;, disponível como macros Fiji compatíveis, para análise morfométrica quantitativa, precisa e objetiva da Drosophila MNJ. Esta metodologia é desenvolvida para analisar terminais MNJ imunomarcadas com os marcadores mais usados Dlg-1 e . brp Além disso, a sua aplicação mais alargada a outros marcadores tal como HRP, CSP e SYT é apresentada neste protocolo As macros são capazes de avaliar nove características JNM morfológicas:. área JNM, perímetro JNM, Número de boutons, comprimento JNM, JNM ramo mais longo comprimento, o número de ilhas, número de ramos, número de pontos de ramificação e número de zonas activas no terminal JNM.

Dois algoritmos de análise de imagem, &quot;Drosophila MNJ morfometria&quot; e &quot;Drosophila MNJ Bouton morfometria&quot; foram criados, para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular Drosophila (MNJ).

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção Neuromuscular Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar automaticamente as características morfológicas da junção neuromuscular de Drosophila usando macros de software morfométricas. Este método pode ajudar a identificar reguladores do desenvolvimento das sinapses, uma questão-chave na neurobiologia. A principal vantagem dessa técnica é a quantificação automática de vários recursos da JNM.Isso permite uma análise objetiva da morfologia da JNM. Decidimos desenvolver esta metodologia para poder investigar a morfologia da JNM em uma grande quantidade de modelos de doenças. Pensamos em maneiras de prevenir suas diferenças pessoais e como acelerar significativamente o processo de quantificação.A demonstração visual desse método é muito útil. As configurações de macro apropriadas são cruciais e algumas etapas podem ser difíceis para novos usuários, especialmente quando não estão familiarizados com o software VT. Para este protocolo, gere pilhas de imagens de NMJs e salve-as como arquivos TIFF individuais, onde o canal um mostra a coloração DLG1 ou um marcador semelhante e o canal dois mostra a coloração BRP.Para começar, crie projeções C e hiperpilhas dos arquivos de imagem NMJ. Abra as opções do plugin e selecione Drosophila NMJ Morphometrics. Agora, identifique a string de arquivo exclusiva que o microscópio atribuiu à série de imagens ao armazená-las como TIFF.Isso estará no final do nome da imagem. Copie e cole a string fornecida ao plano e número de canal mais baixos na janela de configuração de string de arquivo exclusiva. Em seguida, selecione a submacro converter em pilha e escolha o diretório ou pasta onde as imagens estão localizadas.Para cada arquivo de imagem, dois novos arquivos são criados com os nomes padrão stack e flat stack, seguidos pelo nome da imagem original. Os arquivos originais podem ser excluídos para economizar espaço de armazenamento. Em seguida, na interface Drosophila NMJ Morphometrics, selecione a submacro definir ROI e escolha o diretório do arquivo de imagem.Quando a primeira projeção for aberta, selecione a ferramenta de seleções à mão livre. Em seguida, use o mouse para definir uma região contendo um terminal NMJ completo de interesse. Uma vez selecionado, clique em OK na janela de definição de terminal.Continue fazendo isso até que os terminais NMJ sejam definidos em todas as projeções. A macro avança o processo automaticamente. Para cada arquivo de imagem, um novo arquivo é feito com os nomes padrão ROI seguidos pelo nome da imagem original.Para quantificar os recursos do NMJ, primeiro vá para a interface Drosophila NMJ Morphometrics e defina a escala. Por exemplo, se um pixel na imagem corresponder a 0,72 mícrons, defina os pixels de escala como um e a distância de escala como 0,072. Em seguida, selecione a submacro analisar e, se houver duas imagens de canal, alterne também o peso.Pressione OK e, quando solicitado, selecione o diretório do arquivo de imagem. O tempo de processamento pode ser de vários minutos por sinapse. Após a análise, novos arquivos de imagem para cada sinapse analisada são armazenados na pasta parental e as medições quantitativas são os resultados.arquivo txt. Inspecione todas as imagens e exclua imagens com erros de segmentação. Por exemplo, partes do terminal sináptico podem não estar incluídas no contorno amarelo.Partes do plano de fundo podem ser incluídas no terminal sináptico. Uma linha de esqueleto azul pode se estender além do terminal sináptico. Pode haver muitas zonas ativas ou algumas zonas ativas podem permanecer não detectadas.Se mais de 5% das imagens apresentarem erros de segmentação, explore diferentes algoritmos de análise para melhorar o processamento da imagem. As próximas seções de vídeo descrevem como definir muitas dessas configurações de análise de macro. Para ajustar o valor do raio da bola rolante para a macro, selecione três projeções NMJ Z que sejam representativas do conjunto de dados da imagem.Exclua o nome da imagem res resultante e o nome da imagem da pilha de duas zonas ativas, criados anteriormente pela análise de submacro. Abra os arquivos de nome de imagem de pilha para cada imagem selecionada e, na barra de ferramentas, selecione dividir canais para criar uma imagem do canal um e uma imagem do canal dois e salve esses arquivos. Abra a imagem pertencente ao canal um, que neste caso corresponde à imunomarcação DLG um.Agora, execute o filtro subtrair plano de fundo, encontrado na guia processo. Defina o raio da bola rolante para um valor que aumente o contraste entre a sinapse e o plano de fundo. Crie uma projeção Z com um tipo de projeção como intensidade máxima e salve a imagem.Em seguida, execute o algoritmo de subtração de fundo com o novo raio da bola rolante em todas as projeções Z e salve os resultados. Para determinar os melhores limites automáticos para a macro, abra as projeções C salvas e execute o limite automático com a opção tentar tudo. A partir das imagens resultantes, encontre o algoritmo mais adequado para as imagens e continue usando essa configuração de limite ao executar a macro para outras imagens.Definir os diferentes limites automáticos é fundamental para a segmentação adequada da imagem pela macro. Por esse motivo, para quantificar adequadamente oito dos parâmetros de sinalização, é importante estar familiarizado com as 16 opções de limite automático oferecidas pelo software. Pressione o botão de adição para ampliar a imagem de resultado do limite automático.Os nomes dos algoritmos estão localizados abaixo de cada imagem de resultado. Neste exemplo, o melhor algoritmo de limite automático para a configuração do limite de contorno NMJ é Huang. Para o limite do esqueleto, a melhor configuração é Li e a melhor configuração para o limite da zona ativa é Huang.Para definir o valor máximo de tolerância ao ruído para a macro, retorne às imagens NMJ representativas originais. Abra o canal BRP. Vá para a guia de plug-ins no menu pop-up e selecione 3D máximo.Após um curto período de tempo, uma nova imagem aparecerá e fechará a imagem original. Em seguida, use o comando 3D mínimo. Em seguida, feche o máximo de pilhas C2 sinapse uma imagem e selecione a imagem recém-criada mínima de máximo de sinapse de pilha C2 um.Agora use o comando find maxima. Na nova janela, selecione a seleção do ponto de visualização e defina a tolerância de ruído para 50. Os pontos máximos são então indicados com pequenas cruzes, que devem cobrir apenas as zonas ativas da sinapse.Se forem feitos muitos cruzamentos, aumente o valor de tolerância ao ruído. Se algumas das zonas ativas não estiverem anotadas, diminua o valor de tolerância ao ruído. Use o valor de limite derivado para o campo de tolerância de ruído find maxima da macro.Escolhendo o valor máximo de tolerância ao ruído, é importante quantificar adequadamente o número de zonas ativas. Às vezes, é necessário tentar valores diferentes para definir o valor adequado. Agora ajuste todos os valores derivados nos algoritmos de limite na interface de macro e execute a análise de submacro nas imagens representativas que foram originalmente usadas para definir as configurações de macro.Um novo arquivo com as zonas ativas indicadas por pontos brancos será criado. Abra este arquivo arrastando e soltando-o na barra de ferramentas e selecionando o projeto Z com um tipo de projeção como algumas fatias. Assim, é feito um arquivo de projeção.O próximo passo é ajustar o limite. Na nova janela de limite, deslize a barra superior para escolher um valor limite onde todos os focos desejados são lidos. Esses são os pontos positivos do BRP.Use esse valor como limite inferior do ponto BRP. Agora, execute novamente a análise nas imagens NMJ representativas originais usando os valores definidos anteriormente, algoritmos e, em seguida, o novo valor de limite inferior do ponto BRP. As imagens resultantes devem atender aos critérios de análise crítica.Agora use as configurações de definição para executar a macro em todas as imagens NMJ obtidas nas mesmas condições. A macro morfométrica Drosophila NMJ foi usada para validar diferentes defeitos sinápticos conhecidos em três genótipos mutantes. Ankyrin dois mutantes são conhecidos por terem fundido boutons e NMJs menores.Usando a macro, a área e o perímetro de panuronil e quirina dois RNAI knock down NMJs foram medidos e considerados significativamente menores do que os controles. O GTPase Rab3 é necessário para a distribuição adequada de bruckpila. Quando interrompido, há menos zonas ativas.Usando o macro panuronil, as moscas knock down tiveram uma média de 138 zonas ativas por terminal NMJ em comparação com 290 detectadas nos controles. O fio alto é um importante regulador do crescimento da JNM, e quando mutantes, as JNMs têm ramificações estendidas em seus terminais. Usando o macro panuronil, as linhas de derrubada de RNAI de fio alto mostraram aumentos significativos em vários parâmetros derivados do esqueleto em seus NMJs, incluindo comprimento total, comprimento de ramificação mais longo, número de ramificações e número de pontos de ramificação.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como operar e ajustar as configurações da macro morfométrica Drosophila NMJ. Uma vez dominada, a análise de 50 sinapses pode ser feita em uma hora. Isso economiza aproximadamente 15 minutos de tempo de quantificação por sinapse.É importante adquirir imagens de boa qualidade do NMJ. Quanto melhores as imagens, melhor será o desempenho da macro. Esta técnica ajudará os pesquisadores no campo da neurobiologia a quantificar com eficiência os parâmetros morfológicos da Drosophila NMJ.

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Morfologia, tamanho e localização das organelas intracelulares são evolutivamente conservados e parecem afetar diretamente sua função. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos tornou-se um objetivo importante da biologia moderna. Aqui mostramos como esses estudos podem ser facilitados pela aplicação de técnicas quantitativas.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda dois algoritmos de análise de imagem para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular de Drosophila. Este método computacional permite análise de alta vazão e objetiva em modelos de doenças.

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de

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