Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

O objetivo geral deste método baseado em microscopia de alto conteúdo é quantificar simultaneamente a morfofunção mitocondrial e os níveis celulares de espécies reativas de oxigênio, de modo a estabelecer uma impressão digital redox robusta para linhagens celulares expostas a diferentes perturbações experimentais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia redox, como se as condições patogênicas ou os tratamentos compostos provocam estresse oxidativo e até que ponto a forma e a função mitocondrial são afetadas. A principal vantagem dessa técnica é que todos os parâmetros podem ser medidos dentro da mesma célula ao mesmo tempo.

Para iniciar o procedimento, semeie de oito a 10.000 fibroblastos dérmicos humanos em 60 poços internos de uma placa preta de 96 poços com um fino poliestireno contínuo ou fundo de vidro. Ao usar diferentes condições, tratamentos ou linhagens celulares, distribua seus locais de semeadura de forma homogênea na placa para minimizar os efeitos da placa. Em seguida, semeie mais oito a 10.000 células no poço B01 para serem usadas para ajuste de foco.

Posteriormente, encha os poços externos vazios com meio para minimizar os gradientes entre os poços e o ambiente. Bata suavemente na placa três vezes antes de colocá-la de volta na incubadora para evitar que as células cresçam em manchas. Cultive as células por 24 horas ou até atingirem 70% de confluência.

Depois, salve as informações de tratamento para o experimento em uma planilha chamada setup. Para configurar o microscópio, primeiro calibre o estágio XY usando o software. Em seguida, crie um protocolo de imagem para uma placa de vários poços usando o software de aquisição.

Este protocolo permite a aquisição automática de posições definidas e poços selecionados de uma placa de 96 poços. Agora, selecione o tipo correto de placa de vários poços em uma lista de placas disponíveis fornecidas no software. Como alternativa, defina o formato de placa de vários poços usando as dimensões da placa e do poço.

Em seguida, alinhe a placa do poço definindo dois cantos dos quatro poços do canto externo. Em seguida, selecione os poços que precisam ser adquiridos e defina um protocolo de aquisição que consiste em uma aquisição sequencial de comprimento de onda. Certifique-se de que o canal GFP esteja definido primeiro.

Em seguida, defina um loop de placa de poço para adquirir quatro imagens regularmente espaçadas e sem sobreposição posicionadas ao redor do centro de cada poço selecionado usando o protocolo de aquisição definido. Nesta etapa, prepare a solução de coloração para 60 poços adicionando CM-H2DCFDA e solução estoque TMRM ao tampão HBSS HEPES. Em seguida, descarte o meio de cultura das células virando a placa de cabeça para baixo em um único movimento de fluido.

Lave suavemente as células duas vezes com tampão HH. Não se esqueça bem A01 com as células usadas para ajuste de foco. Descarte o buffer HH entre as etapas de lavagem.

Em seguida, carregue as células com CM-H2DCFDA e TMRM adicionando 100 microlitros da solução de coloração a cada poço. Mais uma vez, não se esqueça bem A01. Incube as células por 25 minutos no escuro em temperatura ambiente.

Após 25 minutos, lave as células duas vezes com 100 microlitros de tampão HH e adicione 100 microlitros de tampão HH a todos os 60 poços internos. Para realizar a medição real, instale a placa no microscópio. Em seguida, ligue o sistema de foco automático baseado em hardware e ajuste o deslocamento do foco automático usando o poço B01 e o canal TMRM até obter uma imagem nítida.

Em seguida, execute o protocolo de imagem. O conjunto de dados de imagem resultante fornecerá informações sobre os níveis basais de ROS, potencial de membrana mitocondrial e morfologia mitocondrial. Em seguida, para medir os níveis de ROS induzidos, remova cuidadosamente a placa de 96 poços do microscópio.

Adicione 100 microlitros de solução TBHP a 40 micromolares a cada poço e aguarde pelo menos três minutos para permitir a reação completa do TBHP com o CM-H2DCFDA. Durante esse tempo, adicione 100 microlitros da solução de trabalho do anticorpo ao poço A01. Agora, monte a placa de volta no microscópio e verifique o foco novamente usando o poço B01.

Em seguida, adquira as mesmas posições da primeira rodada de imagem usando o mesmo protocolo de imagem. O conjunto de dados de imagem resultante fornecerá informações sobre os níveis de ROS induzidos. Em seguida, adquira imagens de campo plano no poço A01.

Certifique-se de que os sinais estejam bem dentro da faixa dinâmica. Ajustando as configurações de aquisição. Depois, exporte os conjuntos de dados adquiridos em uma única pasta como arquivos TIFF individuais usando nomenclatura padronizada.

Isso inclui referência à placa, pré ou pós tratamento TBHP, poço, campo e canal separados por sublinhados. Além disso, salve as imagens de campo simples na mesma pasta que os arquivos TIFF individuais usando a nomenclatura padronizada. Nesta etapa, abra o software de processamento de imagem e instale o conjunto de macros de métricas redox.

Em seguida, abra a interface de configuração para definir as configurações de análise clicando no botão S. Selecione o tipo de imagem, o número de canais e o poço que foi usado para adquirir as imagens de campo plano. Depois disso, indique qual canal contém células ou mitocôndrias.

Marque as caixas de seleção de fundo e aprimoramento para executar a subtração de fundo e a equalização de histograma adaptativo limitada por contraste, respectivamente. Em seguida, defina um sigma para gaussiano e indefinição das células e realce laplaciano das mitocôndrias. Selecione um algoritmo de limite automático e preencha os limites de exclusão de tamanho.

Em seguida, teste as configurações de segmentação em algumas imagens selecionadas dos conjuntos de dados adquiridos, abrindo-as e clicando nos botões C ou M no menu para segmentação de células ou mitocôndrias, respectivamente. Em seguida, a partir da análise em lote na pasta de interesse, clicando no botão hash e selecionando a pasta com as imagens. Verifique as configurações e pressione ok.

Após a análise em lote, verifique visualmente o desempenho da segmentação em uma pilha de verificação clicando no botão V e selecionando a pasta com imagens. Percorra a pilha de verificação para confirmar se a segmentação foi bem-sucedida. A análise inicial dos dados extraídos é feita automaticamente com um aplicativo Shiny gratuito.

Isso permite uma interpretação rápida dos resultados. Para começar, abra o aplicativo no R Studio. Escolha executá-lo em um navegador externo.

Na página de entrada, selecione o diretório onde os arquivos de resultado estão localizados. Certifique-se de que o arquivo de instalação também esteja presente neste diretório. Os arquivos de resultados e as informações de configuração são importados, compilados e visualizados automaticamente.

A página de configuração experimental mostra o layout do experimento. A próxima página exibe os níveis de ROS, bem como vários parâmetros mitocondriais para cada placa separadamente. Selecione a placa que deseja visualizar usando o menu suspenso.

Os dados são mostrados em um formato de placa de vários poços, bem como em gráficos de caixa com outliers rotulados com o número do poço e da imagem. A página de experimentos completos de resultados mostra os resultados normalizados de todas as placas combinadas, juntamente com uma análise estatística básica. Se um arquivo suspenso for fornecido por meio da página de entrada, os pontos de dados especificados serão excluídos.

Na página de análise de cluster, um perfil redox sensível é composto usando um componente principal e análise de dados de cinco parâmetros. Finalmente, a página de download de dados permite salvar os dados processados e reorganizados para uso posterior. Aqui estão os resultados de um experimento no qual fibroblastos dérmicos humanos foram tratados com o inibidor de protease do HIV Saquinavir.

Usando o protocolo descrito, um aumento significativo foi detectado para os níveis basais e induzidos de ROS. Em comparação com as células de controle, tratadas com DMSO. O saquinavir também afetou significativamente a morfofunção mitocondrial.

O potencial de membrana mitocondrial medido como o sinal médio de TMRM por pixel mitocondrial aumentou significativamente. Além disso, as mitocôndrias adquiriram um padrão altamente fragmentado, quantitativamente indicado por uma maior circularidade e menor tamanho médio das mitocôndrias individuais. Ao combinar os parâmetros acima mencionados usando a análise de componentes principais, as condições de controle e Saquinavir podem ser claramente separadas uma da outra por suas impressões digitais redox.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a própria iluminação causa estresse oxidado. Portanto, as condições de exposição devem ser minimizadas e mantidas constantes durante todo o experimento. Uma vez dominadas, até 20 placas de 96 poços podem ser coradas e adquiridas em um dia.

Após a segunda rodada de imagem, as células podem ser fixadas e usadas para uma coloração imunofluorescente a jusante. Isso aumenta o número de parâmetros medidos exatamente nas mesmas células e permite responder a perguntas adicionais. Depois de assistir a este vídeo, você poderá realizar as medições combinadas de ROS e morfofunção mitocondrial em culturas de células aderentes usando microscopia de alto conteúdo.