Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

O objetivo geral deste método baseado em microscopia de alto conteúdo é quantificar simultaneamente a morfofunção mitocondrial e os níveis celulares de espécies reativas de oxigênio, a fim de estabelecer uma assinatura redox robusta para linhagens celulares expostas a diferentes perturbações experimentais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia redox, como saber se condições patogênicas ou tratamentos com compostos induzem estresse oxidativo, e em que medida a forma e a função mitocondriais são afetadas. A principal vantagem desta técnica é que todos os parâmetros podem ser medidos na mesma célula e ao mesmo tempo.

Para iniciar o procedimento, semeie oito a 10.000 fibroblastos dérmicos humanos nos 60 poços internos de uma placa de 96 poços preta com fundo contínuo de poliestireno ou vidro. Ao utilizar diferentes condições, tratamentos ou linhagens celulares, distribua os locais de semeadura de forma homogênea na placa para minimizar os efeitos da placa. Em seguida, semeie mais oito a 10.000 células no poço B01 para serem usadas no ajuste de foco.

Posteriormente, preencha os poços externos vazios com meio para minimizar os gradientes entre os poços e o ambiente. Bata suavemente na placa três vezes antes de colocá-la de volta no incubador para evitar que as células cresçam em manchas. Incube as células por 24 horas ou até atingirem 70% de confluência.

Posteriormente, salve as informações do tratamento para o experimento em uma planilha chamada setup. Para configurar o microscópio, primeiro calibre o estágio XY utilizando o software. Em seguida, crie um protocolo de aquisição de imagens para uma placa de múltiplas poças usando o software de aquisição.

Este protocolo permite a aquisição automática de posições definidas e poços selecionados de uma placa de 96 poços. Agora, selecione o tipo correto de placa de múltiplos poços a partir de uma lista de placas disponíveis fornecida no software. Alternativamente, defina o formato da placa de múltiplos poços utilizando as dimensões da placa e dos poços.

Em seguida, alinhe a placa de poços definindo dois cantos dos quatro poços nos cantos externos. Depois disso, selecione os poços que precisam ser adquiridos e defina um protocolo de aquisição composto por uma aquisição sequencial de comprimentos de onda. Certifique-se de que o canal GFP seja definido primeiro.

Em seguida, defina um loop de placa de poços para adquirir quatro imagens regularmente espaçadas e sem sobreposição posicionadas ao redor do centro de cada poço selecionado, utilizando o protocolo de aquisição definido. Nesta etapa, prepare a solução de coloração para 60 poços adicionando as soluções estoque de CM-H2DCFDA e TMRM ao tampão HBSS HEPES. Em seguida, descarte o meio de cultura das células virando a placa de cabeça para baixo em um único movimento contínuo.

Lave suavemente as células duas vezes com tampão HH. Não se esqueça do poço A01 com as células utilizadas para o ajuste de foco. Descarte o tampão HH entre os passos de lavagem.

Em seguida, carregue as células com CM-H2DCFDA e TMRM adicionando 100 microlitros da solução de coloração a cada poço. Novamente, não se esqueça do poço A01. Incube as células por 25 minutos no escuro e à temperatura ambiente.

Após 25 minutos, lave as células duas vezes com 100 microlitros de tampão HH e adicione 100 microlitros de tampão HH a todas as 60 poças internas. Para realizar a medição propriamente dita, instale a placa no microscópio. Em seguida, ligue o sistema de foco automático baseado em hardware e ajuste o deslocamento do foco automático usando a poça B01 e o canal TMRM até obter uma imagem nítida.

Em seguida, execute o protocolo de imagem. O conjunto de dados de imagem resultante fornecerá informações sobre os níveis basais de ERO, potencial da membrana mitocondrial e morfologia mitocondrial. A seguir, para medir os níveis induzidos de ERO, remova cuidadosamente a placa de 96 poços do microscópio.

Adicione 100 microlitros de solução de TBHP a 40 micromolar a cada poço e aguarde pelo menos três minutos para permitir a reação completa do TBHP com o CM-H2DCFDA. Durante esse tempo, adicione 100 microlitros da solução de anticorpo diluída ao poço A01. Agora, recoloque a placa no microscópio e verifique novamente o foco utilizando o poço B01.

Em seguida, adquira as mesmas posições da primeira rodada de imagem usando o mesmo protocolo de aquisição. O conjunto de dados de imagem resultante fornecerá informações sobre os níveis de ESP induzidos. A seguir, adquira imagens de campo plano no poço A01.

Certifique-se de que os sinais estejam bem dentro da faixa dinâmica, ajustando as configurações de aquisição. Posteriormente, exporte os conjuntos de dados adquiridos em uma única pasta como arquivos TIFF individuais, utilizando uma nomenclatura padronizada.

Isso inclui referência à placa, tratamento pré ou pós-TBHP, poço, campo e canal separados por sublinhados. Além disso, salve as imagens de campo plano na mesma pasta como arquivos TIFF individuais utilizando a nomenclatura padronizada. Nesta etapa, abra o software de processamento de imagens e instale o conjunto de macros de métricas redox.

Em seguida, abra a interface de configuração para definir as configurações de análise clicando no botão S. Selecione o tipo de imagem, o número de canais e o poço utilizado para adquirir as imagens de campo plano. Depois disso, indique qual canal contém células ou mitocôndrias.

Marque as caixas de seleção de plano de fundo e realce para realizar a subtração do plano de fundo e a equalização adaptativa do histograma com limite de contraste, respectivamente. Em seguida, defina um sigma para o gaussiano e o desfoque das células e para o realce laplaciano das mitocôndrias. Selecione um algoritmo automático de limiarização e preencha os limites de exclusão de tamanho.

Em seguida, teste as configurações de segmentação em algumas imagens selecionadas dos conjuntos de dados adquiridos abrindo-as e clicando nos botões C ou M no menu para segmentação de células ou mitocôndrias, respectivamente. Após isso, realize a análise em lote na pasta de interesse clicando no botão cerquilha e selecionando a pasta com as imagens. Verifique as configurações e pressione OK.

Após a análise em lote, verifique visualmente o desempenho da segmentação em uma pilha de verificação clicando no botão V e selecionando a pasta com as imagens. Percorra a pilha de verificação para confirmar se a segmentação foi bem-sucedida. A análise inicial dos dados extraídos é realizada automaticamente com uma aplicação Shiny complementar.

Isso permite uma interpretação rápida dos resultados. Para começar, abra o aplicativo no R Studio. Escolha executá-lo em um navegador externo.

Na página de entrada, selecione o diretório onde os arquivos de resultado estão localizados. Certifique-se de que o arquivo de configuração também esteja presente neste diretório. Os arquivos de resultado e as informações de configuração são automaticamente importados, compilados e visualizados.

A página de configuração experimental mostra o layout do experimento. A próxima página exibe os níveis de ERO, bem como diversos parâmetros mitocondriais para cada placa separadamente. Selecione a placa que deseja visualizar utilizando o menu suspenso.

Os dados são apresentados em formato de placa de múltiplas poças, bem como em gráficos de caixa com os valores atípicos identificados pela poça e número da imagem. A página de resultados do experimento inteiro mostra os resultados normalizados de todas as placas combinadas, juntamente com uma análise estatística básica. Se for fornecido um arquivo de exclusão pela página de entrada, os pontos de dados especificados serão excluídos.

Na página de análise de agrupamento, um perfil redox sensível é composto por meio de uma análise de componentes principais com dados de cinco parâmetros. Por fim, a página de download de dados permite o salvamento dos dados processados e reorganizados para uso posterior. Aqui são mostrados os resultados de um experimento no qual fibroblastos dérmicos humanos foram tratados com o inibidor da protease do HIV Saquinavir.

Utilizando o protocolo descrito, foi detectado um aumento significativo tanto nos níveis basais quanto nos induzidos de ERO. Em comparação com as células controle, tratadas com DMSO. Saquinavir também afetou significativamente a morfofunção mitocondrial.

O potencial da membrana mitocondrial, medido como o sinal médio de TMRM por pixel mitocondrial, aumentou significativamente. Além disso, as mitocôndrias adquiriram um padrão altamente fragmentado, indicado quantitativamente por uma maior circularidade e menor tamanho médio das mitocôndrias individuais. Ao combinar os parâmetros mencionados utilizando análise de componentes principais, tanto o controle quanto a condição com Saquinavir puderam ser claramente separados um do outro por meio de suas impressões digitais redox.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a própria iluminação causa estresse oxidativo. Portanto, as condições de exposição devem ser minimizadas e mantidas constantes durante todo o experimento. Uma vez dominado, é possível colorir e adquirir até 20 placas de 96 poços em um único dia.

Após a segunda rodada de imagem, as células podem ser fixadas e utilizadas para uma coloração imunofluorescente subsequente. Isso aumenta o número de parâmetros medidos nas mesmas células exatas e permite responder perguntas adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de realizar as medições combinadas de ERO e morfofunção mitocondrial em culturas celulares aderentes utilizando microscopia de alto conteúdo.