Name: Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a quantificar simultaneamente ROS e morfofunção mitocondrial em células aderentes usando microscopia de alto conteúdo. Este método estabelece perfis redox robustos para investigar estresse oxidativo.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Antuérpia (TTBOF/29267, TTBOF/30112), o Fundo Especial de Pesquisa da Universidade de Ghent (projeto BOF/11267/09), NB-Photonics (código de projeto 01-MR0110) e a iniciativa CSBR (Centros de Pesquisa em Biologia de Sistemas) da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO; Não: CSBR09/013V). Partes deste manuscrito foram adaptadas de outra publicação1, com permissão da Springer. Os autores agradecem a Geert Meesen por sua ajuda com o microscópio de campo amplo.

<ol><li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction%5BTitle%5D)+AND+%22AAEC%22%5BJournal%5D)">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li>
<li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li>
<li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II%2C+III%2C+IV+and+V%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-BIOENERGETICS%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li>
<li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+deficiency%3A+radical+changes+in+mitochondrial+morphology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li>
<li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17066472">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &#34;,7 -&#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li>
<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
<li>Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuiderveld%2C+K+%22Graphics+gems+IV%22">Graphics gems IV</a>. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R.+R+package+version+0.14.2%22">shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=shiny ">https://CRAN.R-project.org/package=shiny </a> (2017).</li>
<li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v064i09">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4%28%2B%29+T-cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li>
<li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype%3A+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li>
<li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li>
<li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release%3A+protection+with+thymoquinone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li>
<li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production%2C+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li>
<li>Bociąga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li>
<li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nelfinavir%2C+an+HIV+protease+inhibitor%2C+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li>
<li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035(2015).</li>
<li>Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , 
 <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf ">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf </a> (2006).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li>
<li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li>
<li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li>
<li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22JBO%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li>
<li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li>
<li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li>
<li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+drug+development+technologies%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

Os autores afirmam que não existem interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse. O autor correspondente também garante que todos os autores tenham sido solicitados a divulgar qualquer e todos os conflitos de interesse.

Este artigo descreve um método de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea de níveis intracelulares de ROS e morfofunção mitocondrial em NHDF. O seu desempenho foi demonstrado com um estudo de caso sobre NHDF tratado com SQV. Os resultados suportam evidências anteriores da literatura em que se observaram níveis elevados de ROS ou disfunção mitocondrial após tratamento com inibidores de protease de HIV tipo 1, embora em experiências separadas 19 , 2...

<html> A concentração de ROS intracelular é meticulosamente regulada através de uma interacção dinâmica entre a produção de ROS e sistemas de desactivação ROS. O desequilíbrio entre os dois provoca um estado de estresse oxidativo. Entre as principais fontes de ROS estão as mitocôndrias 1 . Dado o seu papel na respiração celular, são responsáveis ​​pela maior parte das moléculas intracelulares de superóxido (O 2 • - ) 2 . Isto resulta principalmente da fuga de electrões para O 2 no complexo 1 da cadeia de transporte de electrões em condições de forte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), isto é , hiperpolarização mitocondrial. Por outro lado, a despolarização mitocondrial também tem sido correlacionada com o aumento da produção de ROS apontando para múltiplos modos de ação 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Além disso, através de modificações redox em proteínas da maquinaria de fusão-fissão, ROS co-regular a morfologia mitocondrial 9. Por exemplo, a fragmentação está correlacionada com o aumento da produção de ROS e apoptose 10,11, enquanto as mitocôndrias filamentosas têm sido associadas à inanição de nutrientes e proteção contra Mitófago 12 . Dada a intrincada relação entre ROS celular e morfofunção mitocondrial, ambos idealmente devem ser quantificados simultaneamente em células vivas. Para fazer exatamente isso, um ensaio de imagem de alto conteúdo foi desenvolvido com base em microscopia automatizada de campo amplo e análise de imagem de culturas de células aderentes coradas com as sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (mitochondrial Δψ m e morfologia). Imagens de alto conteúdo refere-se à extração de spAtiotemporally ricos ( ou seja , grande número de características descritivas) informações sobre fenótipos celulares usando múltiplos marcadores complementares e análises automatizadas de imagem. Quando combinadas com microscopia automatizada, muitas amostras podem ser rastreadas em paralelo ( isto é, alto rendimento), aumentando assim o poder estatístico do ensaio. Na verdade, um dos principais ativos do protocolo é que permite a quantificação simultânea de vários parâmetros na mesma célula, e isso para um grande número de células e condições. O protocolo é dividido em 8 partes (descritas em detalhe no protocolo abaixo): 1) Semeadura de células numa placa de 96 poços; 2) Preparação de soluções-mãe, soluções de trabalho e tampão de imagem; 3) Instalação do microscópio; 4) Carregamento das cï¿½ulas com DCFDA CM-H 2 e TMRM; 5) Primeira ronda de imagens ao vivo para medir os níveis basais de ROS e morfofunção mitocondrial; 6) Segunda ronda de imagens ao vivo após adição de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir os níveis de ROS induzidos; 7) Análise automatizada de imagens; 8) Análise de Dados, Controle de Qualidade e Visualização. O ensaio foi originalmente desenvolvido para fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). Uma vez que estas células são grandes e planas, eles são bem adequados para avaliar a morfologia mitocondrial em 2D widefield imagens [ 13 , 14] . No entanto, com pequenas modificações, este método é aplicável a outros tipos de células aderentes. Além disso, ao lado da combinação de DCFDA CM-H2 e TMRM, o fluxo de trabalho está em conformidade com uma variedade de pares de corantes fluorescentes com diferentes especificidades moleculares 1 , 15 .

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, Éster metílico, Perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Indicador Geral de Estresse Oxidativo)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Placa MicroWell com Fundo de Vidro de 96 Poços MatriPlate 630 &micro; L-Preto 0,17 mm com Tampa de Vidro Baixo</td><td>Brooks life science systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sem Fenol Vermelho 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM glicose alta com L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Bufered Saline (PBS) sem Ca e Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-versena (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Anticorpo usado para adquirir imagem de campo plano</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Coelho IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Anticorpo usado para adquirir imagem de campo plano</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti eclipse microscópio de campo amplo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Nikon</td><td></td><td>baseado em hardware sistema de foco automático</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objetiva</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 com módulo JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Este software é usado para orientar o microscópio e programar/executar o prototocol de aquisição automática de imagem</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Versão 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Versão 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R versão 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

redox cellular profiling usando microscopia de alto conteúdo

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

As espécies reativas de oxigênio (ROS) regulam os processos celulares essenciais, incluindo a expressão gênica, migração, diferenciação e proliferação. No entanto, níveis excessivos de ROS induzem um estado de estresse oxidativo, que é acompanhado por danos oxidativos irreversíveis ao DNA, lipídios e proteínas. Assim, a quantificação de ROS fornece um proxy direto para condição de saúde celular. Uma vez que as mitocôndrias estão entre as principais fontes e alvos celulares de ROS, a análise conjunta da função mitocondrial e da produção de ROS nas mesmas células é crucial para melhor compreensão da interconexão em condições fisiopatológicas. Portanto, desenvolveu-se uma estratégia baseada em microscopia de alto conteúdo para quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) e morfologia mitocondrial. É baseado em microscopia de fluorescência de campo largo automatizada e análise de imagem de células aderentes vivas, cultivadas em placas de múltiplos poços, e staineD com as moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨm e morfologia mitocondrial) permeáveis ​​às células. Em contraste com a fluorimetria ou citometria de fluxo, esta estratégia permite a quantificação dos parâmetros subcelulares ao nível da célula individual com elevada resolução espaço-temporal, tanto antes como depois da estimulação experimental. É importante notar que a natureza baseada em imagens do método permite extrair parâmetros morfológicos além das intensidades de sinal. O conjunto de recursos combinados é usado para análise de dados multivariada exploratória e estatística para detectar diferenças entre subpopulações, tipos de células e / ou tratamentos. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do ensaio, juntamente com um exemplo de experiência que comprova o seu potencial para discriminação inequívoca entre estados celulares após perturbação química.

O ensaio foi comparado utilizando várias experiências de controlo, cujos resultados estão descritos em Sieprath et al. 1 . Em resumo, a resposta de fluorescência de CM-H 2 DCFDA e TMRM a induzido extraneamente alterações no ROS intracelular e Δψ m, respectivamente, foi quantificada para determinar o intervalo dinâmico. Para o DCFDA CM-H 2 , o NHDF mostrou um aumento linear no sinal de fluorescência quando tratado com conce...

Este trabalho apresenta um fluxo de trabalho de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, bem como o potencial e morfologia da membrana mitocondrial, denominados conjuntamente como morfofunção mitocondrial, em células vivas aderentes, 6) -clorometil-2 &#39;, 7&#39;-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM-H 2 DCFDA) e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

O objetivo geral deste método baseado em microscopia de alto conteúdo é quantificar simultaneamente a morfofunção mitocondrial e os níveis celulares de espécies reativas de oxigênio, a fim de estabelecer uma assinatura redox robusta para linhagens celulares expostas a diferentes perturbações experimentais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia redox, como saber se condições patogênicas ou tratamentos com compostos induzem estresse oxidativo, e em que medida a forma e a função mitocondriais são afetadas. A principal vantagem desta técnica é que todos os parâmetros podem ser medidos na mesma célula e ao mesmo tempo.Para iniciar o procedimento, semeie oito a 10.000 fibroblastos dérmicos humanos nos 60 poços internos de uma placa de 96 poços preta com fundo contínuo de poliestireno ou vidro. Ao utilizar diferentes condições, tratamentos ou linhagens celulares, distribua os locais de semeadura de forma homogênea na placa para minimizar os efeitos da placa. Em seguida, semeie mais oito a 10.000 células no poço B01 para serem usadas no ajuste de foco.Posteriormente, preencha os poços externos vazios com meio para minimizar os gradientes entre os poços e o a

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Biologia

Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3'-3 'diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox...

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imagem ao vivo do estado redox de glutationa mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador fluorescente raciométrico. Ao aplicar dois comprimentos de onda de excitação sob um microscópio de fluorescência, a taxa de intensidade de fluorescência é medida para avaliar a oxidação mitocondrial. O protocolo inclui estimulação de...

Imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.

Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Descrevemos protocolos para medir pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas em macropinosos individuais em células vivas. Uma ênfase é colocada na microscopia metométrica de dupla fluorofora e nas vantagens que oferece sobre técnicas de base populacional.

Medindo o pH, As Químicas Redox e a Capacidade Degradativa dos Macropinossos usando microscopia multiscopia memétrica de proporção de fluorofora dupla

Este artigo descreve um protocolo para determinar diferenças no estado basal redox e respostas redox a perturbações agudas em neurônios hipocampais primários e corticais usando microscopia viva confocal. O protocolo pode ser aplicado a outros tipos de células e microscópios com modificações mínimas.

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.

Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular

Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.

Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.

Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular

Aprenda a quantificar simultaneamente ROS e morfofunção mitocondrial em células aderentes usando microscopia de alto conteúdo. Este método estabelece perfis redox robustos para investigar estresse oxidativo.

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