Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

O objetivo geral deste protocolo é limpar quimicamente o coração de um camundongo, com uma arritmia cardíaca induzida para visualização de um órgão inteiro do infiltrado cardíaco leucocítico por microscopia de folha de luz de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de órgãos inteiros sobre próteses e estruturas no nível de resolução celular. A principal vantagem desta técnica é que permite tanto a quantificação como a localização da inflamação em órgãos inteiros.

Dando detalhes internos em próteses neurológicas. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando precisávamos urgentemente de uma ferramenta de visualização para identificar explicações celulares para arritmia cardíaca no módulo de depleção. Após a exposição do coração de um camundongo de oito a 10 semanas de idade, use um cateter de calibre 21 e penetre no ventrículo direito.

Incisar a aorta para permitir a drenagem do sangue e, em seguida, perfundir com cinco mililitros de PBS mais EDTA, com uma pressão constante lenta. Siga o PBS EDTA com cinco mililitros de paraformaldeído a 4%. No final da perfusão, use uma pinça serrilhada para segurar suavemente o coração fixo e puxe o órgão levemente para cima para cortar todas as conexões do tecido.

Incluindo as artérias e veias de entrada e saída. Em seguida, armazene o coração por quatro horas em 4% de PFA fresco para posterior fixação. Para desidratar o tecido, incubar o coração em uma série ascendente de etanol, em tubos de reação de polipropileno preto de cinco mililitros no escuro, com rotação lenta constante em um rotador de tubo, para evitar a formação de bolhas de ar.

Em seguida, limpe o tecido com uma incubação de éter dibenzílico a 98% com rotação constante durante a noite. Para realizar a microscopia de fluorescência de folha de luz, coloque primeiro blocos de agarose desidratada no suporte de amostra padrão, para manter a amostra no lugar. Em seguida, transfira a amostra para o suporte de amostra.

Em seguida, transfira o porta-amostras para uma cubeta cheia de éter dibenzílico de tamanho adequado. Use as configurações apropriadas do filtro de excitação e emissão para detectar os sinais de fluorescência de interesse. Portanto, o posicionamento e a fixação corretos da amostra são fundamentais para minimizar os efeitos de sombreamento durante a imagem.

Além disso, uma amostra solta pode causar artefatos em movimento, que são difíceis de iluminar durante o pós-processamento. Depois de exigir todas as imagens, abra o software de análise de processamento de imagem 3D e 4D apropriado e selecione superar. Escolha arquivo e abrir e selecione a pasta que contém os dados do primeiro canal adquirido para abrir as pilhas de imagens.

Selecione editar e adicionar canais para adicionar os dados de canal fluorescente adquiridos apropriados. Em seguida, clique em editar e selecione as propriedades da imagem para corrigir as dimensões de voxel x, y e z. Ajustando os parâmetros na janela recém-aberta.

Para ajustar os sinais fluorescentes, primeiro abra o menu de edição e selecione mostrar ajuste de exibição. Uma nova janela exibe todos os canais abertos. Para alterar o canal de autofluorescência para escala de cinza, selecione o canal de autofluorescência, escolha o estilo de exibição de branco e clique em OK.

Em seguida, ajuste a visualização removendo a grade. Em seguida, aumente o zoom e desmarque um canal. Em seguida, ajuste o valor do nível de preto para excluir quaisquer sinais de fundo indesejados que não representem as estruturas da amostra, a intensidade do sinal e o contraste.

Ajuste o canal permanente do anticorpo em relação ao sinal revisto do canal de autofluorescência. Configurando o modo de canal, dispare para definir a visualização do sinal de anticorpos para uma tabela de pesquisa de cores do mapa de calor. Em seguida, selecione o modo de mesclagem, para visualizar as estruturas do tecido em detalhes.

Para abrir virtualmente o órgão, antes da exportação da cena 3D, selecione o ícone do plano de recorte na lista de objetos. Uma moldura amarela e um manipulador de fuso branco aparecerão na visualização da imagem. Use o mouse para girar o eixo na extremidade mais fina, para alterar a orientação do plano de recorte e mova a parte central mais grossa do eixo para selecionar a profundidade desejada de corte.

Em seguida, desmarque as respectivas caixas de seleção para ocultar o quadro e o manipulador e criar os instantâneos desejados. A aquisição de uma pilha inteira de imagens, composta por dois sinais de canal fluorescente, provoca uma renderização 3D artificial, na qual a distribuição de leucócitos é exibida em uma visualização de mapa de calor. As áreas fortemente inflamadas dos corações de um animal tratado com toxina diftérica podem ser percebidas por suas aparências avermelhadas e esbranquiçadas.

Particularmente nas regiões do sistema de condução cardíaca, como o feixe ventricular atrial e as fibras de Purkinje. Em contraste, os corações de animais tratados com PBS controlado não demonstram esse padrão de inflamação. Uma vez dominada, essa técnica permite a análise digital pronta de um órgão-alvo, desde sua colheita até sua rendificação assistida por computador em quatro a cinco dias.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da emmenologia explorarem padrões de distribuição celular em órgãos inteiros de camundongos. Isso pode envelhecer na análise e no tratamento de uma variedade de próteses de doenças fisiopatológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar órgãos inteiros de camundongos para microscopia de folha de luz de fluorescência e como gerar e processar pilhas de dados 3D.