Name: Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda microscopia intravital de fluorescência para estudar adesão de leucócitos e perfusão capilar pulmonar em modelo de lesão pulmonar aguda. Este método oferece imagens de alta resolução com trauma mínimo.

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Os autores agradecem à Dra.

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados com aprovação prévia pelo Comitê de Animais de Laboratório da Universidade de Dalhousie (UCLA).
1. Preparação
<ol><li>Sistema de imagem pulmonar: Para preparar a janela, administre uma fina camada de graxa de vácuo no topo do anel externo, evitando a contaminação do canal de vácuo. Coloque uma tampa de vidro limpa de 8 mm na janela e pressione suavemente para baixo para criar uma vedação.</li>
	<li>Microscópio de fluorescência widefield: Realize imagens com um microscópio de fluorescência widefield convencional equipado com um objetivo de distância de trabalho de 20x/0,40 e uma câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) em preto e branco com uma taxa de quadro de 25 FPS. Aplique um filtro de excitação de bandpass de 530-550 nm para excitar Rhodamine-6G e um filtro de bandpass de 460-490 nm para excitar isothiocyanato fluoresceína (FITC).</li>
	<li>Sistema de vácuo: Conecte a janela de imagem a uma bomba de vácuo equipada com um medidor de pressão digital capaz de fornecer sucção constante de 50-60 mmHg, como mostrado na Figura Suplementar 1. Em suma, conecte a janela de imagem à bomba através de tubos de polietileno de 1,0 mm, tubos de polietileno de 1,0 cm, um frasco de vácuo e um filtro de 0,2 μm inline.</li>
	<li>Ventilador: Configure um pequeno ventilador de roedores para fornecer ventilação controlada por pressão a uma taxa e volume calculado com base no peso do mouse. Forneça uma pressão final-expiratória positiva (PEEP) a 5 cmH2O durante a duração do experimento, e defina a pressão-alvo para 20 cmH2O.</li>
	<li>Anestésico: Utilizando um sistema de entrega de anestesia de baixo fluxo, prime uma seringa de 5,0 mL com 99,9% de isoflurane. Use um sistema de limpeza de gás para minimizar o risco de inalação pelo cirurgião.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Coloque um rato C57Bl/6 masculino de 20-25 g de 12 semanas na câmara de indução da anestesia. Com a câmara bem fechada, comece a indução com gás isoflurane a uma concentração de 3% e uma vazão de 500 mL/min.</li>
	<li>Uma vez que o mouse é anestesiado (visualizado pela taxa de respiração lenta), transfira-o para o suporte de intubação e fixe os incisivos superiores à sutura pendurada.</li>
	<li>Aperte a sutura para fixar o focinho dentro do cone do nariz. Comece a fluir pelo cone do nariz com uma concentração de 2,5%.</li>
	<li>Confirme a profundidade adequada da anestesia através da beliscão do dedo do dedo do dedo antes de passar para o próximo passo.</li>
</ol>3. Intubação
<ol><li>Gire a posição de tal forma que a parte de trás do suporte e o lado dorsal do mouse face em direção ao cirurgião.</li>
	<li>Passe a ponta de um cabo de fibra óptica de 20 cm através de uma cânula endotraqueal de 20 G e submersa na ponta em Lidocaína HCl (1%) para facilitar a passagem do cabo através da laringe.</li>
	<li>Usando fórceps contundentes, levante a mandíbula inferior e desloque a língua para fornecer uma passagem clara para o trato respiratório.</li>
	<li>Insira um otoscópio modificado (~60° de circunferência espéculo removido) de tal forma que os incisivos superiores se encaixem dentro da lacuna no espéculo. Ajuste o escopo e a posição da língua até que a epiglote e as cordas vocais estejam claramente visíveis.</li>
	<li>Insira o cabo de fibra óptica carregado com a cânula endotraqueal através da abertura no espéculo e na laringe. Usando pequenos movimentos circulares, passe o cabo através das cordas vocais e para dentro da traqueia.</li>
	<li>Empurre a cânula ao longo do cabo de fibra óptica, passando entre as cordas vocais e para dentro da traqueia.</li>
</ol>4. Ventilação
<ol><li>Recupere o mouse do suporte de intubação e coloque-o em uma almofada de aquecimento na posição de decúbito lateral direito.</li>
	<li>Conecte a cânula ao tubo do ventilador e inicie o ventilador. Reduza a concentração anestésico para 1,5% e monitore a profundidade testando o reflexo do pedal. Se o reflexo persistir, aumente a concentração incrementalmente para até 2%.</li>
	<li>Coloque gel de lágrima nos olhos do rato para evitar a secagem.</li>
	<li>Usando fita médica, proteja a cânula até o focinho. Usando fita de rotulagem, fixe a prevada direita na almofada de aquecimento na posição das 9 horas. Estenda a pata traseira esquerda caudally e fixe na posição das 6 horas.</li>
	<li>Usando uma fita de pano, estique levemente a prensa esquerda até a posição das 12 horas e fixe a outra extremidade da fita até o topo da plataforma IVM, como mostrado na Figura 2A (manter uma ligeira tensão aqui facilita a toracotomia subsequente).</li>
	<li>Insira uma sonda de temperatura retal e fixe a sonda gravando-a na almofada de aquecimento. Coloque um oxímetro de pulso na pata traseira direita e fixe na almofada de aquecimento, tomando cuidado para não interromper a circulação.</li>
	<li>Uma vez que a temperatura esteja estável a 37,0 °C ± 0,1 °C, prossiga para realizar a toracotomia.</li>
</ol>5. Toracotomia
<ol><li>Esterilize o tórax e o abdômen com 70% de álcool. Aplique uma camada leve de óleo mineral para umedecer o cabelo do lado esquerdo do rato-do-esterno para a coluna vertebral e do ombro para o fundo da caixa torácica.</li>
	<li>Com força-tarefas cegas e tesouras retas, faça uma pequena incisão longitudinal perto da parte inferior da caixa torácica para expor a camada muscular subjacente.</li>
	<li>Movendo-se ventrally, use dissecção contundente para separar o tecido epitelial e adiposo da camada muscular. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto. Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, estenda a incisão original ventrally até o processo xiphoide.</li>
	<li>Repita este processo dorsalmente até ~5 mm lateralmente à coluna vertebral.</li>
	<li>Movendo-se cranialmente, use dissecção contundente para expor a caixa torácica. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto para preservar a estabilidade hemodinâmica.</li>
	<li>Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, amplie a incisão do processo xifoide até a axila.</li>
	<li>Repita este processo no lado dorsal da incisão até ~1 cm inferior à orelha esquerda.</li>
	<li>Utilizando fórceps hemostáticos, segure o tecido epitelial e adiposo dissecado e coloque-se afastado da área cirúrgica (Figura 2B).</li>
	<li>Injete uma solução de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) para visualização de leucócitos e fitc-albumina bovina (50 mg/mL; 1 mL/kg) para visualização de perfusão capilar pela veia traseira.</li>
	<li>Usando fórceps dentados, segure a costela imediatamente inferior à posição da base do pulmão na inspiração final e retraia levemente para puxar a costela para longe do pulmão. Corte a costela para induzir um pneumotórax.</li>
	<li>Estenda a incisão lateralmente ao longo do músculo intercostal em ambas as direções, tomando cuidado para não tocar na superfície pulmonar exposta.</li>
	<li>Usando fórceps contundentes, segure a próxima costela mais alta e retraia levemente para permitir que o pulmão caia da parede do peito. Se o pulmão não se soltar, pressione levemente a parede torácica contra o pulmão para fazer com que o pulmão adera à pleura subjacente e, assim, caia mais facilmente.</li>
	<li>Continue a incisão original ventrally até que o esterno e cranialmente até que o ápice do pulmão seja exposto. Use aplicadores de algodão e gaze para atenuar qualquer sangramento que surgir.</li>
	<li>Levante a caixa torácica para expor os vasos sanguíneos intercostais no aspecto dorsal da cavidade torácica. Tomando cuidado para não danificar o pulmão, cauterizar o vaso intercostal mais inferior perto da coluna vertebral, e depois cortar a costela. Movendo-se cranialmente e ventrally, repita até que uma porção de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm da caixa torácica seja extirpada (Figura 2C).</li>
	<li>Remova qualquer acúmulo de fluido excessivo na cavidade torácica através de ação capilar usando pequenas tiras de gaze.</li>
	<li>Enquanto prossegue para a microscopia, permita que ~5 min para o fluido intrapleural se dissipe para uma interface mais segura entre o pulmão e a janela de imagem.</li>
</ol>6. Microscopia
<ol><li>Ligue a bomba de vácuo e ajuste a pressão para ~50-60 mmHg.</li>
	<li>Transfira a plataforma IVM para o estágio do microscópio. Posicione o poste de metal e o micromanipulador de tal forma que a janela de imagem esteja diretamente acima do pulmão exposto e o braço da janela se aproxime do pulmão da posição das 3 horas.</li>
	<li>Usando o micromanipulador, abaixe cuidadosamente a janela de imagem até que adere e estabilize a superfície pulmonar (Figura 3A).</li>
	<li>Utilizando o objetivo de 20x e o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique um venule pulmonar baseado no padrão convergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.<ol>
<li>Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.</li>
		<li>Repita a etapa anterior até que cinco venules pulmonares tenham sido imagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique uma arteriola pulmonar baseada no padrão divergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.<ol>
<li>Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.</li>
		<li>Repita a etapa anterior até que cinco artérias pulmonares tenham sido imagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, localize uma região de alvéolos e capilares não interceptados por vasos maiores e grave 30 s de vídeo.<ol>
<li>Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.</li>
		<li>Repita a etapa anterior até que cinco regiões capilares tenham sido imagens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Eutanásia e protocolo de limpeza
<ol><li>Remova a plataforma IVM do estágio do microscópio e ajuste a entrega de isoflurane para 5% por 5 minutos para eutanásia do mouse.</li>
	<li>Enquanto estiver esperando, descarte o vidro de cobertura e desconecte a janela de imagem da plataforma. Limpe a janela de imagem com uma escova pequena e use uma seringa de 30 G inserida no canal para lavá-la várias vezes com água destilada. Em seguida, lave com 95% de etanol usando a bomba de vácuo.</li>
	<li>Depois de 5 min decorrido, pare o ventilador e garanta a eutanásia completa através da luxação cervical.</li>
</ol>

<ol><li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).</li>
<li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li>
<li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748(2014).</li>
<li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li>
<li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li>
<li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li>
<li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury%3A+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li>
<li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level%3A+Insights+from+lung+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).</li>
<li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%25+Hydroxyethyl+starch+%28HES+130%2F0.4%29+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li>
<li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).</li>
<li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li>
<li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock%3A+Relationship+to+hemodynamics%2C+oxygen+transport%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li>
<li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acute+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo%3A+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li>
<li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+observations+of+15-%C2%B5m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li>
<li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li>
</ol>

Kamala D. Patel é presidente e co-fundadora da Luxidea, a empresa da qual a janela de imagem utilizada neste experimento foi comprada.

O protocolo aqui apresentado requer prática e atenção a alguns passos críticos. Primeiro, é importante preparar a janela de imagem antes de iniciar a intubação e a cirurgia. Use uma quantidade mínima de graxa de vácuo para revestir o anel externo da janela de imagem, aplique o vidro de cobertura e teste a sucção com uma gota de água destilada. Prepará-lo com antecedência evitará que o pulmão exposto seque durante a configuração de outra forma. Embora seja possível lavar com soro fisiológico quente, isso pode correr o ris...

A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos 1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para imagem.
Os animais são tipicamente preparados para o IVM pulmonar por procedimentos cirúrgicos. Primeiro, os animais são entubados e ventilados, o que permite a excisão cirúrgica de uma janela torácica e intervenções subsequentes para estabilizar o pulmão para imagem. Uma técnica envolve colar o parenchyma em uma tampa de vidro3, procedimento que corre o risco de trauma físico significativo no tecido imageado. Mais avançado é a utilização de um sistema de vácuo para estabilizar o pulmão sob uma janela de vidro4. Esta configuração facilita a adesão frouxa da superfície pulmonar ao deslizamento de cobertura através de um vácuo reversível espalhado sobre uma grande área local e expande o pulmão enquanto ainda limita o movimento nas dimensões x, y e z4. O vácuo é aplicado uniformemente através de um canal ao redor da área de imagem da configuração e puxa o tecido para uma região cônica rasa de frente para o deslizamento de grau de imagem4. Através desta janela de visualização, a microcirculação pulmonar pode ser estudada utilizando várias modalidades de imagem óptica.
O IVM pulmonar permite imagens quantitativas de uma infinidade de parâmetros microcirculatórios. Estes incluem medidas como velocidade da pista leucócito e comprimento5, velocidade de fluxo de glóbulos vermelhos6 e oxigenação7, metástasestumorais 8, distinção de subpopulações de células imunes 9,10,11, visualização de micropartículas12, dinâmica alveolar13,14, permeabilidade vascular15, e função capilar16 . O foco aqui é o recrutamento de leucócitos e a função capilar. O início do recrutamento de leucócitos na microcirculação pulmonar envolve interações rolantes transitórias e interações adesivas firmes entre leucócitos e células endoteliais, ambas aumentadas sob condições inflamatórias16,17. Normalmente, a rolagem é quantificada pelo número de leucócitos que passam por uma linha de referência definida pelo operador, enquanto a adesão é quantificada pelo número de leucócitos que são imóveis no endotélio16. A função capilar também pode ser afetada em estados inflamatórios, muitas vezes resultando em diminuição da perfusão. Isso pode ser atribuído a vários fatores, incluindo uma redução da deformabilidade dos glóbulos vermelhos18 e expressão variegada de sinthase indutível por células endoteliais resultando em desvio patológico19. Normalmente, o comprimento agregado de capilares perfusados por área é medido e relatado como densidade capilar funcional (FCD).
Estudar o recrutamento de leucócitos nos pulmões em tempo real requer rotular alvos biológicos com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes20. Alternativamente, várias cepas de camundongos transgênicos, como camundongos lysozyme M-green fluorescente (LysM-GFP), podem ser utilizadas para imagem de subconjuntos de células imunes específicas, como os neutrófilos21,22. Os leucócitos com rótulo fluorescente podem então ser visualizados usando microscopia de fluorescência widefield, microscopia confocal ou microscopia multifotífera. Essas técnicas conseguem o contraste utilizando comprimentos de onda de excitação específicos e detectando fluorescência emitida ao mesmo tempo em que bloqueiam simultaneamente a detecção do comprimento de onda de excitação, destacando assim o objeto rotulado.
Pesquisas existentes sobre a quantificação do rolamento de leucócitos, adesão e densidade capilar funcional no pulmão murino basearam-se principalmente na análise manual de vídeo. Isso é possível através de software de código aberto, como o Fiji 6,23, software proprietário como o CapImage12 ou sistemas de processamento de imagempersonalizados 24. Por outro lado, várias plataformas de software proprietárias (por exemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permitem a medição automatizada de uma ampla gama de outros parâmetros fisiológicos, incluindo muitos dos mencionados anteriormente aqui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Observações importantes têm sido feitas em relação à patologia da lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) utilizando IVM pulmonar. A ARDS é caracterizada por uma série de processos fisiodicosiológicos no pulmão, incluindo edema pulmonar e danos alveolares causados pela disfunção do endotélio e barreira epitelial25. Usando um modelo murino, descobriu-se que a ALI induzida pela sepse está associada a mudanças prejudiciais significativas no tráfico de células imunes no ambiente pulmonar26. Os neutrófilos recrutados para os capilares de camundongos com ALI induzido pela sepse foram encontrados para impedir a microcirculação, aumentando assim a hipóxia em ALI26. Além disso, o IVM tem sido usado para obter insights sobre o mecanismo de reparo subjacente após o início do ARDS27. O IVM pulmonar também tem sido uma ferramenta valiosa na compreensão de alterações fisiodicosiológicas em várias doenças pulmonares obstrutivas. Por exemplo, a visualização do transporte de mucosa em doenças como fibrose cística (CF) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) tem facilitado o estudo de tratamentos novos e existentes para a liberação de mucosas28. O tráfico de leucócitos nessas condições também foi analisado, assim como17.
Este protocolo expande a abordagem inicialmente descrita por Lamm et al.29 para estudar interações leucócito-endotelial usando microscopia de fluorescência convencional. Os procedimentos descritos empregam um sistema de imagem pulmonar in vivo , que inclui uma base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulador e janela de imagem a vácuo (Figura 1). O sistema é montado em uma plataforma impressa 3D de 20 cm x 23,5 cm (Arquivo Suplementar 1) para fornecer fixação segura para o tubo do ventilador e almofada de aquecimento. Este método oferece imagens reprodutíveis e quantificáveis de microcirculação pulmonar murina em vivo. Aspectos importantes da preparação cirúrgica, bem como a utilização adequada de um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo são explicados em detalhes. Finalmente, um modelo experimental de ALI é usado para fornecer imagens representativas e análises de rolagem de leucócitos alterados, aderência leucócito e perfusão capilar associada à inflamação. O uso deste protocolo deve facilitar investigações mais importantes sobre alterações fisiofisiológicas na microcirculação pulmonar durante estados com doenças agudas.

<table><tbody><tr><td>Seringa de ponta deslizante BD Luer de 1 mL estéril, uso único</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>Seringa de 1 mL</td></tr><tr><td>Pinça de curativo ADSON, largura da ponta 0,6 mm, comprimento dos dentes 11,5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>Fórceps rombos</td></tr><tr><td>Albumina-fluoresceína Isotiocianato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771-1G</td><td>FITC-albumina</td></tr><tr><td>Cotonete de álcool Álcool isopropílico 70% v / v</td><td>Canadian Custom Packaging Company</td><td>80002455</td><td>Limpeza de álcool</td></tr><tr><td>AVDC110 Conversor de vídeo digital avançado</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>Conversor de vídeo digital</td></tr><tr><td>B / W - CCD - Camera</td><td>Horn Imaging</td><td>BC-71</td><td>Camera</td></tr><tr><td>Bovie Deluxe Kit de Cauterização de Alta Temperatura</td> Ferramentas <td>de Ciência Fina</td><td>18010-00</td><td>Cauterizer</td></tr><tr><td>C57BL / 6 Ratos</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL / 6NCrl</td><td>C57BL / 6 Aplicadores</td></tr><tr><td>com ponta de algodão</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Aplicador de algodão</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm Lamínula de vidro redonda</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0701</td><td>Lamínula de vidro</td></tr><tr><td>Manômetro Digital</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& Medidor</td> de <td>Pressão Digital</td></tr><tr><td>V Dr Mom Slimline Inoxidável LED Otoscópio</td><td>Dr. Mom Otoscópios</td><td>1001</td><td>Otoscópio</td></tr><tr><td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td><td>Álcoois Comerciais</td><td>P016EA95</td><td>95% etanol</td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Aço Inoxidável Martensítico</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Tesoura</td></tr><tr><td>Fita de Rotulagem Colorida Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>1590110</td><td>Fita de rotulagem</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA Bomba de vácuo de alta capacidade</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>ZA-07061-40</td><td>Bomba de vácuo</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13003-10</td><td>Fórceps hemostático</td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo Dow</td><td>Corning</td><td>DC976VF</td><td>Graxa a vácuo</td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>LIDOcaína Injeção de HCl 1% 50 mg / 5 mL</td><td>Teligent Canada</td><td>0121AD01</td><td>Lidocaína HCl 1%</td></tr> <tr><td>Lung SurgiBoard</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>Projetado para microscopia intravital do pulmão</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Teva Canada</td><td>00485802</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>intubação endotraqueal de camundongo</td> Kent <td>Scientific Corporation</td><td>ETI-MSE</td><td>Suporte de intubação, máscara de anestesia, cânula endotraqueal de 20 G, cabo de fibra óptica</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência MST49</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>Microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0.40 Objetiva de microscópio de longa distância de trabalho</td><td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x objetiva</td></tr><tr><td>Esponjas não tecidas 2" x 2"</td><td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>Gaze</td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube Plus</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>Tear gel</td></tr><tr><td>Original Prusa i3 MK3S+ Impressora 3D</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Impressora</td><td>3D</td></tr><tr><td>Oxigênio, Compactado</td><td>Linde Canada Inc.</td><td></td><td>Agulha</td></tr><tr><td>Precision Glide de Oxigênio 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td> <td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Agulha de 30 G</td></tr><tr><td>Frascos Filtrantes Pyrex 5340-2L 5340, 2000 mL</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>5340-2L</td><td>Frasco a Vácuo</td></tr><tr><td>Rodamina 6 G</td><td>Fita Médica Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td>Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>Secure Soft Cloth - 3"</td><td>Primed</td><td>PM5-630709</td><td>Fita de Tecido</td></tr><tr><td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 pol. OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>Tubo de polietileno de 1,0 mm de diâmetro interno Sistema de anestesia</td></tr> de <tr><td>baixo fluxo Somnosuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, SS-04-módulo</td><td>Ventilador de roedores pequenos, Sistema de anestesia de baixo fluxo, Almofada de aquecimento, Sonda de temperatura retal, Oxímetro de pulso</td></tr><tr><td>Pinça de tecido, 12,5 cm de comprimento, Curva, 1 x 2 Dentes</td><td>Instrumentos de precisão mundial</td><td>501216</td><td>Pinça</td></tr> <tr><td>dentadaFita Médica Transpore, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td><td>3M</td><td>7000002795</td><td>Fita</td></tr><tr><td>Médica Tubulação, Transparente, 3/8 in Diâmetro Interno.</td>Tubulação de polietileno <td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>1.0 cm I.D.</td></tr><tr><td>Filtros In-Line Whatman 6720-5002 50 mm, PTFE, 0.2 &micro; m</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>6720-5002</td><td>Inline 0.2&micro; Filtro M</td></tr></tbody></table>

microscopia de fluorescência de largura intravital de microcirculação pulmonar em lesão pulmonar aguda experimental usando um sistema de imagem estabilizada a vácuo

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

A imagem intravital das interações leucócito-endotelial oferece insights valiosos sobre doenças imunomediadas em animais vivos. O estudo da lesão pulmonar aguda (ALI)/síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e outras patologias respiratórias in vivo é difícil devido à acessibilidade limitada e artefatos de movimento inerentes aos pulmões. No entanto, várias abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios. Este protocolo descreve um método para microscopia de fluorescência intravital para estudar interações leucócito-endoteliais em tempo real na microcirculação pulmonar em um modelo experimental de ALI. Um sistema de imagem pulmonar in vivo e uma plataforma de microscopia intravital impressa em 3D são usados para proteger o camundongo anestesiado e estabilizar o pulmão, minimizando a lesão pulmonar confusa. Após a preparação, a microscopia de fluorescência widefield é usada para estudar a adesão de leucócitos, rolamento de leucócitos e função capilar. Embora o protocolo aqui apresentado se concentre na imagem em um modelo agudo de doença pulmonar inflamatória, ele também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão.

Para ilustrar os resultados alcançáveis através deste protocolo, a lesão pulmonar aguda (ALI) foi induzida 6 h antes da imagem usando um modelo de lipopolilcarida bacteriana intranasal (LPS) de instilação. Resumidamente, os camundongos (n = 3) foram anestesiados com isoflurano, e pequenas gotículas de LPS de Pseudomonas aeruginosa em solução salina estéril (10 mg/mL) foram pipetadas na naris esquerda em uma dosagem de 5 mg/kg. Isso foi comparado com camundongos ingênuos (n = 3; sem administração intranasal)....

A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Este protocolo descreve em detalhes, a preparação cirúrgica e o uso de um sistema estabilizado a vácuo para imagem de adesão leucócito pulmonar e perfusão capilar in vivo. A principal vantagem desta técnica é que permite imagens intravitais de alta resolução estáveis do pulmão espelhamento intacto com trauma físico mínimo. Para começar, prepare a janela de imagem administrando uma fina camada de graxa de vácuo no topo do anel externo, evitando a contaminação do canal de vácuo.Coloque uma tampa de vidro limpa de 8 milímetros na janela e pressione suavemente para baixo para criar uma vedação. Conecte a janela de imagem a uma bomba de vácuo equipada com um medidor de pressão digital e capaz de fornecer 50 a 60 milímetros de sucção constante de mercúrio. Passe um comprimento de cabo de fibra óptica através de uma cânula endotraqueal de 20 bitolas e submersa a ponta em lidocaína HCL.Após a anestesia, insira um otoscópio modificado, de tal forma que os incisivos superiores se encaixem dentro da lacuna no espéculo. Ajuste o escopo e a posição da língua até que as epiglotes e as cordas vocais estejam claramente visíveis. Insira o cabo de fibra óptica através da abertura no espéculo e use pequenos movimentos circulares para passar o cabo entre as cordas vocais, em seguida, usando o cabo de fibra óptica como guia, deslize suavemente a cânula para dentro da tragã para entubar o mouse.Após iniciar a ventilação com isoflurano de 1,5%, confirme a profundidade da anestesia testando o reflexo do pedal. Segure a cânula no focinho com fita médica. Use a fita de rotulagem para fixar a preente à direita na almofada de aquecimento na posição das nove horas e estender a pata traseira esquerda caudally e fixá-la na posição das seis horas.Usando uma fita de pano, estique levemente a pata dianteira esquerda até a posição das 12 horas e fixe a outra extremidade da fita até o topo da plataforma de microscopia intravital, em seguida, aplique uma sonda de temperatura retatal e oxímetro de pulso da pata para monitorar os sinais vitais durante todo o experimento. Para preparar o rato para a cirurgia, esterilize o tórax e o abdômen com um lenço álcool de 70% e aplique uma camada leve de óleo mineral para umedecer o cabelo do lado esquerdo do camundongo. Faça uma pequena incisão perto da parte inferior da caixa torácica para expor a camada muscular subjacente, em seguida, estender a incisão inicial e usar dissecção sem cortes para expor a caixa torácica.Usando fórceps hemostáticos, segure o tecido epitelial e adiposo dissecado e coloque longe da área cirúrgica. Para rotular fluorescentemente leucócitos e fluxo sanguíneo, administre um bolus de 2,5 mililitros por quilograma de Rhodamine 6G e FITC-albumina via veia traseira. Usando fórceps dentados, segure a costela imediatamente inferior à posição da base do pulmão na inspiração final.Retraia ligeiramente os fórceps para puxar a costela para longe do pulmão e, em seguida, cortar a costela para induzir um pneumotórax. Estique a incisão lateralmente em ambas as direções, tomando cuidado para não tocar no pulmão. Segure a próxima costela mais alta com fórceps contundentes e retraia levemente para permitir que o pulmão caia para longe da parede do peito.Se o pulmão não se soltar, pressione levemente a parede torácica contra o pulmão para fazer com que o pulmão adera à pleura subjacente e, assim, caia mais facilmente. Continue a incisão original eventualmente até que o esterno e cranialmente até que o ápice do pulmão seja exposto. Use aplicadores de algodão e gaze para atenuar qualquer sangramento que surgir.Levante a caixa torácica para expor os vasos sanguíneos intercostais no aspecto dorsal da cavidade torácica, tomando cuidado para não danificar o pulmão, cauterizar o vaso intercostal mais inferior perto da coluna vertebral, em seguida, cortar a costela adjacente. Movendo-se cranialmente, e eventualmente, use um padrão repetido de cauterização e corte para extirir uma porção de aproximadamente um por dois centímetros da caixa torácica. Para se preparar para a imagem, transfira a plataforma de microscopia intravital para o estágio do microscópio e posicione a janela de imagem diretamente acima do pulmão exposto.Use o micro manipulador para abaixar cuidadosamente a janela de imagem até que ela adere e estabilize a superfície pulmonar. Para visualizar a microcirculação pulmonar, use um microscópio de fluorescência de campo largo equipado com um conjunto de filtro FITC e Rhodamine de 20x. Use uma câmera CCD em preto e branco para gravar os vídeos com contraste ideal.Usando o conjunto de filtros FITC, identifique um local pulmonar baseado no padrão convergente do fluxo sanguíneo e grave um vídeo de 30 segundos com o local em foco, em seguida, repita a gravação no mesmo campo de visão usando o filtro Rhodamine definido para visualizar leucócitos. Para localizar uma arterial pulmonar, use o filtro FITC definido para identificar um vaso com um padrão divergente de fluxo sanguíneo e gravar um vídeo de 30 segundos. Repita a gravação no mesmo campo de visão usando o conjunto de filtro Rhodamine para visualizar leucócitos.Para localizar as regiões capilares de interesse, use o filtro FITC definido para identificar uma área de alvéolos e capilares não interceptados por vasos maiores e gravar um vídeo de 30 segundos. Repita a gravação no mesmo campo de visão usando o conjunto de filtro Rhodamine para visualizar leucócitos. Este vídeo mostra imagens FITC de fluxo sanguíneo dentro de um local pulmonar, conforme indicado pelo arqueiro verde.A imagem de Rhodamine permite a visualização de leucócitos no mesmo local com dois leucócitos adeptos indicados pelas setas vermelhas. Esses métodos também foram aplicados para visualizar os mesmos fenômenos e artérias pulmonares e regiões capilares de interesse. Para demonstrar a quantificação dos parâmetros microcirculatórios, os camundongos foram tratados com LPS intranasal para induzir inflamação pulmonar.O tráfico de leucócitos em locais pulmonares é mostrado aqui com áreas delineadas representando as regiões endoteliais analisadas em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A adesão e o rolamento de leucócitos foram aumentados em camundongos tratados com LPS. O tráfico de leucócitos em arterialrias pulmonares é mostrado aqui com áreas delineadas representando as regiões endoteliais analisadas em camundongos ingênuos e tratados com LPS.A adesão de leucócitos foi maior em camundongos tratados com LPS. Esta figura mostra a adesão de leucócitos dentro de capilares pulmonares em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A adesão de leucócitos mostrou-se mais alta em camundongos tratados com LPS versus ingênuos.Esta figura mostra a perfusão de capilares pulmonares em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A densidade capilar funcional mostrou-se menor em camundongos tratados com LPS versus ingênuos. Há muitos aspectos desafiadores deste protocolo.Otimizar o posicionamento do mouse na plataforma é um passo simples que pode tornar as etapas cirúrgicas e de imagem muito mais reprodutíveis. Este procedimento é adaptável a uma ampla gama de parâmetros de estudo e abordagens de microscopia. Portanto, deve facilitar novas pesquisas de microcirculação pulmonar em estados saudáveis e doentes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos microvasculares

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Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo (Vídeo) | JoVE Journal

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

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