Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Este protocolo descreve em detalhes, a preparação cirúrgica e o uso de um sistema estabilizado a vácuo para imagem de adesão leucócito pulmonar e perfusão capilar in vivo. A principal vantagem desta técnica é que permite imagens intravitais de alta resolução estáveis do pulmão espelhamento intacto com trauma físico mínimo. Para começar, prepare a janela de imagem administrando uma fina camada de graxa de vácuo no topo do anel externo, evitando a contaminação do canal de vácuo.

Coloque uma tampa de vidro limpa de 8 milímetros na janela e pressione suavemente para baixo para criar uma vedação. Conecte a janela de imagem a uma bomba de vácuo equipada com um medidor de pressão digital e capaz de fornecer 50 a 60 milímetros de sucção constante de mercúrio. Passe um comprimento de cabo de fibra óptica através de uma cânula endotraqueal de 20 bitolas e submersa a ponta em lidocaína HCL.

Após a anestesia, insira um otoscópio modificado, de tal forma que os incisivos superiores se encaixem dentro da lacuna no espéculo. Ajuste o escopo e a posição da língua até que as epiglotes e as cordas vocais estejam claramente visíveis. Insira o cabo de fibra óptica através da abertura no espéculo e use pequenos movimentos circulares para passar o cabo entre as cordas vocais, em seguida, usando o cabo de fibra óptica como guia, deslize suavemente a cânula para dentro da tragã para entubar o mouse.

Após iniciar a ventilação com isoflurano de 1,5%, confirme a profundidade da anestesia testando o reflexo do pedal. Segure a cânula no focinho com fita médica. Use a fita de rotulagem para fixar a preente à direita na almofada de aquecimento na posição das nove horas e estender a pata traseira esquerda caudally e fixá-la na posição das seis horas.

Usando uma fita de pano, estique levemente a pata dianteira esquerda até a posição das 12 horas e fixe a outra extremidade da fita até o topo da plataforma de microscopia intravital, em seguida, aplique uma sonda de temperatura retatal e oxímetro de pulso da pata para monitorar os sinais vitais durante todo o experimento. Para preparar o rato para a cirurgia, esterilize o tórax e o abdômen com um lenço álcool de 70% e aplique uma camada leve de óleo mineral para umedecer o cabelo do lado esquerdo do camundongo. Faça uma pequena incisão perto da parte inferior da caixa torácica para expor a camada muscular subjacente, em seguida, estender a incisão inicial e usar dissecção sem cortes para expor a caixa torácica.

Usando fórceps hemostáticos, segure o tecido epitelial e adiposo dissecado e coloque longe da área cirúrgica. Para rotular fluorescentemente leucócitos e fluxo sanguíneo, administre um bolus de 2,5 mililitros por quilograma de Rhodamine 6G e FITC-albumina via veia traseira. Usando fórceps dentados, segure a costela imediatamente inferior à posição da base do pulmão na inspiração final.

Retraia ligeiramente os fórceps para puxar a costela para longe do pulmão e, em seguida, cortar a costela para induzir um pneumotórax. Estique a incisão lateralmente em ambas as direções, tomando cuidado para não tocar no pulmão. Segure a próxima costela mais alta com fórceps contundentes e retraia levemente para permitir que o pulmão caia para longe da parede do peito.

Se o pulmão não se soltar, pressione levemente a parede torácica contra o pulmão para fazer com que o pulmão adera à pleura subjacente e, assim, caia mais facilmente. Continue a incisão original eventualmente até que o esterno e cranialmente até que o ápice do pulmão seja exposto. Use aplicadores de algodão e gaze para atenuar qualquer sangramento que surgir.

Levante a caixa torácica para expor os vasos sanguíneos intercostais no aspecto dorsal da cavidade torácica, tomando cuidado para não danificar o pulmão, cauterizar o vaso intercostal mais inferior perto da coluna vertebral, em seguida, cortar a costela adjacente. Movendo-se cranialmente, e eventualmente, use um padrão repetido de cauterização e corte para extirir uma porção de aproximadamente um por dois centímetros da caixa torácica. Para se preparar para a imagem, transfira a plataforma de microscopia intravital para o estágio do microscópio e posicione a janela de imagem diretamente acima do pulmão exposto.

Use o micro manipulador para abaixar cuidadosamente a janela de imagem até que ela adere e estabilize a superfície pulmonar. Para visualizar a microcirculação pulmonar, use um microscópio de fluorescência de campo largo equipado com um conjunto de filtro FITC e Rhodamine de 20x. Use uma câmera CCD em preto e branco para gravar os vídeos com contraste ideal.

Usando o conjunto de filtros FITC, identifique um local pulmonar baseado no padrão convergente do fluxo sanguíneo e grave um vídeo de 30 segundos com o local em foco, em seguida, repita a gravação no mesmo campo de visão usando o filtro Rhodamine definido para visualizar leucócitos. Para localizar uma arterial pulmonar, use o filtro FITC definido para identificar um vaso com um padrão divergente de fluxo sanguíneo e gravar um vídeo de 30 segundos. Repita a gravação no mesmo campo de visão usando o conjunto de filtro Rhodamine para visualizar leucócitos.

Para localizar as regiões capilares de interesse, use o filtro FITC definido para identificar uma área de alvéolos e capilares não interceptados por vasos maiores e gravar um vídeo de 30 segundos. Repita a gravação no mesmo campo de visão usando o conjunto de filtro Rhodamine para visualizar leucócitos. Este vídeo mostra imagens FITC de fluxo sanguíneo dentro de um local pulmonar, conforme indicado pelo arqueiro verde.

A imagem de Rhodamine permite a visualização de leucócitos no mesmo local com dois leucócitos adeptos indicados pelas setas vermelhas. Esses métodos também foram aplicados para visualizar os mesmos fenômenos e artérias pulmonares e regiões capilares de interesse. Para demonstrar a quantificação dos parâmetros microcirculatórios, os camundongos foram tratados com LPS intranasal para induzir inflamação pulmonar.

O tráfico de leucócitos em locais pulmonares é mostrado aqui com áreas delineadas representando as regiões endoteliais analisadas em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A adesão e o rolamento de leucócitos foram aumentados em camundongos tratados com LPS. O tráfico de leucócitos em arterialrias pulmonares é mostrado aqui com áreas delineadas representando as regiões endoteliais analisadas em camundongos ingênuos e tratados com LPS.

A adesão de leucócitos foi maior em camundongos tratados com LPS. Esta figura mostra a adesão de leucócitos dentro de capilares pulmonares em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A adesão de leucócitos mostrou-se mais alta em camundongos tratados com LPS versus ingênuos.

Esta figura mostra a perfusão de capilares pulmonares em camundongos ingênuos e tratados com LPS. A densidade capilar funcional mostrou-se menor em camundongos tratados com LPS versus ingênuos. Há muitos aspectos desafiadores deste protocolo.

Otimizar o posicionamento do mouse na plataforma é um passo simples que pode tornar as etapas cirúrgicas e de imagem muito mais reprodutíveis. Este procedimento é adaptável a uma ampla gama de parâmetros de estudo e abordagens de microscopia. Portanto, deve facilitar novas pesquisas de microcirculação pulmonar em estados saudáveis e doentes.