Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos em larvas ou fêmeas adultas da mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a entender a biossíntese do hormônio esteróide do inseto e o mecanismo regulatório neuronal subjacente ao acasalamento e à metamorfose. A principal vantagem dessa técnica é que a inervação dos órgãos esteroidogênicos e a porção relativa de seus órgãos interativos permanecem intactos.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os órgãos esteroidogênicos nas larvas das moscas são muito pequenos e transparentes. Meu laboratório e eu temos o prazer de compartilhar nossos protocolos de dissecação. Então, vamos começar.

Após o preparo das larvas, iniciar a dissecção em prato de três centímetros preenchido com PBS, sob microscópio de dissecação. Primeiro, segure o gancho da boca com uma pinça. Em seguida, usando uma microtesoura, corte o corpo a cerca de um terço do comprimento da ponta anterior.

Em seguida, segure o comprimento anterior com um par de pinças e use um segundo par para empurrar suavemente a ponta da cabeça para dentro do corpo, para finalmente virar o corpo larval do avesso. Prepare até 20 larvas dessa maneira em 10 minutos e, em seguida, transfira-as para a solução fixadora. Após 30 minutos, lave as preparações e prossiga com a imunocoloração.

Para começar, deixe as larvas imersas em água por cerca de uma hora, para asfixiar e assim imobilizar as larvas. Em seguida, coloque uma larva com o lado dorsal para cima em uma gota de PBS em um prato revestido de silicone. O lado dorsal tem os dois tubos traqueais.

Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça para inserir um pino de inseto na ponta anterior. Em seguida, estique o corpo para o lado posterior e coloque um segundo pino na ponta posterior. Em seguida, faça uma pequena incisão perto da cauda usando uma microtesoura.

A partir da incisão, corte cuidadosamente a cutícula dorsal longitudinalmente ao longo da linha média dorsal, em direção à cabeça, sem danificar nenhum dos tecidos sob a cutícula. Depois de fazer a incisão, estique as paredes do corpo e prenda-as com alfinetes de insetos nos cantos. Em seguida, usando uma pinça, remova o corpo adiposo anterior e as glândulas salivares, expondo assim o complexo da glândula do anel cerebral na superfície.

Agora, aspire o PBS e mergulhe a preparação em solução fixadora. Após 30 minutos, use uma pinça para remover os pinos de insetos e transfira a preparação para um microtubo cheio de 0,3% de PBT. Em seguida, prossiga com a imunocoloração.

Após a imunocoloração das larvas, use uma pipeta descartável para transferir as amostras para um prato cheio de 0,3% de PBT. Sob um microscópio de dissecação, segure a cutícula ou o gancho da boca com um par de pinças. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro, como uma faca, para remover o complexo do disco ocular da glândula anelar cerebral da cutícula do corpo, cortando a ponta anterior do esôfago e os discos oculares.

Em seguida, usando uma pinça, separe cuidadosamente o esôfago e o intestino do complexo de disco ocular da glândula anelar cerebral. Puxe o intestino para o lado posterior, uma vez que o esôfago passa pelo cérebro acima do cordão nervoso ventral. Finalmente, para isolar o complexo da glândula do anel cerebral, corte cuidadosamente as conexões entre o disco cerebral, os discos oculares e os discos das pernas, com uma faca de agulha.

É essencial usar pinças finas com bordas afiadas durante a dissecção. Eu recomendo fortemente que você afie uma pinça com um pedaço de pedra de amolar para unir suas bordas sem lacunas. Para transferir as amostras, use uma micropipeta com ponta larga.

Deposite as amostras no centro da lâmina de vidro. Em seguida, use uma pinça para posicionar as amostras em seus lados ventrais, para que a glândula anel, localizada no lado dorsal do cérebro, possa ser visualizada. Em seguida, incline o slide e limpe o máximo possível do excesso de PBT.

Em seguida, coloque uma gota de reagente de montagem perto das amostras e use uma pinça para abaixar lentamente uma lamínula sobre o reagente e depois sobre as amostras. Para dissecar o ovário feminino adulto, anestesiar moscas com gás dióxido de carbono. Em seguida, corte suas cabeças e transfira seus corpos para um prato de três centímetros cheio de PBS.

Em seguida, sob um microscópio de dissecação, segure o lado dorsal do tórax com uma pinça e segure o segmento abdominal A-5 ou A-6 com um segundo par de pinças. Em seguida, retire a cutícula abdominal em direção ao lado posterior. Antes de prosseguir, limpe a cutícula pegajosa da pinça.

Em seguida, aperte um ovaduto e isole o ovário. Em seguida, penteie e espalhe as pontas do ovário com uma pinça. Depois de espalhado, mergulhe o ovário em solução fixadora por 30 minutos, para prepará-lo para a coloração.

Para fazer uma preparação que mantenha a inervação do ovário, transfira as moscas fêmeas anestesiadas para um prato revestido de silicone cheio de PBS. Sob o microscópio de dissecação, segure a tromba e retire a cutícula da cabeça para expor o cérebro. Do cérebro, remova a traqueia anexada, deixando o cérebro conectado ao cordão nervoso ventral.

Em seguida, segure o tórax pelo lado dorsal e remova as pernas e asas. Em seguida, retire a cutícula ventral do tórax, começando na base de cada perna. Uma vez exposto o VNC, remova com muito cuidado a cutícula dorsal residual e os músculos ligados ao VNC, usando uma pinça.

Não danifique as conexões entre o cérebro e o VNC. Em seguida, usando uma pinça, retire a cutícula abdominal para expor os ovários e seus órgãos interativos, que incluem o suporte, o intestino, o ovaduto, o útero e a glândula acessória. Finalmente, remova quaisquer tecidos residuais, incluindo a traqueia e o corpo adiposo.

Em seguida, mergulhe as amostras em solução fixadora por 30 minutos, para prepará-las para a imunocoloração. Após a imunocoloração, transfira as amostras para uma lâmina de vidro com 0,1% PBT usando uma micropipeta. Em seguida, visualize a lâmina com um microscópio e separe os fios dos ovaríolos uns dos outros usando uma pinça.

Não machuque as pontas dos ovaríolos durante este processo. Eles contêm a germária. Ao preparar o cérebro para o complexo de órgãos reprodutivos, remova qualquer cutícula residual e espalhe as estruturas na lâmina.

Em seguida, limpe a maior parte do excesso de PBT e, em seguida, aplique uma gota de reagente de montagem na amostra. Em seguida, coloque lentamente uma lamínula na lâmina usando uma pinça e guarde a lâmina a quatro graus Celsius no escuro. Mais tarde, observe as amostras ao microscópio e traga os órgãos esteroidogênicos para o campo de visão.

Depois que a visualização for fixa, mude o sistema de imagem para o modo de aquisição de imagem. Durante os estágios larvais, a glândula pró-torácica foi marcada com anticorpos contra enzimas ecdissteroidogênicas, incluindo o anticorpo anti-mortalha. Para visualizar a conexão neuronal entre a glândula protorácica e o cérebro, o complexo da glândula do anel cerebral foi dissecado.

O método de dissecção do filé mostra o sistema nervoso estomatogástrico, no qual um grupo de neurônios serotoninérgicos se projeta para a glândula pró-torácica, o proventrículo e os músculos faríngeos. Em mulheres adultas, o ecdisteróide ovariano afeta muitos aspectos da ovogênese, como a proliferação de GSC. As GSCs estão localizadas no germário, na ponta de cada ovaríolo no ovário.

Dentro do germário, as GSCs foram especificamente marcadas usando dois anticorpos, 1B1 e DE-caderina. Para visualizar a inervação do ovário, o ovário foi dissecado, juntamente com o cérebro, VNC, intestino, prop, útero e espermateca. Os neurônios foram visualizados por mCD8:GFP sob o controle do driver n-Synaptobrevin GAL4.

Além disso, a estrutura dos músculos foi corada com faloidina diconjugada. Embora a dissecção dos órgãos esteroidogênicos possa parecer difícil no início, use este filme para aprender o ponto de corte dos tecidos para isolar mais facilmente o órgão sem lesões. Esperamos que nosso protocolo seja informativo, não apenas para iniciantes, mas também para pesquisadores experientes.

Uma vez dominado, você pode aplicar esse procedimento à sua pesquisa e aprimorar para atender às suas necessidades. Esperamos que este protocolo ajude na compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteróides. Protocolos passo a passo mais detalhados estão disponíveis no manuscrito.

Por favor, confira.