Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos em larvas ou fêmeas adultas da mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a compreender a biossíntese de hormônios esteroides em insetos e o mecanismo regulatório neuronal subjacente ao acasalamento e à metamorfose. A principal vantagem desta técnica é que a inervação dos órgãos esteroidogênicos e a porção relativa de seus órgãos interativos permanecem intactas.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois os órgãos esteroidogênicos em larvas de mosca são bastante pequenos e transparentes. Meu laboratório e eu estamos satisfeitos em compartilhar nossos protocolos de dissecação. Então, vamos começar.

Após preparar as larvas, inicie a dissecação no sentido longitudinal em uma placa de três centímetros preenchida com PBS, sob um microscópio estereoscópico. Primeiro, segure o gancho bucal com pinça. Em seguida, utilizando tesoura microcirúrgica, corte o corpo a cerca de um terço do comprimento a partir da extremidade anterior.

Em seguida, segure o comprimento anterior com um par de pinças e use um segundo par para empurrar suavemente a ponta da cabeça para dentro do corpo, invertendo completamente o corpo larval. Prepare até 20 larvas desta maneira dentro de 10 minutos e, em seguida, transfira-as para a solução fixadora. Após 30 minutos, lave as preparações e prossiga com a imunomarcação.

Para começar, mantenha as larvas imersas em água por cerca de uma hora, para asfixiá-las e, assim, imobilizar as larvas. Em seguida, posicione uma larva com o lado dorsal voltado para cima em uma gota de PBS sobre um recipiente revestido com silicone. O lado dorsal possui os dois tubos traqueais.

Sob um microscópio estereoscópico, use pinças para inserir um alfinete de inseto na extremidade anterior. Em seguida, estique o corpo para o lado posterior e insira um segundo alfinete na extremidade posterior. A seguir, faça uma pequena incisão próximo à cauda usando tesoura microcirúrgica.

A partir do corte, corte cuidadosamente a cutícula dorsal longitudinalmente ao longo da linha média dorsal, em direção à cabeça, sem danificar nenhum dos tecidos sob a cutícula. Após fazer o corte, afaste as paredes do corpo e fixe-as com alfinetes entomológicos nos cantos. Em seguida, utilizando pinças, remova o corpo gorduroso anterior e as glândulas salivares, expondo assim o complexo cérebro-glândula anular na superfície.

Agora, aspire o PBS e imerja o preparo na solução fixadora. Após 30 minutos, use pinças para remover os alfinetes de inseto e transfira o preparo para um microtubo contendo PBT 0,3%. Em seguida, prossiga com a imunomarcação.

Após a imunomarcação das larvas, utilize uma pipeta descartável para transferir as amostras para uma placa contendo PBT a 0,3%. Sob um microscópio estereoscópico, segure a cutícula ou o gancho bucal com um par de pinças. Em seguida, utilize uma agulha de 27 gauge acoplada a uma seringa de um mililitro, como se fosse uma faca, para remover o complexo encéfalo-glândula em forma de anel-disco ocular da cutícula do corpo, cortando a extremidade anterior do esôfago e dos discos oculares.

Em seguida, utilizando pinças, separe cuidadosamente o esôfago e o intestino do complexo de disco cerebral-glândula anelar-olho. Puxe o intestino para o lado posterior, já que o esôfago passa pelo cérebro acima da cadeia nervosa ventral. Por fim, para isolar o complexo cérebro-glândula anelar, corte cuidadosamente as conexões entre o disco cerebral, os discos oculares e os discos das patas, com uma faca de agulha.

É bastante essencial usar pinças finas com bordas afiadas durante a dissecação. Recomendo enfaticamente que você afie as pinças com um pedaço de pedra de amolar para unir suas bordas sem qualquer folga. Para transferir as amostras, utilize uma micropipeta com ponteira de orifício largo.

Deposite as amostras no centro da lâmina de vidro. Em seguida, use pinça para posicionar as amostras em suas faces ventrais, de modo que a glândula anelar, localizada no lado dorsal do cérebro, possa ser visualizada. A seguir, incline a lâmina e remova o máximo possível do PBT em excesso.

Em seguida, coloque uma gota de agente de montagem próximo às amostras e use pinças para abaixar lentamente uma lamínula sobre o agente, e depois sobre as amostras. Para dissecar o ovário de fêmeas adultas, anestesie as moscas com gás dióxido de carbono. Em seguida, corte as cabeças e transfira os corpos para uma placa de três centímetros preenchida com PBS.

Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, segure o lado dorsal do tórax com uma pinça e segure o segmento abdominal A-5 ou A-6 com um segundo par de pinças. Depois, retire cuidadosamente a cutícula abdominal em direção ao lado posterior. Antes de prosseguir, remova a cutícula adesiva das pinças.

Em seguida, pinçe um oviduto e isole o ovário. Depois, penteie e espalhe as pontas do ovário usando uma pinça. Uma vez espalhado, imerja o ovário na solução fixadora por 30 minutos, para prepará-lo para coloração.

Para preparar uma amostra que mantenha a inervação do ovário, transfira moscas fêmeas anestesiadas para um recipiente revestido com silicone contendo PBS. Sob o microscópio de dissecação, segure o probóscide e remova a cutícula da cabeça para expor o cérebro. A partir do cérebro, remova a traqueia conectada, deixando o cérebro ligado à cadeia ganglionar ventral.

Em seguida, segure o tórax pelo lado dorsal e remova as pernas e as asas. Depois, retire cuidadosamente a cutícula ventral do tórax, começando na base de cada perna. Uma vez exposto o CNV, remova com muita cautela a cutícula dorsal residual e os músculos aderidos ao CNV, utilizando pinças.

Não danifique as conexões entre o cérebro e o cordão nervoso ventral (VNC). Em seguida, usando pinça, remova a cutícula abdominal para expor os ovários e seus órgãos interativos, que incluem o prop, o intestino, o oviduto, o útero e a glândula acessória. Por fim, remova todos os tecidos residuais, incluindo a traqueia e o corpo adiposo.

Em seguida, imergir as amostras na solução fixadora por 30 minutos, para prepará-las para imunomarcação. Após a imunomarcação, transferir as amostras para uma lâmina de vidro com PBT 0,1% utilizando uma micropipeta. Em seguida, observar a lâmina ao microscópio e separar os filetes dos ovaríolos uns dos outros usando pinça.

Não lesione as pontas dos ovaríolos durante este processo. Elas contêm os germários. Ao preparar o complexo cérebro-órgãos reprodutivos, remova qualquer cutícula residual e espalhe as estruturas sobre a lâmina.

Em seguida, remova a maior parte do PBT em excesso e aplique uma gota do agente de montagem sobre a amostra. Depois, coloque lentamente uma lamínula sobre a lâmina usando pinça e armazene a lâmina a quatro graus celsius no escuro. Posteriormente, observe as amostras ao microscópio e posicione os órgãos esteroidogênicos no campo de visão.

Uma vez que a visualização esteja fixada, altere o sistema de imagem para o modo de aquisição de imagens. Durante as fases larvais, a glândula protorácica foi marcada com anticorpos contra enzimas ecdisteroidogênicas, incluindo o anticorpo anti-shroud. Para visualizar a conexão neuronal entre a glândula protorácica e o cérebro, o complexo cérebro-glândula em anel foi dissecado.

O método de dissecação em filet mostra o sistema nervoso estomatogastrico, no qual um grupo de neurônios serotoninérgicos projeta-se para a glândula protorácica, o proventrículo e os músculos faríngeos. Em fêmeas adultas, o ecdisteroide ovariano afeta muitos aspectos da ovogênese, como a proliferação das CSG. As CSGs estão localizadas no germário na ponta de cada ovaríolo no ovário.

No interior do germário, as CSGs foram especificamente marcadas usando dois anticorpos, 1B1 e DE-caderina. Para visualizar a inervação do ovário, o ovário foi dissecado, juntamente com o cérebro, o CNC, o intestino, o prop, o útero e a espermateca. Os neurônios foram visualizados por mCD8:GFP sob o controle do promotor GAL4 de n-Synaptobrevin.

Além disso, a estrutura dos músculos foi corada utilizando faloidina dicongugada. Embora a dissecação dos órgãos esteroidogênicos possa inicialmente parecer difícil, utilize este vídeo para aprender os pontos de corte dos tecidos e isolar o órgão mais facilmente sem lesão. Esperamos que nosso protocolo seja informativo, não apenas para iniciantes, mas também para pesquisadores experientes.

Uma vez dominado, você pode aplicar este procedimento à sua pesquisa e adaptá-lo conforme suas necessidades. Esperamos que este protocolo contribua para a compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteroides. Protocolos mais detalhados, passo a passo, estão disponíveis no manuscrito.

Por favor, dê uma olhada.