Name: Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a isolar proteínas de filamento intermediário de múltiplos tecidos de rato para estudar modificações pós-traducionais associadas ao envelhecimento. Este método automatizado permite processamento rápido e eficiente de amostras.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill]. Os autores agradecem a Deekshita Ramanarayanan pela assistência com qPCR e Western blot experiências.

O protocolo é aprovado e realizado de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte. 1. Preparações <ol><li> Preparar tampão Triton-X (Triton X-100 a 1%, ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar o volume em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 mL: agitar 5 mL cada de Triton X-100 e EDTA 500 mM em 490 mL de PBS, pH 7,4. Armazenar a solução tampão Triton-X a 4 ° C. </li><li> Preparar tampão de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,5%, aumentar o volume em H 2 O duplamente destilado). Para fazer 500 mL: agitar 10 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 mL de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 mL de EDTA 0,5 M e 2,5 mL de Triton X-100, ajustar o volume a 500 ML usando água destilada dupla). Solução alta do amortecedor de sal em 4 ° C. </li><li> Justo antes do uso, suplementar uma quantidade apropriada de Triton-X e de Tampão de Alta Sal ( <em&gt; Por exemplo 1 mL para cada amostra de tecido de 25 mg) com um cocktail de protease ou inibidor de protease / fosfatase e descartar qualquer tampão não utilizado contendo os inibidores. </li><li> Preparar EDTA 5 mM em 1x PBS, pH 7,4. Para fazer 500 mL: agitar 5 mL de EDTA 0,5 M em 495 mL de 1x PBS, pH 7,4. </li><li> Isolar os diferentes órgãos do rato (cérebro, coração, pulmão, fígado, pâncreas, cólon, intestino, rim, baço) utilizando protocolos aprovados que cumpram as diretrizes veterinárias e os padrões institucionais 23 . O procedimento de coleta de tecidos não deve levar mais de 5 min para preservar o RNA ea integridade proteica dos tecidos ricos em proteases ( por exemplo, o pâncreas deve ser processado primeiro). </li><li> Cortar uma pequena quantidade de tecido (~ 5-20 mg) e colocar em solução de armazenamento de ARN, para posterior extração de RNA, síntese de cDNA e análise quantitativa em tempo real PCR para a expressão do gene IF. Coloque os tubos de solução de armazenamento de RNA com tecido a 4 ° C durante a noite e siga o protocolo do fabricante para maisEtapas de toragem e isolamento. </li><li> Corte o resto do tecido em fragmentos menores ( por exemplo, 0,5 cm) e coloque em criovial. Snap-freeze e armazenar os frascos a -80 ° C ou nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. </li></ol> 2. IF Análise de Expressão Gênica <ol><li> Extrair ARN de tecidos preservados no reagente de solução de armazenamento de ARN. Utilizar qualquer método de extracção de ARN adequado / preferido de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar a concentração de RNA e usar 2 μ g de RNA para gerar cDNA usando um adequado transcrição reversa kit de acordo com o fabricante do protocolo. </li><li> Utilizando os cDNA gerados e os iniciadores específicos do gene IF do rato criaram reacções qPCR, incluindo três repetições técnicas de cada amostra bem como controlo em branco de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar IF expressão gênica como dobra alterar comparando diferentes condições ( por exemplo, jovens versus tecidos antigos). </li></ol> 3. PDe lisados ​​teciduais totais para Immunoblot <ol><li> Homogeneizar 25 mg de tecido em 1 mL de tampão de amostra SDS não redutor 2x. Omitir o corante azul de bromofenol do tampão de amostra se um ensaio de proteína colorimétrica é para ser realizado para quantificar a concentração de proteína. </li><li> Adicionar 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (2-ME) para fazer amostras reduzidas. A 200 μL das amostras não redutoras, adicionar 10 μL de 2-ME. </li><li> Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína compatível com detergente e agente redutor. Se o corante já estiver incluído no tampão de amostra, a quantidade de proteína pode ser estimada após a execução de um gel através de várias técnicas, incluindo a mancha baseada em Coomassie 24 . </li><li> Vortexar todas as amostras e aquecer a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Realizar western blotting tanto em condições de redução como de não-redução. A membrana de exposição brevemente (&lt;1 min) revela espécies monoméricas, e mais tempo (&gt; 1 min) para revelar complexos de massa molecular elevada contendoNg IF proteínas. Se monitorar a agregação, examine todo o gel / membrana (incluindo o fundo dos poços de gel). </li><li> Executar um gel paralelo e mancha com uma mancha de proteína como um controle de carga 24 . Em modelos de doença ou em experimentos de lesões, a mancha de proteína total deve ser usada como um controle de carga, ao contrário de imunotransferências para proteínas de &quot;limpeza&quot; ( por exemplo , actina, GAPDH) porque estas mudam sob condições de estresse diferentes. </li></ol> 4. Preparação de extractos solúveis em detergente e sal de FIs específicos de tecido <ol><li> Adicionar 1 mL de tampão Triton X-100 gelado para um homogeneizador de tubo de vidro e colocá-lo em gelo. </li><li> Remova um pequeno pedaço de tecido (~ 25 mg) do armazenamento de azoto líquido e coloque-o directamente no homogeneizador de vidro. Utilize um pilão de politetrafluoroetileno para homogeneizar (50 pancadas) e evite fazer bolhas. Manter o homogeneizador eo lisado frios em todos os momentos. </li><li> Transferir o lisado para um micr de 1,5 mLNum tubo de ocentrifuga em gelo e centrifugar a 20 000 xg durante 10 min numa centrífuga pré-arrefecida (4 ° C). </li><li> Recolher a fracção sobrenadante num tubo separado. Esta é a fracção solúvel em Triton X, que pode ser utilizada para imunoprecipitação (ip) e análise do conjunto solúvel em detergente de proteínas IF. Note que os passos 4.1-4.4 podem ser repetidos para se obter um extracto IF mais limpo do tecido cerebral. </li><li> Adicionar 1 mL de High Salt Buffer ao sedimento de tecido, transferir para um homogeneizador limpo e dounce 100 traços. Transferir o homogeneizado para o tubo de microcentrífuga e colocar o tubo num agitador rotativo na câmara fria durante 1 h. </li><li> Centrifugar os homogeneizados a 20 000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 mL de tampão PBS / EDTA arrefecido em gelo ao sedimento e homogeneizar o grânulo (20 movimentos) num homogeneizador limpo como um passo de limpeza final *. Transferir para um novo tubo e centrifugar a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para obter a proteína IF-Rico em sal (HSE). * Opcionalmente, vortex em vez de homogeneização nesta etapa. </li><li> Descartar o sobrenadante e dissolver os sedimentos em 300 μL de tampão de amostra SDS não redutor que foi pré-aquecido. Separar o sedimento inicialmente por pipetagem e agitação em vórtex, e depois aquecer as amostras durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Vortex e pipeta conforme necessário para assegurar que a pastilha seja dissolvida. Pode levar vários minutos para dissolver completamente os grânulos. </li><li> Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise. </li></ol> 5. Lise automatizada de tecidos para extração de proteínas IF em experimentos de alto volume <ol><li> Para a extracção de ARN, colocar um tampão de lise (600 μL de tampão por 25 mg de tecido) num tubo contendo matriz de lisação D (utiliza pequenas esferas cerâmicas) e pulsar duas vezes durante 25 segundos no lisador de tecido. Separar o lisado da matriz por centrifugação a 20 000 xg e prosseguir para a fase seguinte isoladamente. </li><li> Para a extração de proteínas, coloque o TritEm X-100 (ou tampão de amostra de SDS, se preparar o lisado total) num tubo de lise com matriz de lise SS (utilizar um único rebordo de aço inoxidável). Após o teste de várias matrizes, este foi selecionado porque produz extratos de proteína IF que estão em qualidade similar ao método tradicional douncing. Observe que o método automatizado não é ótimo para pâncreas e baço, eo protocolo de homogeneização padrão deve ser usado para esses tecidos. </li><li> Para prosseguir com a preparação de Extracto de Sal Alta, retire o cordão de aço inoxidável do tubo utilizando um íman e centrifugue os tubos a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Continue com a etapa 4.4 (acima) do protocolo manual. </li><li> Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise. </li></ol> 6. Imuno-enriquecimento de proteínas IF pós-translacionalmente modificadas <ol><li> Preparar tampão PBST (Tween-20 a 0,02% em PBS). Para fazer 50 mL, adicione 10 μL de Tween-20 a 50 mL de PBS, pH 7,4. </li><li> Preparar PTM anticorpo(1-10 μg de anticorpo em 200 μL de PBST). Em geral, 3 μg de anticorpo / reacção é uma boa condição de partida que pode ser ainda mais optimizada se necessário. </li><li> Para cada reação, alíquota de 50 μL de esferas magnéticas em um tubo de microcentrifuga, coloque no ímã e aspirar a solução de armazenamento de talão. </li><li> Conjugar as esferas ao anticorpo de imunoprecipitação por re-suspensão na solução de anticorpo e incubar no rotador (fim-sobre-fim, para assegurar a mistura de pequenos volumes) à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Coloque os tubos no imã e aspirar a solução de anticorpos. </li><li> Enxaguar as esferas conjugadas com anticorpo uma vez em 200 μL de PBST e remover o tampão de lavagem. </li><li> Adicionar 0,6-1 mL do lisado de tecido às esferas, misturar por pipetagem suave e incubar durante 3 h no rotador numa câmara fria. </li><li> Coloque os tubos no ímã, remova o lisado e lave as esferas cinco vezes com 200 μL de PBST. Após o último passo de lavagem, recolher as pérolas em 100 _6; L de PBS (sem Tween-20) e transferir para um novo tubo limpo. Coloque o tubo no ímã. </li><li> Aspirar o PBS e adicionar 100 μL de tampão de amostra não redutor. Remover 50 μL e adicionar 2-ME (5%) para fazer amostras redutoras. Aquecer as amostras a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Separar a fração ip das contas no ímã e recolhê-lo em um novo tubo. </li><li> Armazenar as amostras a -20 ° C até análise. </li></ol> 7. Preparação de Amostras de Proteínas IF para Análise de Espectrometria de Massa <ol><li> Programar uma consulta com um especialista em proteômica antes de iniciar um estudo, pois há tempo e custo significativos envolvidos com a análise de espectrometria de massa. </li><li> Tome precauções especiais para evitar a contaminação. Manuseie todos os géis com luvas limpas e incube em recipientes limpos, lavados apenas com DDH 2 O (evite sabão). </li><li> Executar 20-50 μL da amostra HSE (das Secções 4 e 5) num gel SDS-PAGE de acordo com as condições padrão. </lI&gt; <li> Mancha com uma mancha de proteína durante 1 h. Lavar várias vezes e desidratação em ddH 2 O durante a noite. As bandas de proteína IF devem ser facilmente visíveis após a descoloração. </li><li> Coloque o gel entre protetores de folha de plástico, digitalizar e marcar as bandas que serão excisadas e enviadas para análise. </li><li> Excise as bandas de proteína IF usando uma nova navalha limpa. </li><li> Coloque as bandas de gel em tubos de microcentrífuga limpa e transfira para uma instalação de espectrometria de massa. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Métodos que permitem a caracterização bioquímica de proteínas IF podem ser úteis para compreender numerosos fenômenos fisiopatológicos em sistemas de mamíferos, uma vez que as proteínas IF são marcadores e moduladores do estresse celular e tecidual 29 . O princípio subjacente ao método actual baseia-se nos procedimentos iniciais desenvolvidos nas décadas de 1970 e 1980 para isolar, separar e reconstituir as proteínas IF das células e tecidos, empregando geralmente soluções salinas de baixo e alto...

<html> As IFs são uma família de proteínas que nos seres humanos são codificadas por 73 genes e categorizadas em seis tipos principais: os tipos I a IV são citoplasmáticos ( por exemplo, queratina epitelial e capilar (K), desmina de miócitos, neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e outros); Tipo V são as laminas nucleares; E tipo VI são IFs na lente ocular 1 . Em termos de sua organização molecular, as proteínas IF têm três domínios comuns: um domínio &quot;var&quot; de bobina enrolada altamente conservado e domínios globulares &quot;cabeça&quot; e &quot;cauda&quot;. Os tetrâmeros de proteína IF se unem para formar precursores de filamentos curtos, que são finalmente incorporados em filamentos maduros que formam estruturas citoesqueléticas dinâmicas e nucleoesqueléticas envolvidas na proteção mecânica 2 , sensação de estresse 3 , 4 , regulação da transcrição 5 e crescimento e outras funções celulares críticas&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . A importância funcional do sistema IF é evidenciada pela existência de muitas doenças humanas causadas por mutações missense em genes IF, incluindo neuropatias, miopatias, doenças de fragilidade cutânea, disfunções metabólicas e síndromes de envelhecimento prematuro 8 . Algumas mutações no gene IF não causam, mas predispõem seus portadores à progressão da doença, como as queratinas epiteliais simples na doença hepática 9 . Este último é devido às funções críticas de proteção ao estresse das IF no epitélio. As IFs em geral estão entre as proteínas celulares mais abundantes sob condições basais, mas são ainda fortemente induzidas durante vários tipos de estresse 10 . Por exemplo, estudos recentes que avaliam alterações de todo o proteoma no nematóide C. elegans demonstraram que as IFs múltiplas estão altamente reguladas e propensas a agregaçõesDurante o envelhecimento do organismo 11 , 12 . Uma vez que a manutenção de uma estrutura IF adequada é essencial para a resistência celular a várias formas de stress 10 , a agregação IF também pode contribuir para o declínio funcional durante o envelhecimento. Contudo, estudos de nível organizacional que examinam múltiplas proteínas de mamífero IF em diferentes tecidos submetidos a estresse estão faltando. IFs são estruturas altamente dinâmicas que se adaptam para atender demandas celulares. As queratinas, por exemplo, sofrem uma ciclagem independente da biossíntese entre o pool protéico solúvel (não filamentoso) e insolúvel (filamentoso) 13 . Em condições fisiológicas normais, pode extrair-se aproximadamente 5% do pool K8 / K18 total em tampão sem detergente, em comparação com aproximadamente 20% que pode ser solubilizado no detergente não iónico Nonidet P-40, que é bioquimicamente comparável a Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Durante a mitose, há um aumento notável na solubilidade do K8 e K1814 do epitélio de tipo simples, que é menos aparente nas queratinas epidérmicas, mas mais aparente na vimentina e em outras proteínas IF do tipo III 15,16 . As propriedades de solubilidade das proteínas IF são fortemente reguladas pela fosforilação, uma modificação pós-translacional chave (PTM) para rearranjo de filamentos e solubilidade 17 , 18 , 19 , 20 . A maioria das IF sofre regulação extensiva por um número de PTMs em locais conservados, resultando em alterações funcionais 17 . A finalidade deste método é introduzir os investigadores que são novos ao campo do IF à extração bioquímica e aos métodos analíticos para o estudo de proteínas de FI através dos tecidos múltiplos do rato. EspecíficoAliado, focamos no isolamento de proteínas IF usando um método de extração de alto sal e avaliação de mudanças em PTMs por espectrometria de massa e por anticorpos dirigidos contra PTM. Estes métodos baseiam-se nos procedimentos previamente publicados 21, mas incluem modificações para extrair diferentes tipos de proteína IF para descobrir o mecanismo comum de regulação em toda a família IF. Por exemplo, a acetilação de K8 num resíduo de lisina específico regula a organização do filamento, enquanto que a hiperacetilação promove a insolubilidade do K8 e a formação de agregados 22 . Recentes estudos globais de perfil proteómico revelaram adicionalmente que a maioria das proteínas IF específicas de tecido são também alvos para acetilação e que a maioria dos locais de acetilação de IF estão confinados ao domínio de haste altamente conservado. Isso destaca a necessidade de métodos adequados para o perfil global do sistema IF. Nós também introduzimos um método rápido de isolar IF proteínas de múltiplos tecidos usando homogeneização automatizada em optiMatriz de lise. As preparações resultantes são adequadas para análise PTM a jusante por espectrometria de massa e outros métodos.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>grânulos de imunoprecipitação</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>para tampões</td></tr><tr><td>Purelink RNA mini kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>extração de RNA do tecido</td></tr><tr><td>Purelink DNAse set</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12185010A</td><td>na coluna de digestão</td></tr> <tr>de DNA<td>Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>ímã para uso com dynabeads</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>mancha de gel compatível com espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>para uso em western blot</td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368813</td><td>para uso em análise de expressão gênica</td></tr><tr><td>Sistema de PCR Proflex 3 x 32 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sistema de</td><td>PCR</td>4484073</tr><tr><td>Membrana de transferência PVDF&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>Power Up SYBR master mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td><td>para análise de qPCR</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td>solução para armazenamento de tecido antes do isolamento do RNA</td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Gel de proteína pré-moldado</td></tr><tr><td>Anti-Queratina 8 anticorpo (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>para detecção de western blot de K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>para detecção de western blot de vimentina</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>para transferência úmida de géis de proteína</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>para preparação amostras de gel de proteína</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>para géis de proteína em execução</td></tr><tr><td>Grânulos de lise - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Grânulos de lise e tubos de matriz para ruptura de tecidos e extração de RNA</td></tr><tr><td>Grânulos de lise - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>Grânulos de lise e tubos de matriz para ruptura de tecidos e extração de proteínas</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop Lite</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td>medição de proteínas e ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Homogeneizador Precellys 24</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>Homogeneizador de tecidos automatizado</td></tr></tbody></table>

isolamento de proteínas de filamento intermediário a partir de tecidos múltiplos de rato para estudar modificações pós-translacionais associadas ao envelhecimento

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Filamentos intermediários (IFs), juntamente com filamentos de actina e microtúbulos, formam o citoesqueleto - um elemento estrutural crítico de cada célula. Funcionamento normal IFs fornecer células com resistência mecânica e estresse, enquanto um citoesqueleto disfuncional IF compromete a saúde celular e tem sido associado a muitas doenças humanas. As modificações pós-translacionais (PTMs) regulam criticamente a dinâmica de IF em resposta a mudanças fisiológicas e sob condições de estresse. Portanto, a capacidade de monitorar as mudanças na assinatura PTM de IFs pode contribuir para uma melhor compreensão funcional e, em última instância condicionamento, do sistema IF como um stress responder durante a lesão celular. No entanto, o grande número de proteínas IF, que são codificadas por mais de 70 genes individuais e expressas de forma dependente de tecidos, é um grande desafio para classificar a importância relativa de diferentes PTMs. Para o efeito, os métodos que permitem a monitorização de PTMs em proteínas IFEm nível de organismo, e não para membros isolados da família, pode acelerar o progresso da pesquisa nesta área. Aqui, apresentamos métodos bioquímicos para o isolamento da fração total, detergente-solúvel e resistente ao detergente de proteínas IF de 9 diferentes tecidos de ratos (cérebro, coração, pulmão, fígado, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, rim e baço). Demonstrámos ainda um protocolo optimizado para o isolamento rápido de proteínas IF utilizando matriz de lise e homogeneização automatizada de diferentes tecidos de ratinho. O protocolo automatizado é útil para perfilar IFs em experimentos com alto volume de amostra (como em modelos de doença envolvendo múltiplos animais e grupos experimentais). As amostras resultantes podem ser utilizadas para várias análises a jusante, incluindo perfis PTM de espectrometria de massa. Utilizando estes métodos, fornecemos novos dados para mostrar que as proteínas IF em diferentes tecidos de rato (cérebro e fígado) sofrem mudanças paralelas com respeito à sua expressãoE PTMs durante o envelhecimento.

Um novo método rápido para a alta extração salina de proteínas IF de múltiplos tecidos de ratos usando matriz de lise. O método tradicional 25 , 26 de isolar a maior parte da fracção de proteína de filamento intermediário a partir do tecido epitelial foi aqui modificado para incluir 9 órgãos diferentes e um proced...

Neste método, apresentamos procedimentos bioquímicos para isolamento rápido e eficiente de proteínas de filamento intermediário (IF) a partir de tecidos de múltiplos ratos. IFs isoladas podem ser usadas para estudar mudanças em modificações pós-translacionais por espectrometria de massa e outros ensaios bioquímicos.

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

O objetivo geral deste procedimento bioquímico é isolar frações enriquecidas com filamentos intermediários a partir de múltiplos tecidos de camundongos, a fim de estudar modificações pós-traducionais das diferentes proteínas de filamentos intermediários específicas de tecido. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área dos filamentos intermediários, como por exemplo como a função e a regulação dessas importantes proteínas citoesqueléticas protetoras contra estresse são afetadas durante o envelhecimento de mamíferos. A principal vantagem desta técnica é que a inclusão de uma etapa automatizada de lise tecidual permite aos usuários processar múltiplas amostras de tecido de maneira rápida e eficiente.Para começar, adicione um mililitro de tampão Triton X-100 gelado, suplementado com inibidores de protease, em um homogeneizador de tubo de vidro e coloque-o no gelo. Remova um pequeno fragmento de tecido do armazenamento em nitrogênio líquido e coloque-o diretamente no homogeneizador de vidro. Em seguida, mantendo sempre o homogeneizador e a amostra no gelo, utilize aproximadamente 50 movimentos de um pistilo de politetrafluoretileno para homogeneizar a amostra, minimizando ao máximo a formação de bolhas.Transfira o lisado para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro em gelo e centrifugue a amostra a 20.000 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, colete a fração do sobrenadante solúvel em Triton X em um tubo separado. Esta fração pode ser usada para imunoprecipitação e análise do pool solúvel em detergente das proteínas IF.Em seguida, adicione ao pellet de tecido um mililitro de tampão de alta salinidade suplementado com inibidores de protease. Transfira para um homogeneizador limpo e homogeneíze com 100 movimentos. Transfira o homogenato de volta para o tubo de microcentrífuga e coloque o tubo em um agitador rotativo na câmara fria durante uma hora.Centrifugue os homogenatos a 20.000 × g a quatro graus Celsius por 20 minutos e descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão PBS EDTA gelado ao pellet e transfira-o para um homogeneizador limpo como etapa final de limpeza. Após a homogeneização, transfira a amostra para um novo tubo e centrifugue-a a 20.000 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos para obter o extrato salino rico em proteína IF, ou HSC.Descarte o sobrenadante e dissolva o precipitado em 300 microlitros de tampão amostral SDS não redutor pré-aquecido. Desagregue inicialmente o precipitado por pipetagem e vortex. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos.Vortexie e pipete conforme necessário, para garantir que o pellet esteja completamente dissolvido, o que pode levar vários minutos. Armazene todas as amostras a menos 20 graus Celsius até a análise. Para realizar a extração de RNA, adicione o tampão de lise em um tubo contendo matriz D de lisina, em seguida adicione o tecido da amostra ao lisador de tecidos e aplique dois pulsos de 25 segundos cada.Se pare o lisado da matriz por centrifugação a 20.000 vezes G. Para extração de proteína, adicione tampão amostra Triton X-100 ou SDS se estiver preparando lisado total. Em um tubo de lisina com matriz de lisina SS. Em seguida, adicione o tecido da amostra. Pulse brevemente a amostra para homogeneizar.Para preparar HSC, use um ímã para remover a esfera de aço inoxidável do tubo e centrifugue os tubos a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Separe as frações de sobrenadante e de pellet e prossiga conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Prepare o tampão PBST adicionando 10 microlitros de T20 a 50 mililitros de PBS pH 7,4.Em seguida, prepare a solução de anticorpo PTM adicionando um a 10 microgramas de anticorpo a 200 microlitros de PBST. Aliquote 50 microlitros de microesferas magnéticas em um tubo de microcentrífuga. Coloque-o no ímã e aspire a solução de armazenamento das microesferas.Conjugue as microesferas ao anticorpo de imunoprecipitação ressuspendendo-as na solução de anticorpo e incubando a amostra em agitador rotativo à temperatura ambiente por 20 minutos. Coloque os tubos no ímã e aspire a solução de anticorpo. Em seguida, use 200 microlitros de PBST para lavar uma vez as microesferas conjugadas ao anticorpo e remova a solução.Adicione de 0,6 a um mililitro do lisado tecidual às microesferas. Misture pipetando suavemente e incube a solução em um agitador rotativo em câmara fria por três horas. Coloque os tubos no ímã e remova o lisado, depois use 200 microlitros de PBST para lavar as microesferas cinco vezes.Após a última etapa de lavagem, colete as microesferas e 100 microlitros de PBS e transfira as microesferas para um novo tubo limpo. Coloque o tubo no ímã e, em seguida, aspire o PBS. Retire o tubo do ímã e adicione 100 microlitros de tampão amostral não redutor.Aliquotar 50 microlitros do tubo e combiná-los com 5%2ME para preparar amostras redutoras. Aquecer as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Com o tubo no ímã, coletar a fração de IP das microesferas e transferi-la para um tubo novo.Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até a análise. Para evitar a contaminação das amostras de proteína para análise por espectrometria de massa, use luvas limpas para manipular todos os géis e incube-os em recipientes limpos que tenham sido lavados apenas com H₂O DD. Execute 20 a 50 microlitros da amostra de HSE em um gel SDS-PAGE conforme condições padrão.Após corar o gel de acordo com o protocolo descrito no texto, coloque o gel entre protetores plásticos. Em seguida, escaneie e marque as bandas que serão recortadas. Utilize uma lâmina nova e limpa para recortar as bandas proteicas de IF e coloque as bandas em tubos de microcentrífuga limpos sobre gelo antes de enviá-las para análise por espectrometria de massas.Esta figura mostra um resultado típico de HSEs de nove tecidos de camundongo isolados usando o método rápido. Observe que este método não funciona bem no pâncreas e no baço, e produz bandas adicionais em uma amostra de intestino grosso. Esta análise de expressão gênica mostra que a Queratina 8 é regulada para cima durante o envelhecimento.Além disso, os Western blots mostram que a Queratina 8 é fortemente regulada para cima nos fígados de camundongos idosos. Aqui, um HSE de fígado obtido usando o protocolo automatizado demonstra o forte enriquecimento das Queratinas 8 e 18 no gel. A análise por espectrometria de massas mostra que as K8 e K18 no fígado de um camundongo idoso possuem múltiplos sítios de fosforilação e acetilação que não estão presentes no fígado do camundongo jovem.De forma semelhante às alterações da queratina no fígado, a análise de tecido cerebral por QPCR revela uma indução cinco vezes maior do mRNA de GFAP nos cérebros de camundongos de 24 meses em comparação com camundongos de três meses. Por fim, a análise proteica dos extratos de alta salinidade por coloração de Coomassie e blots imunológicos de frações totais e enriquecidas em lisina acetilada revela que a proteína GFAP está regulada para cima e acetilada no cérebro de camundongos envelhecidos. Após este procedimento, outros métodos, como o proteoma baseado em espectrometria de massas, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como quais são as importantes modificações pós-traducionais e as proteínas interagentes das proteínas de filamento intermediário durante diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar proteínas de filamentos intermediários de diferentes tecidos de mamíferos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em imagem in vivo para determinar o declínio da proteostase devido ao envelhecimento. O ensaio usa Caenorhabditis elegans expressando a proteína de fusão de poliglutamina YFP nos músculos da parede corporal para medir a agregação de poliglutamina associada à idade e a indução de proteotoxicidade, levando à paralisia.

Ensaio de Paralisia Fluorescente Baseado em Repórter: Uma Técnica para Avaliar a Formação Progressiva Associada à Idade de Poliglutamina Repórter Fluorescente e Paralisia Associada em Caenorhabditis elegans

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

Este método descreve uma abordagem robusta e reprodutível para a comparação dos níveis de proteína nos tecidos diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento, utilizando uma abordagem de mancha ocidental quantitativa padronizada.

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos

O protocolo apresenta o fluxo de trabalho de imagem e computacional para extrair e validar cromatina baseada em imagem e a idade epigenética (ImAge).

Medindo o Envelhecimento de Célula Única com um Biomarcador Baseado em Imagem de Cromatina e Envelhecimento Epigenético

Um método de transferência Northern modificado para medir N 6 -methyladenosine (M 6) Um modificações em RNA é descrito. O actual método pode detectar modificações em diversos RNAs e controles sob vários modelos experimentais.

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

Aprenda a isolar proteínas de filamento intermediário de múltiplos tecidos de rato para estudar modificações pós-traducionais associadas ao envelhecimento. Este método automatizado permite processamento rápido e eficiente de amostras.

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

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