Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

O objetivo geral deste procedimento bioquímico é isolar frações enriquecidas com filamentos intermediários de vários tecidos de camundongos, a fim de estudar modificações pós-traducionais das diferentes proteínas de filamentos intermediários específicos do tecido. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do filamento intermediário, como a função e a regulação dessas importantes proteínas do citoesqueleto protetoras do estresse são afetadas durante o envelhecimento dos mamíferos. A principal vantagem dessa técnica é que a incorporação de uma etapa automatizada de lise de tecido permite que os usuários processem várias amostras de tecido de maneira rápida e eficiente.

Para começar, adicione um mililitro de tampão Triton X-100 gelado suplementado com inibidores de protease em um homogeneizador de tubo de vidro e coloque-o no gelo. Remova um pequeno pedaço de tecido do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-o diretamente no homogeneizador de vidro. Em seguida, mantendo o homogeneizador e a amostra no gelo o tempo todo, use aproximadamente 50 golpes de uma pastilha de politetrafluoretileno para homogeneizar a amostra, minimizando a formação de bolhas.

Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sobre gelo e centrifugar a amostra a 20 000 vezes G a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, recolher a fracção sobrenadante solúvel Triton X num tubo separado. Esta fração pode ser usada para imunoprecipitação e análise do pool solúvel em detergente de proteínas IF.

Em seguida, ao pellet de tecido, adicione um mililitro de tampão com alto teor de sal suplementado com inibidores de protease. Transfira-o para um homogeneizador limpo e aplique 100 golpes. Transfira o homogeneizado de volta para o tubo da microcentrífuga e coloque o tubo em um agitador giratório na câmara fria por uma hora.

Centrifugar os homogeneizados a 20 000 vezes G a quatro graus Celsius durante 20 minutos e rejeitar o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão PBS EDTA gelado ao pellet e transfira-o para um homogeneizador limpo como etapa final de limpeza. Após a homogeneização, transfira a amostra para um novo tubo e centrifugue-a a 20.000 vezes G em quatro graus Celsius por 10 minutos para obter o extrato rico em proteínas IF, ou HSC.

Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 300 microlitros de tampão de amostra SDS não redutor pré-aquecido. Quebre o pellet inicialmente pipetando e vórtice. E então aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Vortex e pipeta conforme necessário, para garantir que o pellet esteja totalmente dissolvido, o que pode levar vários minutos. Armazene todas as amostras a 20 graus Celsius negativos até a análise. Para realizar a extração de RNA, adicione tampão de lise em um tubo contendo matriz de lisina D, adicione o tecido da amostra ao lisador de tecido e pulse duas vezes por 25 segundos cada.

Separe o lisado da matriz por centrifugação a 20.000 vezes G. Para extração de proteínas, adicione Triton X-100 ou tampão de amostra SDS se estiver preparando lisado total. Em um tubo de lisina com matriz de lisina SS. Em seguida, adicione o tecido de amostra. Pulsar a amostra brevemente para misturar.

Para preparar o HSC, use um ímã para remover o cordão de aço inoxidável do tubo e centrifugue os tubos a 20.000 vezes G em quatro graus Celsius por 10 minutos. Separe as frações sobrenadante e pellet e proceda conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Prepare o tampão PBST adicionando 10 microlitros de T20 a 50 mililitros de PBS pH 7,4.

Em seguida, prepare a solução de anticorpos PTM adicionando um a 10 microgramas de anticorpo a 200 microlitros de PBST. Alíquota de 50 microlitros de esferas magnéticas em um tubo de microcentrífuga. Coloque-o no ímã e aspire a solução de armazenamento de contas.

Conjugue as esferas ao anticorpo de imunoprecipitação ressuspendendo as esferas na solução de anticorpo e incubando a amostra em um rotador à temperatura ambiente por 20 minutos. Coloque os tubos no ímã e aspire a solução de anticorpos. Em seguida, use 200 microlitros de PBST para enxaguar as esferas conjugadas com anticorpos uma vez e remova a solução.

Adicione 0,6 a um mililitro do lisado de tecido às contas. Misture pipetando suavemente e incube a solução em um rotador em uma câmara fria por três horas. Coloque os tubos no ímã e remova o lisado, depois use 200 microlitros de PBST para lavar as contas cinco vezes.

Após a última etapa de lavagem, colete as contas e 100 microlitros de PBS e transfira as contas para um tubo novo e limpo. Coloque o tubo no ímã e aspire o PBS. Remova o tubo do ímã e adicione 100 microlitros de tampão de amostra não redutor.

Alíquota de 50 microlitros do tubo e combine-o com 5% 2ME para fazer amostras redutoras. Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Com o tubo no ímã, colete a fração IP das contas e transfira-a para um novo tubo.

Armazene as amostras a 20 graus Celsius negativos até a análise. Para evitar a contaminação de amostras de proteínas para análise de espectrometria de massa, use luvas limpas para manusear todos os géis e incube-os em recipientes limpos que foram lavados apenas com DD H2O. Execute 20 a 50 microlitros da amostra HSE em um gel de página SDS de acordo com as condições padrão.

Depois de corar o gel de acordo com o protocolo de texto, coloque o gel entre os protetores de folha de plástico. Em seguida, digitalize e marque as bandas que serão excisadas. Use uma navalha nova e limpa para extirpar as bandas de proteína IF e coloque as bandas em tubos de microcentrífuga limpos no gelo antes de enviá-las para análise de espectrometria de massa.

Esta figura mostra um resultado típico de HSEs de nove tecidos de camundongos isolados usando o método rápido. Observe que esse método não funciona bem no pâncreas e no baço e produz bandas adicionais em uma amostra do intestino grosso. Esta análise de expressão gênica mostra que a queratina 8 é regulada positivamente durante o envelhecimento.

Além disso, western blots mostram que a queratina 8 é fortemente regulada no fígado de camundongos velhos. Aqui, um HSE hepático obtido usando o protocolo automatizado demonstra o forte enriquecimento das queratinas 8 e 18 no gel. A análise de espectrometria de massa mostra que K8 e K18 no fígado de um camundongo velho têm vários locais de fosforilação e acetilação que não estão presentes no fígado do camundongo jovem.

Semelhante às alterações de queratina no fígado, a análise do tecido cerebral por QPCR revela uma indução cinco vezes maior de mRNA GFAP no cérebro de camundongos de 24 meses em comparação com camundongos de três meses. Finalmente, a análise de proteínas dos extratos com alto teor de sal pela coloração de Coomassie e immunoblots de frações enriquecidas com total e acetil lisina revela que a proteína GFAP é regulada e acetilada no cérebro de camundongos idosos. Após este procedimento, outros métodos, como a mistura proteo baseada em espectrometria de massa, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais são as importantes modificações pós-traducionais e parceiros de ligação de proteínas de filamentos intermediários durante diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar proteínas de filamentos intermediários de diferentes tecidos de mamíferos.