Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

O objetivo geral deste procedimento é extrair eficientemente proteínas da válvula mitral cardíaca humana, adequadas para análise proteômica. Este método pode potencialmente ajudar a descobrir mecanismos patogênicos no campo da doença valvar cardíaca, permitindo a identificação de novos marcadores de doenças diagnósticas e prognósticas e, esperançosamente, de alvos terapêuticos. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um fluxo de trabalho de extração eficiente compatível com muitas aplicações analíticas.

Os resultados são uma caracterização mais exaustiva do proteum da valva mitral cardíaca. Além disso, esse protocolo também pode ser aplicado a outros sistemas, como a valva mitral suína, que tem grande semelhança com a valva humana e é usada em modelo experimental para avaliações da função valvar. Demonstrando o procedimento experimental estará Stefania Ghilardi, uma técnica do meu laboratório.

Para preparar a válvula mitral humana, comece com um coração explantado que esteve sob isquemia fria por quatro a 12 horas. Em uma sala limpa, remova o coração da bolsa de transporte e coloque-o em um balde esterilizado. Em seguida, transfira o coração para um gabinete de biossegurança.

Lá, usando um bisturi descartável, corte perpendicularmente ao eixo maior ao nível dos ventrículos esquerdo e direito, a cerca de quatro centímetros do ápice. Em seguida, coloque o coração em uma cortina estéril. Em seguida, afaste a aorta ascendente e a artéria pulmonar para acessar o teto atrial esquerdo.

No teto atrial esquerdo, use fórceps e picaretas para cortar ao redor da aurícula esquerda para expor a válvula mitral. A valva mitral está totalmente contida no ventrículo esquerdo. Assim, exponha o grande folheto mitral e o pequeno folheto mitral.

As comissuras anterolateral e posteromedial definem a borda da área anterior e posterior. Agora, com tesouras e pinças não traumáticas, disseque o átrio esquerdo e a espessura da parede do ventrículo que circunda a válvula mitral. Durante esta dissecção, identifique a continuidade da valva aórtica mitral.

Em seguida, separe o folheto da valva mitral anterior do folheto da valva mitral posterior, cortando ao longo das comissuras que fazem fronteira com o folheto posterior. Quando o procedimento estiver concluído, higienize a mesa do gabinete com uma solução de álcool isopropílico a 70% e uma solução de peróxido de hidrogênio a 6%. Agora, lave o folheto posterior da válvula mitral em solução salina.

Em seguida, corte a válvula em pedaços pequenos, cada um com menos de um centímetro quadrado. Embrulhe as peças individualmente em papel alumínio e congele-as com nitrogênio líquido. Para iniciar a extração de proteínas, use uma pinça para remover uma amostra do nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em gelo seco.

Não deixe a amostra descongelar. Em seguida, em um frasco de dewar cheio de nitrogênio líquido, coloque o almofariz, os pilões associados e a amostra. É fundamental que o nitrogênio líquido seja usado para congelar a amostra e resfriar o sistema de moagem.

Esta etapa evita a degradação biológica e permite uma pulverização eficiente, mas requer treinamento técnico para um manuseio seguro. Depois de congelados, coloque o almofariz e os pilões em uma caixa de poliestireno contendo gelo seco. Além disso, coloque uma espátula sobre o gelo seco.

Em seguida, remova a amostra da folha e coloque-a na argamassa. E posicione o pilão maior acima dele. Usando uma chave de fenda para girar o pilão, triture a amostra de 15 a 20 vezes.

Durante a moagem, misture a amostra com a ponta de uma espátula gelada. Depois de usar o pilão grande, repita o processo de moagem com um pilão menor. A obtenção de um pó fino é fundamental para uma extração eficiente de proteínas.

Agora, despeje a amostra em pó em um tubo de centrífuga de 15 mililitros de massa conhecida. Em seguida, pincele qualquer material restante na argamassa usando uma espátula fria. Mantenha o tubo com a amostra em gelo seco e determine rapidamente a massa da amostra.

Em seguida, despeje a amostra em um tubo homogeneizador de vidro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de ureia para cada 10 miligramas de amostra. Ao fazer isso, recupere os resíduos deixados no tubo enxaguando-os com a alíquota do tampão de ureia.

Agora homogeneizar a amostra usando um pilão PFTE motorizado funcionando a 1.500 rpm. Pressione lentamente o pilão sobre a amostra com um movimento de torção 10 vezes. Em seguida, transfira o sobrenadante amarelo viscoso para um tubo de centrífuga limpo de 1,7 mililitro usando uma pipeta de vidro.

Agora repita a homogeneização na amostra restante usando metade da ureia. Recupere o sobrenadante e combine-o com a coleção anterior. Em seguida, coloque o tubo em um rotador de tubo por 30 minutos.

Após 30 minutos, carregar o tubo em uma centrífuga fria e girar a amostra a 13.000 g por meia hora. Em seguida, recupere o sobrenadante. E meça a concentração de proteína usando o ensaio de proteína de Bradford.

Após a realização do protocolo prescrito, o extrato proteico foi estudado usando uma variedade de métodos após alguns tratamentos adicionais. Um total de 422 proteínas foram identificadas no tecido da valva mitral por eletroforese bidimensional, focalização isoelétrica em fase líquida, cromatografia líquida-espectrometria de massas e cromatografia líquida-espectrometria de massas 2D. As 422 proteínas foram classificadas usando análise de ontologia genética.

As regiões extracelulares continham várias proteínas esperadas e outras proteínas intracelulares e de superfície celular. Muitos dos quais foram identificados pela primeira vez em válvulas mitrais. A presença de quatro dessas proteínas não identificadas anteriormente nas valvas mitrais foi confirmada com anticorpos em três amostras únicas.

As proteínas são Septina-11, Quatro domínios LIM e meio, proteína um, Dermatoponina e alfa cristalina B. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair proteínas da válvula mitral cardíaca para sua identificação e quantificação. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em quase duas horas se executado corretamente. Ao tentar este procedimento, para obter o maior rendimento de proteínas com alta integridade proteica, é vital que as amostras não descongelem durante a transferência.