Name: Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar 3-nitrotirosina livre em urina humana usando extração em fase sólida miniaturizada e LC-MS/MS. Este método sensível e seletivo é ideal para aplicações clínicas e pesquisa de estresse oxidativo.

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Os autores reconheceriam Scott Howard e Abigail Marinack para apoio geral e coordenação deste trabalho.

Todos os estudos envolvendo amostras de urina humana foram realizados aderência ao procedimento aprovado pelo Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB). 1. Coleta de amostras de urina e determinação de creatinina (Cr) <ol><li> Coletar 5 mL das amostras de urina da manhã seguinte após ca. 10 h durante o jejum durante a noite em um tubo de transporte de 5 mL A contendo 250 μL de HCl 3 N como conservante e armazene a -20 ° C até o uso. </li><li> Descongelamento e vórtice 5 mL de urina de transporte Um tubo e centrífuga em uma centrífuga ( eg Sorvall) (2297 xg, 10 min). </li><li> Alíquota 1 mL de urina duas vezes a partir do tubo de transporte de 5 mL A. </li><li> Determine Cr por um método de creatinina urinária 26 . </li></ol> 2. Preparação de Amostras de Padrão, IS e Controle de Qualidade (QC) <ol><li> Preparar uma solução de reserva de 3-NT a 100 μg / mL em água com 0,01% de fase móvel de HCOOH A (MA) e armazenar a -20 ° C. </li><li> FaçoUma solução padrão de trabalho 3-NT a uma concentração de 100 ng / mL, diluindo a solução de reserva de 3 μg de 100 μg / mL com MA. </li><li> Gerar padrões que variam de 5 a 2500 pg / mL por diluição do padrão de trabalho de 100 ng / mL com urina em branco acidificada 0,15 M HCl livre de 3-NT, juntamente com amostras vazias em branco e em branco duplo. </li><li> Prepare uma solução-mãe de IS 13 C 9 -3-NT a 100 μg / mL em água com MA e guarde a -20 ° C. </li><li> Faça uma solução de trabalho de IS a 500 pg / mL por diluição da solução de reserva de 100 μg / mL de 13 C 9 -3-NT IS com MA. </li><li> Estabelecer cinco níveis de amostras de QC que cobrem os níveis LLOQ, baixo, médio e alto ( isto é , 10, 25, 100, 500 e 1.250 pg / mL), por diluição do padrão de trabalho 3-NT na urina vazada acidificada. </li></ol> 3. Procedimento de extração de fase sólida <ol><li> Amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras </li><li> Adicione amostras de urina, padrões e QC sampLes (250 μL cada) para 32 poços de uma placa de coleta de 96 mL de 2 ml. </li><li> Introduza a solução de trabalho de 500 pg / mL IS (50 μL) em cada poço, exceto o exemplo de amostra dupla em branco. Adicione 0,01% de HCOOH (50 μL) ao poço de amostra em branco dupla. </li><li> Adicionar água LC-MS / MS com 0,1% de HCOOH (250 μL). </li><li> Misture a mistura acima com uma pipeta de 8 canais três vezes. </li><li> Cubra a placa até carregar SPE. </li><li> Coloque uma placa de extração de MCX de 96 poços e um reservatório de coleta em um processador de pressão positiva. </li><li> Condicione a placa de extração com MeOH (200 μL) fluindo através do sorvente. </li><li> Equilibre-se fluindo água com 2% de HCOOH (200 μL) através do sorvente. </li><li> Carregue cuidadosamente o volume de cada uma das amostras pré-misturadas na placa de extração pré-condicionada com uma pipeta de 8 canais. </li><li> Ajuste a pressão positiva baixa ( por exemplo , 3 psi) no processador de pressão positiva para permitir que a mistura flua.Abra o sorvente lentamente, ajuste a pressão, se necessário. </li><li> Lave os poços fluindo água com 2% de HCOOH (200 μL) através do sorvente. </li><li> Lave os poços através do fluxo de metanol (200 μL) através do sorvente. </li><li> Lave os poços através da água corrente (200 μL) através do sorvente. </li><li> Secar os poços completamente com ajuste de pressão positiva alta ( por exemplo , 40 psi) no processador de pressão positiva. </li><li> Substitua o reservatório por uma placa de coleta limpa de 2 ml de 96 poços. </li><li> Aplique 25 mM de NH4OAc a pH 9 (50 μL) para eluir o analito retido e IS da placa de extração. </li><li> Pipetar água LC-MS com 5% de HCOOH (50 μL) para neutralizar o eluído. </li><li> Misture com a pipeta de 8 canais três vezes e envie para a estação LC-MS / MS para análise. </li></ol> 4. Análise LC-MS / MS <ol><li> Medir com precisão 2.000 mL de água LC-MS com um cilindro graduado e transferi-lo para uma garrafa de 2 L. </li><li> PIpette 200 μL de HCOOH puro no frasco acima contendo água LC-MS. </li><li> Misture bem e rotule como fase móvel A (MA). Incluir iniciais, data de preparação e data de validade. </li><li> Pegue uma garrafa de 2 litros de metanol LC-MS e rotular como fase móvel B (MB) com data de início e data de validade. </li><li> Ajuste a temperatura do auto-amostragem para 4 ° C. </li><li> Coloque a placa de recolha com amostras preparadas no auto-amostrador. </li><li> Coloque uma coluna PFP (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm) e coluna de guarda no forno. </li><li> Ajuste a temperatura do forno para 30 ° C. </li><li> Equilibre 10 min usando o método de aquisição com a eluição com gradiente LC como mostrado na Tabela 1 . </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> Módulo </td><td> Eventos </td><td> Parâmetro </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> Bombas </td><td> Pump B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Controlador </td><td> Pare </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: condições de eluição do gradiente de cromatografia líquida <ol start="10"><li> Crie uma lista de lote incluindoPadrões, QC e amostras de urina. </li><li> Comece o lote por injeção das amostras preparadas (12 μL). </li></ol> 5. Processo de identificação, integração e dados de picos <ol><li> Controle a aquisição e processamento de dados usando o software. </li><li> Identifique e integre os picos de 3-NT e IS para todas as amostras. </li><li> Estabeleça uma curva padrão com a faixa de 10-2,500 pg / mL para a quantificação 3-NT por regressão linear da relação da área de pico de 3-NT e IS versus a concentração nominal de 3-NT com um fator de ponderação de 1 / x. </li><li> Quantifique todas as amostras usando a curva padrão. </li><li> Determine se as amostras de QC caem no intervalo estabelecido. </li><li> Converta as concentrações detectadas de amostras de urina em resultados finais na unidade de nM ou nmol / mmol Cr. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

As variações substanciais nas concentrações previamente relatadas na literatura para o 3-NT isento endógeno em amostras de urina humana revelam problemas metodológicos associados aos ensaios disponíveis 8 , 9 , 10 , 11 . A determinação precisa do baixo nível basal de 3-NT na urina humana continua a ser uma tarefa desafiadora que requer precauções especiais para a preparação da amostra e a anál...

Os efeitos do estresse oxidativo na apresentação clínica foram empurrados para a vanguarda nos últimos anos 1 . Um dos biomarcadores que estão sendo explorados é o 3-nitrotirosina (3-NT), um produto final estável formado quando as espécies reativas de nitrogênio (RNS) interagem com a tirosina, um precursor de neurotransmissor de catecolaminas. Enquanto 3-NT pode ter valor clínico como biomarcador para RNS in vivo, as mudanças substanciais das propriedades e funções da tirosina podem afetar negativamente as proteínas correspondentes e as funções celulares 1 , 2 . Pesquisas emergentes sugeriram que 3-NT pode desempenhar um papel importante em condições inflamatórias 3 , distúrbios neurodegenerativos 4 , 5 , doença cardiovascular 6 e diabetes 7 , bem como condições relacionadas ao estresse oxidativo. No entanto, estes obseAs explorações são baseadas em resultados de metodologias que não possuem sensibilidade e / ou seletividade 8 , 9 , 10 , 11 . Os enormes intervalos de concentração de 3-NT para as amostras biológicas previamente relatadas na literatura revelam que sérios problemas analíticos estão associados a esses ensaios e a melhoria técnica é necessária para quantificar com precisão os níveis de 3-NT e verificar seu papel na patologia dessas condições . A quantificação de 3-NT livre em matrizes biológicas apresenta um desafio especial para o homem e instrumento 8 , 9 , 10 , 11 . Primeiro, o nível de traço do 3-NT endógeno exige uma detecção ultra-sensível; Em segundo lugar, a existência de numerosos análogos estruturalmente semelhantes, especialmente a tirosina, que está presente emGrande excesso, requer um alto grau de seletividade; Em terceiro lugar, a formação artefactual de 3-NT por nitratação de tirosina com nitrito e nitrito onipresente requer uma consideração especial durante a preparação da amostra para evitar a superestimação falsa de 3-NT. Entre uma grande variedade de metodologias empregadas para medir 3-NT, MS / MS foi considerado o método padrão-ouro devido à sua sensibilidade e seletividade superiores 11 , 12 , 13 , 14 . O MS / MS acoplado com cromatografia gasosa (GC) oferece a melhor sensibilidade, no entanto, as etapas de derivação de amostra indispensáveis ​​são muito tediosas e demoradas para serem eficientes para a utilidade clínica 15 , 16 . O LC-MS / MS não requer uma derivação de amostra complexa, tornando-se a opção mais promissora. No entanto, há vários obstáculos a serem superados, como o seA nitidez dos métodos de LC-MS / MS relatados na literatura precisa melhorar para a medição de 3-NT 7 , 17 , 18 e o tempo de resposta relativamente longo deve ser encurtado para aplicações de alto débito 12 , 13 , 17 , 19 . Além disso, ao considerar aplicações clínicas, a matriz biológica utilizada desempenha um papel significativo. Deve ser fácil e barato obter e não invasivo, se possível 20 , 21 , 22 . O plasma, a amostra tradicionalmente utilizada na literatura, não é uma matriz clinicamente desejável, pelo que foi buscada uma metodologia que utilize urina que não seja invasiva e custo-efetiva. Várias tentativas de desenvolver relAs metodologias de LC-MS / MS específicas e específicas foram feitas usando a urina 9 , 10 , 11 . No entanto, eles ficaram completamente menos seletivos, confiáveis ​​ou eficientes para uso clínico. A eficácia da SPE predominante utilizando o cartucho de fase reversa tradicional (tipo C18) como limpeza de amostra para a análise de 3-NT foi questionada e uma SPE seqüencial de troca de catiões forte (SCX) e fase inversa C18-OH foi proposta 6 , 7 , 19 . Um método recentemente desenvolvido de LC-MS / MS utilizou um processo de purificação em múltiplos passos de C18 SPE manual, cromatografia líquida preparativa de alta pressão (HPLC) e SPE online para análise de 3-NT 23 . Embora este método tenha sido suficientemente sensível para fins clínicos, com um LLOQ de 0,041 nM, o processo de limpeza foi intensivo e tedioso e requiVermelho 3 mL de urina, limitando sua viabilidade para alto débito. Um polímero de impressão molecular foi empregado como soro de SPE para melhorar a eficiência do processo de limpeza 14 , mas o LLOQ resultante (0,7 μg / mL) não foi suficientemente baixo para espécimes clínicos. Outro método requeru LC-MS / MS bidimensional (2D) e cromatografia de imunoafinidade para limpeza de amostras para atingir um limite de detecção (LOD) de 0,022 nM 24 . Embora todos esses métodos tenham feito avanços na avaliação do 3-NT, nenhum deles alcançou a sensibilidade, confiabilidade e eficiência necessárias para aplicações clínicas. Para investigar a patologia do 3-NT livre e seu papel como biomarcador do estresse oxidativo em contextos clínicos, desenvolvemos uma metodologia simples, eficiente, precisa e precisa, possibilitando aplicações clínicas de alto rendimento 25 . Um extrato de catião em modo misto miniaturizadoHange (MCX) foi implementada uma microplaca de extração de 96 poços para obter uma limpeza simples e eficaz da amostra e o enriquecimento de 3-NT em uma única extração, ignorando as desvantagens observadas nos métodos existentes que requerem derivação, evaporação e 2D-LC. A cromatografia líquida com 0,02% de HCOOH como aditivo em fase móvel ofereceu uma resposta de sinal melhorada com um tempo de ciclo rápido. A selectividade foi ainda melhorado através da aplicação de uma solução de eluição leve NH4OAc por eluição selectiva do 3-NT, e utilização de transição MRM para ambos um grupo 3-NT e do padrão interno (IS). O efeito de matriz foi compensada pela utilização de uma quantidade reduzida de um isotópica preferido 13 marcado com C é para quantificação. Com o advento desta metodologia, pesquisadores e clínicos poderão verificar o papel do 3-NT em condições clínicas e explorar ainda mais o impacto do estresse oxidativo.

<table><tbody><tr><td>3-Nitro-L-tirosina</td><td>Sigma</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitro-L-tirosina-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td><td></td></tr><tr><td>Massa Spec Gold Urine</td><td>Golden West Biologicals</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 96-well &micro; Placa de eluição</td><td>Waters</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de coleta de 2 mL 96 poços</td><td>Phenomenex&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 processador positivo</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV água</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico para espectrometria de massa</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de amônio</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP colunas de propil</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>Entre em contato com o fabricante para mais detalhes</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>Entre em contato com a fabricação para mais detalhes</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td><td>/</td><td>Creatinina Urinária Jaff&eacute; Método Gen 2</td></tr><tr><td>Certificado LCMS Frasco de gargalo de rosca de 12 x 32 mm Waters</td><td></td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Certificado LCGC Frasco de recuperação total de gargalo de rosca de 12 x 32 mm</td><td>Waters</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de transporte de 5 mL</td><td>Phenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Crystalgen&nbsp;</td>Pipeta eletrônica eLine <td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de microfuga <td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS balance&nbsp; &nbsp;</td><td>Kennedy Scales, inc.</td><td>Misturador Vortex 735</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bernstead Thermolyne</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

integração da extração de fase sólida miniaturizada e detecção de lc-ms / ms de 3-nitrotirosina em urina humana para aplicações clínicas

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

A 3-nitrotirosina livre (3-NT) foi amplamente utilizada como um possível biomarcador para o estresse oxidativo. Aumento dos níveis de 3-NT foram relatados em uma ampla variedade de condições patológicas. No entanto, os métodos existentes não possuem a sensibilidade e / ou a especificidade necessárias para medir o nível endógeno baixo de 3-NT de forma confiável e são demasiado pesados ​​para aplicações clínicas. Por isso, a melhoria analítica é urgentemente necessária para quantificar com precisão os níveis de 3-NT e verificar o papel do 3-NT em condições patológicas. Este protocolo apresenta o desenvolvimento de uma nova cromatografia líquida de espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS), combinada com uma extração em fase sólida miniaturizada (SPE) para a medição rápida e precisa de 3-NT na urina humana como biomarcador não-invasivo Para o estresse oxidativo. A SPE usando uma placa de 96 poços marcadamente simplificou o processo combinando a limpeza de amostras e o enriquecimento de analitos sem etapas de derivação e evaporação tediosas, Reduzindo o consumo de solventes, eliminação de resíduos, risco de contaminação e tempo total de processamento. O emprego de acetato de amónio 25 mM (NH 4 OAc) a pH 9 como a solução de eluição SPE aumentou substancialmente a selectividade. A resposta do sinal de espectrometria de massa foi melhorada através do ajuste das transições de monitoramento de reação múltipla (MRM). O uso de 0,02% de HCOOH como aditivo em uma coluna de pentafluorofenilo (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) melhorou a resposta do sinal outro 2,5 vezes e reduziu o tempo total de execução para 7 min. Foi alcançado um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM), representando uma significativa melhora da sensibilidade em relação aos ensaios relatados. Este método simplificado, rápido, seletivo e sensível permite que duas placas de amostras de urina (n = 192) sejam processadas em um período de 24 h. Considerando o desempenho analítico marcadamente melhorado e a amostragem de urina não invasiva e econômica, o ensaio proposto é benéfico para clínicas pré-clínicas e clínicasEstudos.

A Figura 1 ilustra que o 3-NT está completamente separado por cromatografia de outros análogos de tirosina estruturalmente semelhantes sob a condição de LC otimizada, o que elimina as interferências de co-eluição devido a estes compostos vastamente excessivos e conseqüentemente aumenta o grau de seletividade do ensaio. Além disso, a eluição com gradiente com 0,02% de HCOOH como aditivo em MA e metanol a um caudal de 0,45 mL / min permite a eluição rápida de ...

Foi desenvolvido um método de espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida seletiva e sensível (LC-MS / MS) acoplado com uma extração de fase sólida eficiente em uma microplaca de 96 poços de troca de catiões (MCX) de modo misto para a medição de 3-nitrotirosina livre ( 3-NT) em urina humana com alto débito, que é adequado para aplicações clínicas.

Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

O objetivo geral desta extração em fase sólida miniaturizada combinada com ensaio por LC-MS/MS é quantificar com precisão a 3-nitrotirosina livre na urina humana para aplicações clínicas. A 3-nitrotirosina livre auxilia nos rendimentos e atua como biomarcador de estresse oxidativo. No entanto, continuará sendo um desafio especial quantificar com precisão a 3-nitrotirosina em emergências biológicas para aplicações clínicas devido à sensibilidade e seletividade insuficientes, além de preparações de amostra trabalhosas.Essa técnica, que incorpora uma extração em fase sólida eficaz em uma interação LC-MS/MS altamente sensível, permite a determinação rápida, específica e precisa de baixos níveis de 3-nitrotirosina endógena na urina humana, sem necessidade de constituição ou cromatografia líquida bidimensional. Embora este método possa fornecer informações sobre a investigação do estresse oxidativo, ele também pode ser aplicado a outras condições patológicas, como distúrbios inflamatórios complexos e neurodegenerativos. As implicações dessa técnica podem ser estendidas para o monitoramento da eficácia do tratamento com antioxidantes, pois o nível de 3-nitrotirosina pode ser reduzido por

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Chemistry

Química

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Um protocolo rápido para digestão proteolítica com um microrreator tríptico de fluxo interno acoplado a um espectrômetro de massa de ionização por eletrospray (ESI) é apresentado. A fabricação do microrreator, a configuração experimental e o processo de aquisição de dados são descritos.

Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

Apresentamos um método para detectar modificações químicas 3-nitrotyrosine de proteínas atmosféricas com 6 rodadas de mm de diâmetro, cortadas de pré-filtros de amostrador de ar com um alto desempenho detector de eletroquímica-cromatografia líquido (HPLC-ECD).

Deteção de 3-Nitrotyrosine em ambientes atmosféricos através de alta performance sistema Detector eletroquímico-cromatografia líquida

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

Aprenda a quantificar 3-nitrotirosina livre em urina humana usando extração em fase sólida miniaturizada e LC-MS/MS. Este método sensível e seletivo é ideal para aplicações clínicas e pesquisa de estresse oxidativo.

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Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

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