Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

O objetivo geral desta extração em fase sólida miniaturizada combinada com ensaio por LC-MS/MS é quantificar com precisão a 3-nitrotirosina livre na urina humana para aplicações clínicas. A 3-nitrotirosina livre auxilia nos rendimentos e atua como biomarcador de estresse oxidativo. No entanto, continuará sendo um desafio especial quantificar com precisão a 3-nitrotirosina em emergências biológicas para aplicações clínicas devido à sensibilidade e seletividade insuficientes, além de preparações de amostra trabalhosas.

Essa técnica, que incorpora uma extração em fase sólida eficaz em uma interação LC-MS/MS altamente sensível, permite a determinação rápida, específica e precisa de baixos níveis de 3-nitrotirosina endógena na urina humana, sem necessidade de constituição ou cromatografia líquida bidimensional. Embora este método possa fornecer informações sobre a investigação do estresse oxidativo, ele também pode ser aplicado a outras condições patológicas, como distúrbios inflamatórios complexos e neurodegenerativos. As implicações dessa técnica podem ser estendidas para o monitoramento da eficácia do tratamento com antioxidantes, pois o nível de 3-nitrotirosina pode ser reduzido por antioxidantes. Para iniciar este procedimento, agite em vórtex amostras de urina previamente preparadas e descongeladas, padrões e amostras de controle de qualidade.

Após agitação em vórtex, adicione 250 microlitros de cada amostra e padrão a 32 poços de uma placa de coleta limpa de 96 poços com volume de 2 mililitros. Adicione 50 microlitros da solução de trabalho do padrão interno previamente preparada a cada poço, exceto ao poço da amostra em branco duplo. Em seguida, adicione 50 microlitros de água grau LC-MS contendo 0,01% de ácido fórmico ao poço da amostra em branco duplo.

Em seguida, adicione 250 microlitros de água grau LC-MS com 0,1% de ácido fórmico aos poços. Então, misture as soluções três vezes com uma pipeta de oito canais e cubra a placa até a carga na SPE. A seguir, posicione uma microplaca de extração de 96 poços com troca catiônica de modo misto e um reservatório de coleta em um processador de pressão positiva.

A extração em fase sólida utilizando uma microplaca de troca catiônica de modo misto permite o tratamento simultâneo da amostra e o enriquecimento de 3-nitroтирosina em uma única extração. Condicione a placa de extração passando 200 microlitros de metanol grau LC-MS através do sorvente. Gire o botão de ajuste de pressão no processador de pressão positiva para estabelecer uma pressão positiva baixa, permitindo que a mistura flua lentamente através do sorvente, ajustando a pressão conforme necessário.

Equilibre passando 200 microlitros de água grau LC-MS com 2% de ácido fórmico através do sorvente. Usando uma pipeta de oito canais, carregue cuidadosamente todo o volume de cada amostra pré-misturada na placa de extração condicionada. Aplique pressão positiva baixa no processador de pressão positiva para permitir que a mistura passe lentamente pelo sorvente, ajustando a pressão conforme necessário.

Em seguida, lave os poços passando 200 microlitros de água grau LC-MS com 2% de ácido fórmico através do sorvente. Após a lavagem com 200 microlitros de metanol e água, configure o processador de pressão positiva na pressão alta para secar os poços. Uma vez secos os poços, substitua o reservatório por uma placa de coleta limpa de 96 poços com capacidade de dois mililitros.

Agora, aplique 50 microlitros de uma solução de acetato de amônio 25 milimolar para eluir lentamente o analito retido e o padrão interno da placa de extração. Em seguida, adicione 50 microlitros de água grau LC-MS com 5% de ácido fórmico para neutralizar o eluente. A utilização de uma solução leve de acetato de amônio para a eluição da 3-nitrotirosina proporciona uma sensibilidade e seletividade substancialmente aprimoradas.

Emulsifique as amostras com uma pipeta de oito canais três vezes, em preparação para a análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem. Após configurar o instrumento LC-MS/MS, equilibre o método de 3-nitro-tirosina por LC-MS/MS por 10 minutos com a eluição em gradiente de LC. Ao equilibrar o método, o gradiente de LC será equilibrado até o início da eluição em gradiente.

A temperatura do amostrador automático será ajustada para quatro graus Celsius e a temperatura do forno será ajustada para 30 graus Celsius. Crie uma lista de amostras que inclua as amostras de urina, os padrões e as amostras de controle de qualidade. Em seguida, inicie a análise injetando as amostras preparadas.

Após concluir todas as injeções, estabeleça uma curva padrão com uma faixa de 10 a 2.500 picogramas por mililitro para a quantificação de 3-nitro-tirosina por meio da regressão linear da razão entre a área dos picos de 3-nitro-tirosina e o padrão interno versus a concentração nominal de 3-nitro-tirosina. Por fim, quantifique todas as demais amostras utilizando a curva padrão estabelecida e verifique se as amostras de controle de qualidade (QC) estão dentro da faixa determinada. Os dados de CL mostram que, em amostras de urina humana, a 3-nitro-tirosina é separada cromatograficamente de outros análogos estruturais semelhantes à tirosina sob condições otimizadas, o que elimina interferências por coeluição devido a esses compostos amplamente excessivos e, consequentemente, aumenta o grau de seletividade do ensaio.

Não é observado um sinal de 3-nitrotirosina no cromatograma de monitoramento de reações múltiplas da amostra duplo branco, indicando que a 3-nitrotirosina não é formada durante todo o processo. São apresentados aqui cromatogramas representativos de monitoramento de reações múltiplas da 3-nitrotirosina e do padrão interno de um indivíduo saudável. Nenhum sinal interferente foi observado nos tempos de retenção da 3-nitrotirosina e do padrão interno.

Uma curva padrão representativa é mostrada aqui. O limite de detecção, definido como a menor concentração com uma relação sinal/ruído maior que três, foi determinado como sendo dois picogramas por mililitro. O limite inferior de quantificação foi determinado como 10 picogramas por mililitro e é definido como a menor concentração com imprecisão e exatidão dentro de 20%, com uma relação sinal/ruído maior que 10.

O ensaio de integração otimizado oferece especificidade, sensibilidade e produtividade significativamente aprimoradas, com redução do efeito da matriz, do uso de sorvente e do descarte de resíduos. Com este ensaio simples e rápido, a amostra de urina pode ser processada em até 24 horas. Considere a coleta de urina não invasiva e de baixo custo.

Este método notavelmente aprimorado é muito adequado para avaliar o papel da 3-nitroтирosina como biomarcador de estresse oxidativo em estudos pré-clínicos e clínicos.