Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

O objetivo geral desta extração em fase sólida miniaturizada combinada com o ensaio LC-MS/MS é quantificar com precisão a 3-nitrotirosina livre na urina humana para aplicações clínicas. A 3-nitrotirosina livre ajuda na produtividade e é um biomarcador para o estresse oxidativo. No entanto, continuará sendo um desafio especial quantificar com precisão a 3-nitrotirosina em emergências biológicas para aplicações clínicas devido à sensibilidade insuficiente, seletividade e preparações de amostras complicadas.

Esta técnica que incorpora uma extração de fase sólida eficaz em uma interação LC-MS/MS altamente sensível permite a determinação rápida, específica e precisa de baixos níveis de 3-nitrotirosina endógena na urina humana sem a necessidade de constituição e LC bidimensional. As implicações dessa técnica podem ser estendidas para monitorar a eficácia do tratamento antioxidante, porque o nível de 3-nitrotirosina pode ser reduzido por antioxidantes. Para iniciar este procedimento, o vórtice preparou e descongelou previamente amostras de urina, padrões e amostras de controle de qualidade.

Após o vórtice, adicione 250 microlitros de cada amostra e padrão a 32 poços de uma placa de coleta limpa de dois mililitros e 96 poços. Adicione 50 microlitros de solução de trabalho padrão interno previamente preparada a cada poço, exceto o poço de amostra em branco duplo. Em seguida, adicione 50 microlitros de água de grau LC-MS com 0,01% de ácido fórmico ao poço de amostra em branco duplo.

Em seguida, adicione 250 microlitros de água de grau LC-MS com 0,1% de ácido fórmico aos poços. Em seguida, misture as soluções três vezes com uma pipeta de oito canais e cubra a placa até o carregamento do SPE. Em seguida, coloque uma microplaca de extração de 96 poços de troca catiônica de modo misto e um reservatório de coleta em um processador de pressão positiva.

A extração em fase sólida utilizando uma microplaca de troca catiônica de modo misto permite a limpeza simultânea da amostra e o enriquecimento de 3-nitrotirosina em uma única extração. Condicione a placa de extração fluindo 200 microlitros de metanol de grau LC-MS através do sorvente. Gire o botão de ajuste de pressão no processador de pressão positiva para definir uma pressão positiva baixa para permitir que a mistura flua lentamente pelo sorvente, ajustando a pressão se necessário.

Equilibre fluindo 200 microlitros de água de grau LC-MS com 2% de ácido fórmico através do sorvente. Usando uma pipeta de oito canais, carregue cuidadosamente todo o volume de cada uma das amostras pré-misturadas na placa de extração pré-condicionada. Defina uma pressão positiva baixa no processador de pressão positiva para permitir que a mistura flua lentamente através do sorvente, ajustando a pressão conforme necessário.

Em seguida, lave os poços fluindo 200 microlitros de água de grau LC-MS com 2% de ácido fórmico através do sorvente. Após a lavagem com 200 microlitros de metanol e água, coloque o processador de pressão positiva em alta pressão para secar os poços. Quando os poços estiverem secos, substitua o reservatório por uma placa coletora limpa de dois mililitros e 96 poços.

Agora, aplique 50 microlitros de uma solução de acetato de amônio 25 milimolar para eluir lentamente o analito retido e o padrão interno da placa de extração. Em seguida, adicione 50 microlitros de água de grau LC-MS com 5% de ácido fórmico para neutralizar o eluente. A aplicação de uma solução suave de acetato de amônio para eluição de 3-nitrotirosina fornece seletividade e sensibilidade substancialmente aprimoradas.

Misture as amostras com uma pipeta de oito canais três vezes em preparação para a análise de espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida. Depois de configurar o instrumento LC-MS/MS, equilibre o método LC-MS/MS de 3-nitrotirosina por 10 minutos com a eluição de gradiente LC. Ao equilibrar o método, o gradiente LC será equilibrado para a eluição inicial do gradiente.

A temperatura do amostrador automático será ajustada para quatro graus Celsius e a temperatura do forno será ajustada para 30 graus Celsius. Crie uma lista de lotes que inclua as amostras de urina, padrões e amostras de CQ. Em seguida, inicie o lote injetando as amostras preparadas.

Depois de completar todas as injeções, estabeleça uma curva padrão com uma faixa de 10 a 2.500 picogramas por mililitro para quantificação de 3-nitrotirosina por regressão linear da razão da área de pico de 3-nitrotirosina e padrão interno versus a concentração nominal de 3-nitrotirosina. Finalmente, quantifique todas as outras amostras usando a curva padrão estabelecida e determine se as amostras de CQ estão dentro da faixa estabelecida. Os dados de LC de amostras de urina humana mostram que a 3-nitrotirosina é separada cromatograficamente de outros análogos de tirosina estruturalmente semelhantes sob a condição otimizada que elimina as interferências co-eluidoras devido a esses compostos amplamente excessivos e, consequentemente, aumenta o grau de seletividade do ensaio.

Um sinal de 3-nitrotirosina não é observado no cromatograma de monitoramento de reação múltipla da amostra em branco duplo, indicando que a 3-nitrotirosina não é formada durante todo o processo. Cromatogramas representativos de monitoramento de reações múltiplas de 3-nitrotirosina e padrão interno para um indivíduo saudável são mostrados aqui. Nenhum sinal de interferência foi observado nos tempos de retenção da 3-nitrotirosina e do padrão interno.

Uma curva padrão representativa é mostrada aqui. O limite de detecção definido como a concentração mais baixa com uma relação sinal-ruído superior a três foi determinado em dois picogramas por mililitro. O limite inferior de quantificação foi determinado em 10 picogramas por mililitro e é definido como a concentração mais baixa dentro de 20% de imprecisão e exatidão com uma relação sinal-ruído superior a 10.

O ensaio de integração ajustado oferece especificidade, sensibilidade e rendimento significativamente aprimorados com efeito de matriz reduzido, uso de adsorvente e descarte de resíduos. Com este ensaio simples e rápido, a amostra de urina pode ser processada em 24 horas. Leve em consideração a amostragem de urina não invasiva e barata.

Este método notavelmente aprimorado é adequado para avaliar o papel da 3-nitrotirosina como um biomarcador de estresse oxidativo em estudos pré-clínicos e clínicos.