Name: Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar metabólitos do triptofano via cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em culturas de células cancerosas. Este método validado auxilia pesquisadores a obter dados confiáveis sobre a via das quinureninas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela União Europeia do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional Desenvolvimento da Polônia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), pela Faculdade de Biotecnologia e Ciências Ambientais da Universidade Católica John Paul II de Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciências Poloneses, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Pesquisadora-Princípio).  Os autores agradecem ao Prof. Agnieszka Ścibior, do Laboratório de Estresse Oxidativo, Centro de Pesquisa Interdisciplinar, JPII CUL por compartilhar os equipamentos para cultivo celular e quantificação de proteínas.

1. Preparação das soluções de estoque padrão 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard
<ol><li>Pesar os reagentes em um frasco com a maior precisão (0,3 mg cada). Para melhor precisão, dimensione os reagentes, ajustando o volume do solvente de acordo com a etapa 1.2.</li>
	<li>Dissolver os reagentes em 300 μL do solvente para obter uma solução de estoque de 1 g/L. Dissolver 3NT em 1% (v/v) ácido fórmico (FA) na água; Kyn, 3HAA e XA em sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HKyn em água acidificada para pH 2.5 com ácido clorídrico (HCl). ATENÇÃO: 3HAA irrita olhos, nariz, garganta e pulmões. É prejudicial quando inalado, em contato com a pele, e se engolido. Use proteção apropriada, ou seja, luvas e máscara.</li>
	<li>Feche bem o frasco e coloque-o em um banho ultrassônico por 1 minuto para acelerar a dissolução. NOTA: Armazene as soluções de estoque a -20 °C e minimize o congelamento/degelo (3 ciclos no máximo) devido à instabilidade das soluções de estoque.</li>
</ol>2. Preparação do meio de cultura tratada com carvão
<ol><li>Em um tubo, pese 280 mg de carvão ativado e adicione 5 mL do meio líquido preparado para a cultura das células de interesse.</li>
	<li>Agite o tubo com o médio e o carvão em um see saw rocker por 2h, em temperatura ambiente (velocidade definida para 50 oscilações/min). Em seguida, centrifugar os tubos a 6000 x g por 15 min.</li>
	<li>Remova o tubo da centrífuga e colete cuidadosamente o supernatante sem perturbar o sedimento. Repita a centrifugação, se necessário, para remover todos os resíduos de carvão.</li>
	<li>Filtre o supernatante usando um filtro de seringa de 0,45 μm.</li>
	<li>Certifique-se de que o meio de cultura pré-tratada de carvão seja privado de traços de kynurenines executando uma amostra piloto em LC-MS, conforme descrito na etapa 6.3.2. Caso contrário, repita as etapas 2.1-2.4. NOTA: Se o meio de cultura completo inicialmente não contiver kynurenines, a etapa de purificação usando carvão pode ser omitida. Neste caso, prepare padrões de calibração e amostras de controle de qualidade utilizando o meio completo geralmente preparado para cultivo celular.</li>
	<li>Armazene o meio preparado a 4 °C até a análise.</li>
</ol>3. Fazendo as soluções de calibração e curvas de calibração
<ol><li>Espetar o meio de cultura pré-tratada de carvão com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e adicionar quatro padrões (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) pelo menos em seis concentrações diferentes para cobrir as faixas de calibração. Mantenha bem o volume final de cada amostra em 150 μL. Vortex. Use tubos de centrífugas de 1,5 mL para preparação da amostra. NOTA: Pontos de calibração sugeridos para 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1.12, 2.23, 4,46 μmol/L; para Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; para 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; para XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.</li>
	<li>Adicione 150 μL de metanol frio (mantido a -20 °C) contendo 1% (v/v) ácido fórmico em cada tubo para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e o vórtice.</li>
	<li>Incubar as amostras a -20 °C por 40 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Remova os tubos da centrífuga. Colete supernantes nos novos tubos. Não perturbe o sedimento.</li>
	<li>Transfira 270 μL do supernante para o frasco de vidro usando uma pipeta automática. Coloque os frascos no evaporador e evapore suavemente até secar. Use o programa apropriado para frações de água/metanol para evaporar componentes voláteis. Não aplique temperatura superior a 40 °C e evite a secagem excessiva. NOTA: Frascos de vidro de fundo plano, ou seja, frascos cromatográficos facilitam evaporação mais rápida e recuperações mais altas em comparação com tubos cônicos plásticos.</li>
	<li>Depois de 30 min, verifique o estado de evaporação. Se necessário, continue evaporando (por exemplo, adicione 10 min extras). Evite a secagem excessiva.</li>
	<li>Remova os frascos do evaporador. Reconstituir cada amostra em 60 μL de ácido fórmico (v/v) na água. Adicione o solvente no frasco que contém o material residual. Feche bem os frascos e o vórtice.</li>
	<li>Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mL e gire a 14.000 x g por 15 min a 4 °C para separar a proteína precipitada.</li>
	<li>Sem perturbar a pelota de proteína, transfira os supernantes em frascos cromatográficos com pastilhas cônicas de vidro com uma pipeta automática. Feche bem os frascos.</li>
	<li>Verifique se há presença de bolhas de ar no frasco de inserção e remova-as se necessário (por exemplo, por vórtice).</li>
	<li>Transfira os frascos cromatográficos contendo amostras para o autosampler LC. Registo a posição das amostras colocadas em uma bandeja de autosampler.</li>
</ol>4. Preparação de amostras de controle de qualidade (QC)
<ol><li>Espetar o meio de cultura pré-tratamento de carvão (preparado em um tubo centrífugo de 1,5 ml) com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e padrões de quatro kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) em uma concentração selecionada da faixa linear das curvas de calibração. Mantenha o volume final da amostra em 150 μL. NOTA: Se for o caso, prepare várias amostras de QC em diferentes concentrações que caem sob a faixa linear da curva de calibração.</li>
	<li>Siga o protocolo descrito na seção 3 (etapas 3.2-3.11).</li>
</ol>5. Configuração do sistema LC-MS
<ol><li>Preparar os solventes de fase móvel: Solvente A: formato de amônio de 20 mmol/L em água ultrauso (pH 4.3 ajustado com ácido fórmico); Solvente B: 100% acetonitrila. NOTA: Use apenas garrafas de vidro borossilicato. Enxágüe garrafas com água ultrauso antes de reabaste farpá-la. Não use garrafas limpas com detergentes. ATENÇÃO: A acetonitrila causa graves efeitos na saúde ou morte. É facilmente inflamado pelo calor. Líquido de acetonitrila e vapor podem irritar olhos, nariz, garganta e pulmões.<ol>
<li>Prepare 5 soluçãos de estoque mol/L de formato de amônio dissolvendo um reagente cristalino (15,77 g) em 50 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro. Mexa até que todos os resíduos se dissolvam. Filtre através da membrana de 0,45 μm para remover quaisquer detritos residuais (por exemplo, usando um filtro de seringa de nylon). Armazene a solução de estoque a 4 °C.</li>
		<li>Prepare o Solvente A adicionando 4 mL de 5 formatos de amônio mol/L na água até 980 mL de água ultrauso em uma garrafa de vidro âmbar e mexa bem. Mergulhe uma barra de agitação e coloque a garrafa com o solvente em um agitador magnético. Mergulhe um eletrodo pH na solução e controle o pH em agitação. Adicionar solução de estoque de ácido fórmico (98%-100%) dropwise usando uma pipeta automática com ponta de 0,2 mL para obter pH 4.3, ajuste o volume até 1 L com água ultrauso e mexa bem. NOTA: Prepare os solventes pelo menos uma vez por semana para evitar qualquer crescimento microbiano. ATENÇÃO: O ácido fórmico (FA) é tóxico quando inalado, causa queimaduras na pele e danos oculares. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco.</li>
		<li>Filtre todas as soluções através da membrana de 0,22 μm (por exemplo, filtro de seringa de nylon) para remover quaisquer detritos residuais. Opcionalmente, use os filtros de entrada de solventes dedicados aos reservatórios de solventes LC para proteger o sistema contra partículas de entrada.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicie o software de controle e aquisição de dados LC-MS.</li>
	<li>Purgue o sistema LC com a fase móvel para remover bolhas e para preparar todos os canais de solvente.</li>
	<li>Ensemble uma coluna de guarda para proteger a coluna analítica de entupimento.</li>
	<li>Lave a coluna de proteção e analítica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) com acetonitrilo de 100% por cerca de 30 min e, em seguida, com 100% de solvente A até que se observe uma pressão estável na coluna. Controle o desempenho do sistema usando o software de controle.</li>
	<li>Defina os parâmetros LC apropriados no software de aquisição de dados.<ol>
<li>Configurar o programa de gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.</li>
		<li>Defina a taxa de fluxo de fase móvel em 0,15 mL/min, o tempo total de execução da análise por 45 minutos, a temperatura da coluna a +40 °C e o volume de injeção a 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Defina os parâmetros de aquisição do detector de espectrometria de massa.<ol>
<li>Aplicar parâmetros de ionização: monitoramento de íons únicos (SIM), ionização positiva, pressão nebulizadora de 50 psi, +350 °C de temperatura do gás seco, fluxo de gás seco de 12 L/min e tensão capilar de 5500 V.</li>
		<li>Selecione os íons de monitoramento de analitos: para 3HKyn m/z 225.0 (período de varredura: 2-6 min, tensão fragmentor: 100 V); para Kyn m/z 209.0 (período de varredura: 6-12 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3HAA m/z 154,0 (período de varredura: 12-18 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3NT m/z 227,0 (período de varredura: 18-23 min, tensão fragmentor: 100 V); para XA m/z 206,0 (período de varredura: 23-45 min, tensão fragmentor: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>Construa uma lista de trabalho e execute amostras no sistema LC.</li>
	<li>Inicialmente, antes da análise das amostras experimentais, execute uma amostra em branco (Solvente A) pelo menos em triplicados, seguida por uma amostra de QC.</li>
	<li>Abra o software de análise de dados e carregue os resultados obtidos para a amostra de QC.</li>
	<li>Verifique a posição dos picos de analito no cromatograma. Quando os sinais mudam além da posição esperada, ajuste os portões de tempo para coleta adequada de sinais analitos. Consulte o manual de software para instruções sobre integração de sinal.</li>
</ol>6. Construindo a curva de calibração
<ol><li>No software de aquisição de dados, adicione padrões de calibração na lista de trabalho e execute os padrões em triplicados.</li>
	<li>Integre e meça a área de pico correspondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA no tempo de retenção de cerca de 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, respectivamente.</li>
	<li>Construa curvas de calibração individuais para cada metabólito usando um programa de planilha.<ol>
<li>Para criar o gráfico de calibração, plote o valor para uma razão de área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT versus a concentração do analito.</li>
		<li>Analise a amostra em branco (meio de cultura pré-tratada de carvão e apenas com 3NT) para garantir que não haja vestígios dos analitos estudados no meio. Caso contrário, subtraia o valor obtido de cada ponto de calibração.</li>
		<li>Verifique a linearidade de cada curva de calibração.<ol>
<li>Individualmente, para cada analito, crie uma equação linear de interceptação de inclinação (y = ax +b), onde y corresponde à razão da área de pico de analito versus área de pico de 3NT, a é a inclinação, x é a concentração de analito (μmol/L), e b refere-se à interceptação da curva. Traçar o gráfico 'y' versus 'x' gerará a curva de calibração.</li>
			<li>Adicione uma linha de tendência linear ao gráfico, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico. Certifique-se de que o coeficiente de regressão é > 0,990. Em caso de padrões de calibração incompatíveis, prepare-os e/ou analise-os mais uma vez. Opcionalmente, altere a faixa de concentração da curva de calibração.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analise as amostras de QC para verificar o desempenho do sistema antes de analisar as amostras experimentais. Em caso de incompatibilidade (± desvio de 20% do valor de referência), prepare as novas curvas de calibração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Cultura celular in vitro e coleta de amostras para análise
<ol><li>Placa das células cancerígenas estudadas (MDA-MB-231 ou SK-OV-3) em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contendo 4,5 g/L de glicose, 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), 2 mmol/L e 1 U penicilina/estreptomicina e cultura a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO2 para expandi-los para o experimento. Passagem das células em 80% de confluência.</li>
	<li>Desprender células do prato de cultura usando trippsina, semente para o experimento em placas de 12 poços a uma densidade de 0,3 × 106 células por poço e colocar em uma incubadora durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, aspire o meio de cultura e adicione DMEM fresco com ou sem a adição dos compostos estudados, dependendo do desenho experimental.</li>
	<li>Após 48 h, colete o meio de cima das células (cerca de 500 μL) em um tubo de 1,5 mL. Centrífuga a 14.000 x g por 5 min para remover qualquer detrito celular. Colete o supernatante e armazene a -80 °C até a análise.</li>
	<li>Salve a pelota celular do passo 7.4 para estimativa de proteína. Congele as amostras a -20 °C. NOTA: Os resultados obtidos para um meio de diferentes poços devem ser normalizados ao conteúdo proteico total para explicar a variabilidade do número celular em poços individuais. A concentração proteica pode ser avaliada conforme descrito na etapa 9.</li>
</ol>8. Prepare amostras para análise de LC-MS
<ol><li>Descongele a amostra congelada à temperatura ambiente e misture bem. Transfira 149,25 μL do meio de cultura para um tubo de centrifugação (1,5 mL).</li>
	<li>Adicione 0,75 μL de 0,1 g/L de solução 3NT (padrão interno). Feche bem os tubos e vórtices.</li>
	<li>Adicione 150 μL de metanol refrigerado a -20 °C contendo 1% (v/v) FA para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e vórtices.</li>
	<li>Continue com a preparação da amostra conforme descrito na seção 3 (etapas 3.3-3.11). NOTA: Algumas células cancerígenas como SK-OV-3 secretam grandes quantidades de Kyn em um meio cultural. Para encaixar os dados em uma faixa linear da curva de calibração, é necessária aproximadamente 100 vezes a diluição da amostra. Neste caso, diluir uma porção da amostra com 0,1% (v/v) FA na água e analisar, além da amostra não diluída. As amostras de referência das normas para a curva de calibração devem ser preparadas em meio de cultura completa diluída 100 vezes. Alternativamente, adicione mais pontos na curva de calibração (se for possível a solubilidade e a linearidade adequadas) para ajustá-la ao nível de concentração de Kyn na amostra experimental.</li>
	<li>Analise as amostras por LC-MS conforme descrito na seção 5. Construa uma lista de trabalho e execute cada amostra em triplicado.</li>
	<li>Após a conclusão da lista de trabalho, meça a área de pico do analito.</li>
	<li>Gere uma planilha usando o software disponível e obter dados numéricos.</li>
	<li>Em uma coluna de planilha, calcule a razão da área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT.</li>
	<li>Use uma equação de calibração linear individual dedicada para cada analito (a partir da etapa 6.3.) para calcular as concentrações de analitos presentes nas amostras experimentais.</li>
</ol>9. Avaliação do conteúdo proteico e da normalização dos dados
<ol><li>Resuspende a pelota celular a partir da etapa 7.5 com 100 μL de soro fisco tamponado de fosfato (PBS) em tubo de 1,5 mL. NOTA: Prepare a solução PBS dissolvendo 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de fosfato de sódio dibasic, fosfato de dihidrogênio de potássio em 950 mL de água ultrapura. Mexa bem. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico (dropwise). Ajuste o volume até 1 L com água ultrapura. Mexa bem até ficar homogêneo. ATENÇÃO: O ácido clorídrico é altamente corrosivo e deve ser manuseado com precauções de segurança adequadas. O contato com a pele humana pode causar vermelhidão, dor, queimaduras na pele. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco.</li>
	<li>Congele as amostras a -20 °C e descongele no gelo. Repita esta etapa 3x.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Colete os supernantes nos novos tubos. Não perturbe a pelota.</li>
	<li>Diluir os supernantes 10x com PBS.</li>
	<li>Construa uma curva de calibração de 0 a 2 μg da proteína por faixa de poço.<ol>
<li>Prepare a solução padrão de albumina de soro bovino (BSA) para a calibração. Dissolva 1,23 μg de BSA em 1 mL de água ultrauso e bem vórtice.</li>
		<li>Em uma placa de 96 poços, carregue diferentes quantidades de solução padrão BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.</li>
		<li>Encha o poço com PBS até o volume final de 50 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carga 10 - 15 μL de lise celular a partir da etapa 9.4 na mesma placa de 96 poços. Encha os poços com PBS para chegar ao volume final de 50 μL. NOTA: Se necessário, ajuste o volume da alíquota de lisato celular em cada poço para caber na faixa linear da curva de calibração. Mantenha o volume final a 50 μL da amostra por poço.</li>
	<li>Adicione 200 μL de um reagente Bradford (diluído 5 vezes com água ultrauso) a cada poço.</li>
	<li>Incubar o patê de 96 poços por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. Insira a placa em um leitor de microplacão. Medir a absorvância em λ = 595 nm.</li>
	<li>Construa uma curva de calibração usando um programa de planilha. Plote a quantidade BSA (μg) versus absorvância. Adicione uma linha de tendência linear, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico.</li>
	<li>Use a equação linear (y = ax +b, onde y corresponde à absorvância em λ = 595 nm, a é a inclinação, x é um teor proteico (μg), e b refere-se à interceptação curva) para calcular a quantidade de proteína na amostra. NOTA: Considere um fator de diluição amostral nos cálculos.</li>
	<li>Use o teor de proteína estimado para normalizar a quantidade de kynurenina na amostra por 1 mg de proteína. Para isso, divida a concentração de kynurenines determinada na etapa 8.9 com o teor total de proteínas da etapa 9.10.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDO1%3A+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li>
<li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li>
<li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+and+human+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li>
<li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans%3A+Disease+and+healthy+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain%3A+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li>
<li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2%2B+increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li>
<li>Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Hydroxykynurenine%3A+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li>
<li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).</li>
<li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li>
<li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine-2%2C3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li>
<li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li>
<li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites%2C+tryptophan%2C+monoamines+and+neopterin+in+plasma%2C+cerebrospinal+fluid+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li>
<li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li>
<li>Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan%2C+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+Life+Science%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li>
<li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li>
<li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li>
<li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li>
<li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).</li>
<li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan%2C+kynurenine%2C+kynurenic+acid%2C+and+quinolinic+acid+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li>
<li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+LC-MS%2FMS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li>
<li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum%2C+urine%2C+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li>
<li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li>
<li>Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li>
<li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li>
<li>Houée-Lévin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine%3A+An+update+on+mechanisms+of+formation%2C+advances+in+analysis+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2%2C+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416(2009).</li>
<li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine+2%2C3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins%2C+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo apresenta um protocolo LC-SQ detalhado para a quantificação simultânea de quatro principais metabólitos Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que são medidos em um meio a partir de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas. Atenção especial é dada à preparação da amostra, procedimento de espectrometria cromatográfica/de massa e interpretação dos dados, os pontos mais importantes dentro da análise.
Em geral, a análise da LC-MS, devido à alta sensibilidade, requer os mais altos ...

O caminho de kynurenine (KP) é a principal rota do catabolismo triptofano (Trp) em células humanas. Indoleamina-2,3-dioxygenase (IDO-1) em células extrahêspticas é a primeira enzima limitante de KP e converte Trp em N-formylkynurenine1. Outros passos dentro do KP geram outros metabólitos secundários, ou seja, kynurenines que exibem várias propriedades biológicas. Kynurenine (Kyn) é o primeiro catabólito Trp estável que mostra propriedades tóxicas e regula eventos celulares após a ligação ao receptor de hidrocarbonetos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn é transformado em várias moléculas espontaneamente ou nos processos mediados por enzimas, gerando metabólitos como 3-hidroxikynurenine (3HKyn), ácido antoraniano (AA), ácido 3-hidroxyanthranilic (3-HAA), ácido kynurênico (Kyna) e ácido xanturênico (XA). Outro metabólito a jusante, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdeído (ACMS), sofre ciclização não enzimática para ácido quinolínico (QA) ou ácido picolínico (PA)1. Finalmente, a QA é ainda transformada em dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD+)3, o metabólito de ponto final KP que é um importante cofator de enzimas. Algumas kynurenines têm propriedades neuroprotetoras como Kyna e PA, enquanto as outras, ou seja, 3HAA e 3HKyn, são tóxicas4. O ácido xanthurenic, formado a partir de 3HKyn, apresenta propriedades antioxidantes e vasorelaxação5. XA se acumula em lentes de envelhecimento e leva à apoptose das células epiteliais6. KP, descrito em meados do séculoXX, ganhou mais atenção quando seu envolvimento em vários transtornos foi demonstrado. O aumento da atividade dessa rota metabólica e o acúmulo de algumas kynurenines modulam a resposta imune e estão associados a diferentes condições patológicas como depressão, esquizofrenia, encefalopatia, HIV, demência, esclerose lateral amiotrófica, malária, Alzheimer, doença de Huntington e câncer4,7. Algumas alterações no metabolismo Trp são observadas em microambientes tumorais e células cancerosas2,8. Além disso, as kynurenines são consideradas como marcadores promissores da doença9. Na pesquisa sobre câncer, os modelos de cultura in vitro são bem estabelecidos e amplamente utilizados para avaliação pré-clínica de respostas a medicamentos anticancerígenos10. Os metabólitos trp são secretados pelas células no meio da cultura e podem ser medidos para avaliar o status da via kynurenina. Portanto, é necessário desenvolver métodos apropriados para a detecção simultânea de tantos metabólitos KP quanto possível em uma variedade de espécimes biológicos com um protocolo fácil, flexível e confiável.
Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação simultânea de quatro metabólitos de via kynurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA pela LC-SQ em um meio pós-cultura coletado de células cancerosas. Em uma abordagem analítica moderna, a cromatografia líquida13,14,15,16 é preferida para a detecção e quantificação simultâneas dos catabólitos triptofanos individuais, em contraste com ensaios bioquímicos inespecíficos utilizando o reagente Ehrlich11,12. Atualmente, existem muitos métodos disponíveis para a determinação de kynurenines em espécimes humanos, principalmente baseados na cromatografia líquida com detectores de ultravioleta ou fluorescência13,17,18,19. A cromatografia líquida aliada a um detector de espectrometria de massa (LC-MS) parece mais adequada para este tipo de análise, devido à sua maior sensibilidade (limites mais baixos de detecção), seletividade e repetibilidade.
Metabólitos trp já foram determinados em soro humano, plasma e urina13,20,21,22,23, no entanto, os métodos para outros espécimes biológicos, como o meio de cultura celular também são desejados. Anteriormente, o LC-MS era utilizado para compostos derivados de TRP em um meio coletado após acultura de células de glioma humanos, monócitos, células dendríticas ou astrócitos tratados com gama de interferon (IFN-γ)24,25,26. Atualmente, há a necessidade de novos protocolos validados que possam permitir uma avaliação de vários metabólitos em diferentes mídias culturais, células e tratamentos usados em modelos de câncer.
O objetivo do método desenvolvido é quantificar (dentro de uma corrida analítica) quatro kynurenines principais que podem indicar anormalidades em KP. Apresentados aqui estão etapas críticas do nosso protocolo recentemente publicado para análise quantitativa lc-SQ de kynurenines significativas selecionadas usando um padrão interno (3-nitrotyrosina, 3NT) no meio coletado de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas 27. Para nosso melhor conhecimento, é o primeiro protocolo LC-SQ para quantificação simultânea de 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA em um meio de cultura obtido a partir das células cultivadas in vitro. Após algumas modificações, o método pode ser aplicado ainda mais para estudar as mudanças no metabolismo Trp em uma gama mais ampla de modelos de cultura celular.

<table><tbody><tr><td>3-hidroksy-DL-kynurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1771</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 3-hidroxiantranílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>148776</td><td>97%</td></tr> <tr><td>3-nitro-L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Supelco</td><td>1.00029</td><td>hipergrade para LC-MS LiChrosolv</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Supelco</td><td>05105</td><td>pó</td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna analítica</td><td>Agilent Technologies</td><td>959764-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus C18 resolução rápida HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &micro; m)</td></tr> <tr>Aditivo eluente <td>de formato de amônio</td><td>Supelco</td><td>7022</td><td>para LC-MS, LiChropur, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Albumina</td> de soro bovino <td>Sigma</td><td>1001887398</td><td></td></tr><tr><td>Caps para frascos cromatográficos</td><td>Agilent Technologies</td><td>5185-5820</td><td>tampas de rosca azul, PTFE / vermelho sil sepa</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Ninho</td><td>704004</td><td>poliestireno, não pirogênico, estéril</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td>12 poços, não pirogênico, não citóxico, estéril</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>HERAcell 150i</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modelo 5415R</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modelo 5428</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Bionovo</td><td>B-2278</td><td>Tipo Eppendorf, 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Bionovo</td><td>B-3693</td><td>Tipo Falcon, 50 mL, PP</td></tr><tr><td>Dados cromatográficos software de aquisição e análise</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td></tr><tr><td>Frascos de inserção cromatográfica</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-1387</td><td>100 &micro; L</td></tr><tr><td>Frascos cromatográficos</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0714</td><td>2 mL, vidro transparente</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Supelco</td><td>1.02950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Dubelcco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41450</td><td></td></tr><tr><td>Medidor duplo pH/condutividade</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>SevenMulti</td></tr><tr><td>Evaporator</td><td>Genevac</td><td></td><td>modelo EZ-2.3 Elite</td></tr><tr><td>Fetal soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Supelco</td><td>5.33002</td><td>para LC-MS LiChropur</td></tr><tr><td>Frasco de vidro para armazenamento de</td> <td>reagentesBionovo</td><td>S-2070</td><td>50 mL, coluna de proteção de vidro transparente</td></tr><tr><td>Agilent</td><td>Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Coluna de Proteção de Furo Estreito (2.1 x 12.5 mm, 5 &micro; m)</td></tr> <tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-quinurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K8625</td><td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Wigo</td><td></td><td>ES 21 H</td></tr><tr><td>Microbalança</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>modelo XP6</td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>ZRQSVPO30</td><td>Direct-Q 3 UV com bomba</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa quadrupolo</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1948B</td><td>modelo 6120</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Adrich</td><td>048M4874V</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Bio Tek</td><td></td><td>Synergy 2 operado por Gen5</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Merck</td><td>1.05108.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína Concentrado de reagente de corante</td><td>BioRad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Balancim de gangorra</td><td>Stuart</td><td>SSL4</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica</td><td>Nest</td><td>326001</td><td>5 mL, poliestireno, não pirogênico, estéril</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de entrada de solvente</td><td>Agilent Technologies</td><td>5041-2168</td><td>filtro de vidro, 20 &mu; m tamanho do poro</td></tr><tr><td>Reservatório de solvente (para LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6524</td><td>1 L, vidro transparente</td></tr><tr><td>Reservatório de solvente (para LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6526</td><td>1 L, vidro âmbar</td></tr><tr><td>Programa de planilha</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>Barra de agitação</td><td>Bionovo</td><td>6-2003</td><td>revestido de teflon</td></tr><tr><td>Filtros de seringa para cultura filtração média</td><td>Bionovo</td><td>7-8803</td><td>celulose regenerada, &Oslash; 30 mm, 0,45 &micro; m</td></tr><tr><td>Filtros de seringa para filtração de componentes de fase móvel</td><td>Bionovo</td><td>6-0018</td><td>nylon, &Oslash; 30 mm, 0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>96 poços, estéril</td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>T4049-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td><td>1200 O sistema Infinity consistia em amostrador automático (G1367D), desgaseificador (G1379B), bomba binária (G1312B), termostato de coluna (G1316C)</td></tr><tr><td>Banho de ultrassom</td><td>Polsonic</td><td>104533</td><td>modelo 6D</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biosan</td><td></td><td>modelo V-1 mais</td></tr><tr><td>ácido xanturênico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td>96%</td></tr></tbody></table>

quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

O caminho da kynurenine e os catabólitos do triptofano chamados kynurenines têm recebido maior atenção por seu envolvimento na regulação imunológica e biologia do câncer. Um ensaio de cultura in vitro é frequentemente usado para aprender sobre a contribuição de diferentes catabólitos triptofanos em um mecanismo de doença e para testar estratégias terapêuticas. O meio de cultura celular rico em metabólitos secretos e moléculas de sinalização reflete o status do metabolismo triptofano e outros eventos celulares. Novos protocolos para a quantificação confiável de múltiplas kynureninas no complexo meio de cultura celular são desejados para permitir uma análise confiável e rápida de múltiplas amostras. Isso pode ser realizado com cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa. Esta poderosa técnica é empregada em muitos laboratórios clínicos e de pesquisa para quantificação de metabólitos e pode ser usada para medir kynurenines.
Apresentado aqui é o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa quadrupole única (LC-SQ) para a determinação simultânea de quatro kynurenines, ou seja, kynurenine, 3-hidroxikynurenine, 3-hidroxyanthranilic, e ácido xanturnic no meio coletado de células cancerígenas in vitro cultivadas. O detector SQ é simples de usar e menos caro em comparação com outros espectrômetros de massa. Na análise SQ-MS, vários íons da amostra são gerados e separados de acordo com sua relação massa-carga específica(m/z),seguida pela detecção usando um modo de Monitoramento de Íons Únicos (SIM).
Este artigo chama a atenção sobre as vantagens do método relatado e indica alguns pontos fracos. É focado em elementos críticos da análise LC-SQ, incluindo preparação de amostras, juntamente com cromatografia e análise de espectrometria de massa. Também são discutidas as condições de controle de qualidade, as condições de calibração do método e os problemas de efeito matricial. Descrevemos uma simples aplicação de 3-nitrotyrosina como um padrão analógico para todos os analitos alvo. Como confirmado por experimentos com ovário humano e células cancerígenas de mama, o método LC-SQ proposto gera resultados confiáveis e pode ser ainda mais aplicado a outros modelos celulares in vitro.

A LC-MS apresenta vantagens indiscutíveis na quantificação de moléculas biologicamente ativas, embora alguns componentes de espécimes complexos causem os chamados efeitos matriciais e comprometam a ionização dos analitos. Leva à supressão de íons ou ao aprimoramento de íons, diminuindo fortemente a precisão e afetando um limite de detecção/quantificação de LC-MS, que é considerado como um ponto ''fraco' do método. Em nosso protocolo, os íons são gerados pela ionização eletrospray (ESI) no modo positivo, que também foi em...

Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

As quinureninas estão associadas à regulação da resposta imune em várias doenças, incluindo o câncer. Métodos confiáveis e validados para identificar múltiplas quinureninas auxiliam no desenvolvimento de terapias mais eficazes. Nosso protocolo usa cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa para identificar os diferentes metabólitos do triptofano gerados pela via da quinurenina em meio coletado de culturas de células cancerígenas.Usuários inexperientes podem ter alguma dificuldade durante as etapas de preparação da amostra ou aquisição e interpretação de dados. Seguindo nosso protocolo e recomendações, pode-se evitar erros e obter dados confiáveis. Para preparar soluções de estoque dos reagentes, pesar 0,3 miligramas de cada reagente em um frasco para obter a mais alta precisão e dissolver cada reagente em 300 microlitros do solvente apropriado para obter um grama por litro de soluções de estoque de cada reagente.Para preparar o meio de cultura tratado com carvão, pesar 280 miligramas de carvão ativado em um tubo cônico e adicionar cinco mililitros do meio líquido preparado para a cultura das células de interesse. Agite o tubo com o meio e o carvão em um balancim de gangorra por duas horas em temperatura ambiente e 50 oscilações por minuto. No final da incubação, sedimentar o carvão por centrifugação e coletar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o carvão, depois filtrar o meio usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.Para preparar a solução de calibração, coloque o meio de cultura tratado com carvão com 0,75 microlitros de 0,1 grama por litro de solução 3NT e adicione quinurenina 3-H, quinurenina 3-HAA e ácido xanturênico a pelo menos seis concentrações diferentes para cobrir todas as faixas de calibração até um volume final de 150 microlitros por amostra. Após o vórtice, adicione 150 microlitros de metanol frio de menos 20 graus Celsius suplementado com ácido fórmico a 1% a cada tubo para desproteinização da amostra e tampe e vortex firmemente os tubos novamente. Após uma incubação de 40 minutos a menos 20 graus Celsius, centrifugue as amostras e use uma pipeta automática para transferir 270 microlitros de cada sobrenadante para frascos de vidro de fundo plano individuais.Coloque os frascos em um evaporador e use o programa apropriado para frações de metanol de água para evaporar suavemente os componentes voláteis por cerca de 30 minutos. Quando os tubos estiverem secos, reconstitua cada amostra em 60 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em água e vortex as amostras antes de transferir cada solução para tubos individuais de 1,5 mililitro para centrifugação. Sem perturbar o sedimento, transferir os sobrenadantes para frascos cromatográficos com inserções de vidro cónicas e colocar os frascos num amostrador automático LC-MS.Antes de executar as amostras, purgue o sistema LC com a fase móvel para remover bolhas e preparar todos os canais de solvente. Em seguida, lave a proteção e a coluna analítica com 100% de acetonitrila por cerca de 30 minutos antes de lavar o sistema com 100% de solvente A até que uma pressão estável seja observada na coluna, em seguida, defina os parâmetros LC apropriados no software de aquisição de dados e construa uma lista de trabalho para executar as amostras no sistema LC. Para construir a curva de calibração, no software de aquisição de dados, adicione os padrões de calibração à lista de trabalho e execute os padrões em triplicatas, depois integre e meça a área do pico correspondente a 3-hidroxiquinurenina, quinurenina, ácido 3-hidroxiantranílico, 3-nitrotirosina e ácido xanturênico no tempo de retenção de cerca de 4,4, 10, 16, 21 e 30 minutos, respectivamente.Para coletar amostras sobrenadantes de uma cultura de células in vitro, após 48 horas de cultura celular padrão das células de interesse, transfira 500 microlitros de sobrenadante de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro e remova os detritos celulares por centrifugação, depois transfira os sobrenadantes médios para novos tubos para armazenamento de 80 graus Celsius negativos até a análise e mantenha os pellets celulares a 20 graus Celsius negativos até a análise de estimativa de proteína. Para preparar amostras para análise LC-MS, transfira 149,25 microlitros de cada amostra de meio de cultura descongelado para um novo tubo de 1,5 microlitro e adicione 0,75 microlitros de 0,1 grama por litro de solução 3NT a cada tubo. Depois de preparar as amostras conforme demonstrado, adicione 150 microlitros de metanol de menos 20 graus Celsius suplementado com ácido fórmico a 1% a cada tubo e prepare a amostra para análise LC-MS conforme demonstrado.Quando a lista de trabalho estiver completa, medir a área de pico de cada analito e utilizar uma equação de calibração linear individual dedicada a cada analito para calcular as concentrações dos analitos presentes em cada amostra experimental. Para avaliar o conteúdo de proteína celular correspondente à amostra de meio de cultura, ressuspenda cada pellet celular em 100 microlitros de PBS e congele as amostras a menos 20 graus Celsius por uma hora antes de descongelá-las no gelo. Após congelar e descongelar as amostras três vezes, coletar os lisados celulares por centrifugação e transferir os sobrenadantes para novos tubos sem perturbar os pellets.Diluir a amostra 10 vezes com PBS fresco e adicionar os volumes apropriados de solução-padrão de albumina de soro bovino em duplicado aos alvéolos apropriados de uma placa de 96 poços. Carregue de 10 a 15 microlitros de cada sobrenadante de amostra de lisado celular nos poços apropriados da placa de 96 poços e encha os poços padrão e de amostra até um volume final de 50 microlitros de PBS por poço. Em seguida, adicione 200 microlitros de um reagente Bradford diluído cinco vezes com água ultrapura em cada poço e incube a placa por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.No final da incubação, carregue a placa em um leitor de microplacas e meça a absorbância em 595 nanômetros, depois construa uma curva de calibração para permitir o cálculo da quantidade de proteína em cada amostra e divida a concentração de cada quinurenina pelo teor total de proteína para normalizar a quantidade de quinurenina em cada amostra por um micrograma de proteína. Aqui estão os resultados da espectrometria de massa quadrupolo único obtidos durante a análise de meio contendo 4,5 gramas por litro de D-glicose e 10% de soro bovino fetal. Observe o pequeno pico indicando a presença de quinurenina na amostra.Execute uma amostra de controle de qualidade antes de exigir que os dados reais da amostra confirmem os tempos de retenção apropriados dos analitos, pois uma mudança nos sinais de LC ou incompatibilidades podem ser observadas. Os componentes da matriz de coeluição podem gerar íons com a taxa de carga mestre selecionada para os analitos alvo. Por exemplo, nesta análise, o pico do composto desconhecido apareceu no período de varredura durante o qual a taxa de carga mestre do íon 206 foi monitorada.Devido à incompatibilidade do tempo de retenção, o sinal não correspondeu ao analito. Embora o isótopo de triptofano compartilhasse o mesmo íon que a razão de carga mestre 206, a análise cromatográfica revelou que o sinal de triptofano estava bem separado do sinal do ácido xanturênico, indicando que o nível de triptofano presente no meio de células cancerígenas testado não afetou a quantificação do ácido xanturênico. Esta análise do meio de cultura de dois tipos de linhagens de células cancerígenas demonstra que as células de câncer de mama epitelial humano avaliadas liberaram diferentes quantidades de metabólitos de triptofano, enquanto as células de câncer de ovário humano testadas produziram níveis significativamente mais altos de quinurenina.O uso de um padrão interno durante a preparação da amostra ajuda na aquisição confiável de dados. A normalização dos dados para o conteúdo de proteína corrige as variabilidades do número de células dentro de poços individuais. Nosso protocolo pode ser expandido para determinar analitos adicionais, mas pode se acumular no meio de cultura sob diferentes condições experimentais.

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo explica um método quantitativo de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo da adenosina e purinas associadas geradas pelo consumo de AMP em ambiente extracelular de células cancerígenas leucêmicas. O protocolo descreve um ensaio RP-HPLC sensível, específico, confiável e reprodutível, desenvolvido e validado para a quantificação de nucleotídeos e nucleosídeos de purina extracelular produzidos por células purificadas de leucemia...

Metabolismo de purinas extracelulares: um ensaio baseado em HPLC para medir a geração e o metabolismo de adenosina em células leucêmicas

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

O protocolo descrito aqui representa um método fácil e reprodutível que emprega cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo de purinas em células de leucemia linfocítica crônica (LLC) cultivadas em diferentes condições.

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

Alterações em metabólitos neuroativos Quinurenina caminho (KP) estão implicadas em doenças psiquiátricas. Investigar os resultados funcionais de um Quinurenina alterado via metabolismo na vivo em roedores pode ajudar a elucidar as novas abordagens terapêuticas. O protocolo atual combina abordagens bioquímicas e comportamentais para investigar o impacto de um desafio de Quinurenina aguda em ratos.

Uma medida de cromatografia líquida de alta performance da Quinurenina e ácido cinurênico: matéria bioquímica de cognição e sono em ratos

A finalidade deste artigo é descrever um protocolo para a extração de Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica, particular, a electroforese capilar-espectrometria maciça.

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Uma plataforma integrada da manipulação da pilha é desenvolvida para o uso conjuntamente com uma instalação de espectrometria maciça da único-ponta de prova para a análise em linha de pilhas individuais da suspensão circunstâncias ambientais.

Plataforma integrada da manipulação da pilha acoplada com a único-ponta de prova para a análise da espectrometria maciça das drogas e dos metabolitos em únicas pilhas da suspensão

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Aprenda a quantificar metabólitos do triptofano via cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em culturas de células cancerosas. Este método validado auxilia pesquisadores a obter dados confiáveis sobre a via das quinureninas.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas (Vídeo) | JoVE Journal

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

Explorar mais vídeos