Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

As quinureninas estão associadas à regulação da resposta imune em várias doenças, incluindo o câncer. Métodos confiáveis e validados para identificar múltiplas quinureninas auxiliam no desenvolvimento de terapias mais eficazes. Nosso protocolo usa cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa para identificar os diferentes metabólitos do triptofano gerados pela via da quinurenina em meio coletado de culturas de células cancerígenas.

Usuários inexperientes podem ter alguma dificuldade durante as etapas de preparação da amostra ou aquisição e interpretação de dados. Seguindo nosso protocolo e recomendações, pode-se evitar erros e obter dados confiáveis. Para preparar soluções de estoque dos reagentes, pesar 0,3 miligramas de cada reagente em um frasco para obter a mais alta precisão e dissolver cada reagente em 300 microlitros do solvente apropriado para obter um grama por litro de soluções de estoque de cada reagente.

Para preparar o meio de cultura tratado com carvão, pesar 280 miligramas de carvão ativado em um tubo cônico e adicionar cinco mililitros do meio líquido preparado para a cultura das células de interesse. Agite o tubo com o meio e o carvão em um balancim de gangorra por duas horas em temperatura ambiente e 50 oscilações por minuto. No final da incubação, sedimentar o carvão por centrifugação e coletar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o carvão, depois filtrar o meio usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.

Para preparar a solução de calibração, coloque o meio de cultura tratado com carvão com 0,75 microlitros de 0,1 grama por litro de solução 3NT e adicione quinurenina 3-H, quinurenina 3-HAA e ácido xanturênico a pelo menos seis concentrações diferentes para cobrir todas as faixas de calibração até um volume final de 150 microlitros por amostra. Após o vórtice, adicione 150 microlitros de metanol frio de menos 20 graus Celsius suplementado com ácido fórmico a 1% a cada tubo para desproteinização da amostra e tampe e vortex firmemente os tubos novamente. Após uma incubação de 40 minutos a menos 20 graus Celsius, centrifugue as amostras e use uma pipeta automática para transferir 270 microlitros de cada sobrenadante para frascos de vidro de fundo plano individuais.

Coloque os frascos em um evaporador e use o programa apropriado para frações de metanol de água para evaporar suavemente os componentes voláteis por cerca de 30 minutos. Quando os tubos estiverem secos, reconstitua cada amostra em 60 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em água e vortex as amostras antes de transferir cada solução para tubos individuais de 1,5 mililitro para centrifugação. Sem perturbar o sedimento, transferir os sobrenadantes para frascos cromatográficos com inserções de vidro cónicas e colocar os frascos num amostrador automático LC-MS.

Antes de executar as amostras, purgue o sistema LC com a fase móvel para remover bolhas e preparar todos os canais de solvente. Em seguida, lave a proteção e a coluna analítica com 100% de acetonitrila por cerca de 30 minutos antes de lavar o sistema com 100% de solvente A até que uma pressão estável seja observada na coluna, em seguida, defina os parâmetros LC apropriados no software de aquisição de dados e construa uma lista de trabalho para executar as amostras no sistema LC. Para construir a curva de calibração, no software de aquisição de dados, adicione os padrões de calibração à lista de trabalho e execute os padrões em triplicatas, depois integre e meça a área do pico correspondente a 3-hidroxiquinurenina, quinurenina, ácido 3-hidroxiantranílico, 3-nitrotirosina e ácido xanturênico no tempo de retenção de cerca de 4,4, 10, 16, 21 e 30 minutos, respectivamente.

Para coletar amostras sobrenadantes de uma cultura de células in vitro, após 48 horas de cultura celular padrão das células de interesse, transfira 500 microlitros de sobrenadante de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro e remova os detritos celulares por centrifugação, depois transfira os sobrenadantes médios para novos tubos para armazenamento de 80 graus Celsius negativos até a análise e mantenha os pellets celulares a 20 graus Celsius negativos até a análise de estimativa de proteína. Para preparar amostras para análise LC-MS, transfira 149,25 microlitros de cada amostra de meio de cultura descongelado para um novo tubo de 1,5 microlitro e adicione 0,75 microlitros de 0,1 grama por litro de solução 3NT a cada tubo. Depois de preparar as amostras conforme demonstrado, adicione 150 microlitros de metanol de menos 20 graus Celsius suplementado com ácido fórmico a 1% a cada tubo e prepare a amostra para análise LC-MS conforme demonstrado.

Quando a lista de trabalho estiver completa, medir a área de pico de cada analito e utilizar uma equação de calibração linear individual dedicada a cada analito para calcular as concentrações dos analitos presentes em cada amostra experimental. Para avaliar o conteúdo de proteína celular correspondente à amostra de meio de cultura, ressuspenda cada pellet celular em 100 microlitros de PBS e congele as amostras a menos 20 graus Celsius por uma hora antes de descongelá-las no gelo. Após congelar e descongelar as amostras três vezes, coletar os lisados celulares por centrifugação e transferir os sobrenadantes para novos tubos sem perturbar os pellets.

Diluir a amostra 10 vezes com PBS fresco e adicionar os volumes apropriados de solução-padrão de albumina de soro bovino em duplicado aos alvéolos apropriados de uma placa de 96 poços. Carregue de 10 a 15 microlitros de cada sobrenadante de amostra de lisado celular nos poços apropriados da placa de 96 poços e encha os poços padrão e de amostra até um volume final de 50 microlitros de PBS por poço. Em seguida, adicione 200 microlitros de um reagente Bradford diluído cinco vezes com água ultrapura em cada poço e incube a placa por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, carregue a placa em um leitor de microplacas e meça a absorbância em 595 nanômetros, depois construa uma curva de calibração para permitir o cálculo da quantidade de proteína em cada amostra e divida a concentração de cada quinurenina pelo teor total de proteína para normalizar a quantidade de quinurenina em cada amostra por um micrograma de proteína. Aqui estão os resultados da espectrometria de massa quadrupolo único obtidos durante a análise de meio contendo 4,5 gramas por litro de D-glicose e 10% de soro bovino fetal. Observe o pequeno pico indicando a presença de quinurenina na amostra.

Execute uma amostra de controle de qualidade antes de exigir que os dados reais da amostra confirmem os tempos de retenção apropriados dos analitos, pois uma mudança nos sinais de LC ou incompatibilidades podem ser observadas. Os componentes da matriz de coeluição podem gerar íons com a taxa de carga mestre selecionada para os analitos alvo. Por exemplo, nesta análise, o pico do composto desconhecido apareceu no período de varredura durante o qual a taxa de carga mestre do íon 206 foi monitorada.

Devido à incompatibilidade do tempo de retenção, o sinal não correspondeu ao analito. Embora o isótopo de triptofano compartilhasse o mesmo íon que a razão de carga mestre 206, a análise cromatográfica revelou que o sinal de triptofano estava bem separado do sinal do ácido xanturênico, indicando que o nível de triptofano presente no meio de células cancerígenas testado não afetou a quantificação do ácido xanturênico. Esta análise do meio de cultura de dois tipos de linhagens de células cancerígenas demonstra que as células de câncer de mama epitelial humano avaliadas liberaram diferentes quantidades de metabólitos de triptofano, enquanto as células de câncer de ovário humano testadas produziram níveis significativamente mais altos de quinurenina.

O uso de um padrão interno durante a preparação da amostra ajuda na aquisição confiável de dados. A normalização dos dados para o conteúdo de proteína corrige as variabilidades do número de células dentro de poços individuais. Nosso protocolo pode ser expandido para determinar analitos adicionais, mas pode se acumular no meio de cultura sob diferentes condições experimentais.