Name: Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Aprenda um método de extração em fase sólida com cromatografia líquida de alta pressão para análise de neurotransmissores catecolaminas e metabólitos em urina de lactentes. Esta técnica permite detectar biomarcadores como MHPG para diagnóstico precoce de lesões cerebrais.

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Este estudo foi suportado por nacional Science Foundation da China (No.81172720, n. º 81673230), o programa de investigação Social desenvolvimento de Jiangsu província ciência e departamento de tecnologia (n. º BE2016741), ciência & tecnologia projeto da China a administração geral de supervisão da qualidade, inspeção e quarentena (2015QK055), o programa de abrir projeto de laboratório chave de desenvolvimento infantil e aprendizagem das Ciências do Ministério da educação, Universidade do Sudeste (CDLS-2016-04). Sinceramente, reconhecemos canção Yuan e Ping Liu, que nos ajudaram na recolha de amostras.

Foi obtido consentimento dos pais, e aprovação do Conselho de revisão institucional foi obtida para o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o código de ética da associação médica mundial (declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. Cuidadores de todos os participantes fornecidos autorização por escrito para serem incluídos no estudo. Aprovação do Comitê de ética do Hospital de Zhongda, afiliado com a Universidade do sudeste, obteve-se também.
1. preparação das soluções necessárias para a extração e a determinação de catecolaminas e colunas
<ol><li>Prepare a coluna PFSPE. Divida 1-2 mg de nanofibras de PCE-PS em alíquotas de 5-6 e use uma haste de aço fina com 0,5 mm de diâmetro para comprimi-los ordenada na extremidade de uma ponta da pipeta com um volume de 200 µ l.</li>
	<li>Preparar a urina artificial por pesagem ureia 2,427 g 0,034 g de ácido úrico, creatinina de 0,09 g, citrato trissódico 0,297 g, 0,634 g de cloreto de sódio, 0,45 g de cloreto de potássio, 0,161 g de cloreto de amónio, 0,089 g de cloreto de cálcio dihidratado, 0,1 g de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,034 g de bicarbonato de sódio, oxalato de sódio 0,003 g, 0,258 g sulfato de sódio, fosfato de-hidrogenofosfato de sódio 0,1 g e hidrogenofosfato dissódico de 0,011 g e dissolver os produtos químicos acima em 200 mL água deionizada água.</li>
	<li>Prepare 2 mg/mL solução stock de diphenylborate (DPBA) solução dissolvendo-se 2 mg do composto em 1 mL de água destilada. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.</li>
	<li>
Padrão do analito Nota: A estrutura química e propriedades de catecolaminas são instáveis e facilmente decompor. O processo de preparação das normas tem que ser muito rápido e deve evitar a exposição à luz solar direta.<ol>
<li>Pese 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC e padrão interno 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL. Dilua a solução DHBA em água a 100 ng/mL antes da utilização.</li>
		<li>Oscila os padrões preparados no escuro em alta velocidade até analitos dissolvem completamente. Este é o estoque principal; armazenar a-20 ° C por até várias semanas.</li>
		<li>Prepare os 1.000 estoques secundária do analito ng/mL. Para NE, E, DA, DOPAC e MHPG, transferir 5 µ l de cada analito primário estoque para 4.975 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro a 4 ° C até o uso. Prepare estes diariamente novas soluções. Para DHBA, transferir 5 µ l de caldo primário para 4.995 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro separadamente a 4 ° C.</li>
		<li>Fazer mais diluições com o estoque de analito secundário para criar uma curva padrão (ex., complementar a tabela 2). Loja soluções no escuro a 4 ° C e preparar fresca diariamente.</li>
		<li>Teste a voltagem ideal do detector ECD usando o estoque padrão com concentração adequada. Varia a tensão para encontrar um valor onde os analitos tem a melhor aparência de pico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar o eluente contendo ácido fosfórico de 30%, 15% acetonitrila, e 55% de água destilada. Para 10 mL de solvente eluente, usar 5,5 mL de água destilada e adicione 1,5 mL de acetonitrilo e 3 mL de ácido fosfórico gota a gota na água.</li>
</ol>2. preparação de amostras de urina Real e fase móvel
<ol><li>Têm mães coletar a primeira urina da manhã de seus bebês usando copos de urina asséptica. Transferi as amostras em tubos de polipropileno e rótulo imediatamente. Em seguida, armazene as amostras no congelador-20 ° C.</li>
	<li>Vórtice e centrifugar as amostras urinárias a 1.510 x g durante 10 minutos a temperatura (RT) para livrar-se da maioria das partículas interferência. Descartar o sedimento e reunir os sobrenadantes para novas experiências. A fim de extrair analitos efetivamente, proceda à PFSPE pré-tratamento (etapa 3) imediatamente após a centrifugação.</li>
	<li>
Preparar a fase móvel
	<ol>
<li>Preparar um frasco limpo, pelo menos 1 L. A composição da fase móvel está listada na tabela complementar 1; para a fase móvel de 1 L, medida 6,7242 g de ácido cítrico, 93,06 mg de sal dissódico etileno diamina tetra acético (EDTA), de 7,02 g de ortofosfato de sódio monometallic, 404,5 mg de sal de sódio ácido 1-heptanesulfonic e 3,5 g de sódio hidratam de uma garrafa. Adicionar 40 mL acetonitrila e água destilada para 1.000 mL. Agitar e vibrar ultrassonicamente durante 15 min até que o problema na solução é tudo dissolvido.</li>
		<li>Usando um medidor de pH com um eletrodo de vidro, ajuste o valor de pH da fase móvel para 4.21 com uma solução saturada de hidróxido de sódio.</li>
		<li>Filtre a fase móvel com uma membrana de microporous fluoreto de polivinilideno 0,45 µm e um dispositivo de sucção de vácuo para se livrar de impurezas.</li>
		<li>Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PFSPE extração e análise HPLC
<ol><li>Ative as nanofibras. Pressione 100 µ l de metanol e 100 µ l de água sequencialmente através da coluna PFSPE usando uma seringa de 5 mL de forma lenta, gota a gota.</li>
	<li>Urina de Mix 100 µ l da amostra com solução DPBA 100 µ l 2 mg/ml e 30 µ l 100 ng/ml de solução DHBA (IS, padrão interno) em um tubo de 0,5 mL EP e, em seguida, transferir a solução mista para a coluna PFSPE. Pressione a solução mista amostra através da coluna PFSPE com uma seringa 5ml de plástico herméticos usando a força da pressão do ar.</li>
	<li>Lixiviar coluna três vezes carregando 100 µ l de solução DPBA (2 mg/mL) em coluna SPE e empurre a solução lentamente através do cartucho com uma pressão de ar, utilizando uma seringa de plástico herméticos de 5 mL.</li>
	<li>Carregar 50 µ l do eluente na coluna PFSPE e empurrá-lo através da coluna, recolhendo o eluído com um tubo de 0,5 mL EP.</li>
	<li>Ligue o desgaseificador HLPC para desgaseificar o ar no sistema. Antes da análise da amostra, o sistema deve executar para mais de 0,5 h com a fase móvel para equilibrar e reduzir o ruído da linha de base. Ver tabela complementar 1 mostrando os parâmetros de configuração do sistema de HPLC.</li>
	<li>20 µ l do eluato usando um amostrador automático da amostra e depois injetá-lo no sistema de HPLC-ECD.</li>
	<li>Quando as pistas estiverem completas, desliga o celular detector usando a interface do detector. Não desligue o celular com o interruptor na parte traseira do detector, como isso poderia danificar o instrumento.</li>
	<li>Altere manualmente a composição da fase móvel, 10% de metanol e 90% de água. Executado pelo menos 30 min. Em seguida, altere manualmente a fase móvel para metanol grau HPLC. Executado por cerca de 15 min proteger o sistema em metanol. Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos para a coluna e o detector. Desligue o fluxo e, em seguida, desligue o desgaseificador.</li>
</ol>4. Phenylboronic ácido extração de cartuchos (PBA)
Procedimentos de extração de cartucho PBA foram semelhantes ao regime em Kumar et al. (2011) 25. todas as soluções são empurradas através do cartucho PBA (100 mg, 1 mL) com ar forçado por uma seringa.
<ol><li>Condição do cartucho com 1 mL 80: 20 acetonitrila-água (v/v) contendo 1% de ácido fórmico e 1 mL de tampão fosfato de 50mm (pH 10) sequencialmente.</li>
	<li>Pressione a amostra de urina no buffer (tampão de fosfato de urina e 2 mL de 1 mL, pH 8,5) através do cartucho do PBA.</li>
	<li>Lave o cartucho com 1 mL 50: 50 v/v acetonitrilo-fosfato (10 mM, pH 8,5).</li>
	<li>Eluir o cartucho com 1 mL de acetonitrila-água (80: 20 v/v) contendo 1% de ácido fórmico.</li>
</ol>5. identificação e quantificação de catecolaminas
<ol><li>
Linearidade
	<ol>
<li>Diluir o estoque de analitos secundário com urina artificial de seis concentrações (1.5, 3, 12, 25, 50 e 100 ng/mL); o volume de diluição da urina artificial segue suplementares tabela 2. Fazer três amostras paralelas com cada concentração para obter 18 analito experimental soluções para a construção de curvas de calibração.</li>
		<li>Dilua o estoque secundário de DHBA com urina artificial 10-fold para obter a solução experimental de 100 ng/mL.</li>
		<li>Pré-tratamento todas as soluções de analito de 5.1.1, de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE). Como na etapa 3, Injecte 20 µ l de cada eluído correspondente no sistema HPLC-ECD para obter uma cromatograma HPLC.</li>
		<li>Construir as curvas de calibração das substâncias a cinco analisar plotando a relação da área do pico (metas/IS) como eixo Y contra a relação de concentrações (metas/IS) como o eixo X, conforme mostrado na Figura complementar 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LOD e LOQ valor para sensibilidade
	<ol>
<li>Injecte 20 µ l de urina artificial em branco no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3), para obter o cromatograma HPLC da amostra.</li>
		<li>No cromatograma da 5.2.1, coletar os 11 valores de sinal em branco e calcular o valor médio Xb e o desvio-padrão Sb. Calcular o mínimo sinal de uma substância que pode ser detectada em um determinado nível de confiança, X,L, como XL = Xb+ K * Sb (K é o coeficiente determinado pelo nível de confiança, Sb reflete o nível de ruído a método de medição e o nível de ruído da máquina). Assim, LOD = (a XLX -b) / s = (K * Sb) /S (S significa o valor da inclinação da curva de trabalho).</li>
		<li>Defina um número de 3:1 (K = 3) como o limite de detecção (LOD) e um S/N de 10:1 (K = 10) como o limite de quantificação (LOQ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avaliar as recuperações
	<ol>
<li>Prepare as amostras de urina real e cravado. Diluir o estoque de analitos secundário com urina real de três concentrações (5, 50, 100 ng/mL) para obter as amostras de urina cravado. Prepare três amostras paralelas para cada solução de analito. Conte a concentração cravada como a quantidade de compostos cravado em amostra de urina. Defina esse valor como ums.</li>
		<li>Estoque DHBA diluído para 100 ng/mL, como na etapa 5.1.2.</li>
		<li>Processar cada solução de amostra de 5.3.1 de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE) e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade de compostos quantificados na amostra de urina cravado. Defina esse valor como umt.</li>
		<li>Injecte 20 µ l de amostra de urina no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3) para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade inicial de compostos quantificados na amostra de urina. Defina esse valor como umeu.</li>
		<li>Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Estima-se a percentagem de recuperação como metodológico recuperação % = (umt - Aeu) × 100 / (s). Valores médios são mostrados na tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avaliar a imprecisão
	<ol>
<li>Prepare amostras de urina artificial cravado de 5, 50 e 100 ng/mL concentrações como na etapa 5.3.1. Prepare-se seis amostras paralelas para cada solução de analito. Prepare amostras experimentais frescas todos os dias.</li>
		<li>Dilua o estoque DHBA de 100 ng/mL como na etapa 5.1.2.</li>
		<li>Avaliar a precisão intradia (n = 6). Processar cada solução de amostra em 5.4.1 de acordo com a etapa 3 e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o cromatograma. Fazer a mesma operação seis vezes no mesmo dia.</li>
		<li>Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Sob a mesma concentração do mesmo composto, o desvio-padrão relativo (RSD) dos seis ensaios em um dia é determinado como precisão intradia. Valores médios são mostrados na tabela 1.</li>
		<li>Avaliar a precisão inter dia (n = 6). Ao mesmo tempo todos os dias nos seis dias sequenciais, preparar amostras de urina artificial cravado para três concentrações de 5, 50, 100 ng/mL, como em 5.4.1 e 5.4.2. e processar cada analito solução da amostra de acordo com a etapa 3.</li>
		<li>Injecte a 20 µ l de cada correspondente eluato de 5.4.5 no sistema HPLC-ECD para obter resultados de cromatograma cada dia. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Dia Interamericano de precisão é expresso o RSD da quantidade das amostras urina artificial cravado nas três concentrações de ensaios em seis dias sequenciais. Valores médios são mostrados na tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores certificam que não há nenhum conflito de interesses com qualquer organização financeira sobre o material discutido neste artigo.

O método PFSPE proposto neste trabalho pode ser significativo e significativo no que diz respeito a sua rapidez, simplicidade e conveniência. Os adsorventes usados no protocolo são electrospun de nanofibras, que têm altos superfície rácios de área e o volume e adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada. O procedimento só precisa de alguns miligramas de nanofibras e um pequeno volume de solvente eluente e não requer uma etapa de evaporação para concentrar os analitos. Aqui, apresentamos uma visão geral detalha...

Os neurotransmissores catecolaminas e seus conteúdos metabolito em fluidos corporais podem afetar a função neural e afetam o equilíbrio dos Estados de estímulo-resposta-à uma extensão grande1. Abnormities pode causar uma variedade de doenças, tais como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e distúrbios neurológicos1,2. A extração e a determinação de catecolaminas em fluidos corporais é significativo para o diagnóstico das doenças relevantes. No entanto, catecolaminas em amostras biológicas existem em baixas concentrações e são facilmente oxidadas. Além disso, eles são muito difíceis de eluir devido à grande quantidade de interferência no médio3. Assim, a deteção simultânea de catecolaminas em fluidos biológicos ainda é um desafio.
Tem havido comentários mostrando que catecolaminas urinárias podem ser uma medida de stress, e que seus níveis são importantes marcadores biológicos respondendo à estimulação tátil processamento em recém-nascidos5. De acordo com a pesquisa, todas as crianças que sofreram de incidentes prematuros correm risco de lesão de cérebro a4,5,6, e lesão pode causar anormal liberação de catecolaminas e assuntos afins para os fluidos. Existem técnicas avançadas de ressonância magnética que podem detectar danos cerebrais em anteriores fases7,8. No entanto, dentro as primeiras 48 horas, um processo de desenvolvimento neurológico anormal causará danos cerebrais permanentes que não será evidente em imagens médicas11. Além disso, os recursos de alto custo e escassos instrumento, juntamente com outros fatores, torna impossível para todas as unidades neonatais ter acesso a estas técnicas especializadas de neuro-imagem. No entanto, o uso de um biomarcador facilmente acessível e prático (como catecolaminas e seus metabólitos) poderia superar estas deficiências, e a seleção de um biomarcador em fluidos humano pode ajudar no diagnóstico precoce de lesão cerebral e levar a solicitar identificação dos infantes recém-nascidos necessitam de neuroproteção9. As catecolaminas na urina podem ser um índice de fácil e óbvio, devido a correlação direta entre a quantidade deles lançado em fluidos e neuroactivity função.
Entre os fluidos biológicos, líquido cerebrospinal (CSF) e amostras de plasma não são fáceis de obter através de procedimentos traumáticos existentes, e também é muito difícil se livrar de interferência devido a proteína adesiva e outras impurezas, levando a uma incômoda e processo de amostragem demorada que é inadequado para a deteção repetida. Além disso, para as crianças, é quase impossível conseguir as amostras de forma traumática. Portanto, a amostragem urinária é melhor do que as outras formas de amostragem, como é não-invasivo, fácil de operar e pode ser feito repetidamente. Amostras de urina são abundantes e fáceis de armazenar e mostrar grandes vantagens sobre as outras formas de amostras biológicas.
Os principais métodos para quantificar as catecolaminas em fluidos biológicos incluem ensaios de radioenzymic10, ensaios imune-adsorvente enzima-lig11, voltametria12 e lente térmica espectrometria13. Mas existem deficiências, tais como operações complicadas e difíceis de detectar alvos múltiplos. Hoje, a técnica de análise dominante é a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)14, juntamente com o sensível eletroquímica15 ou fluorimétrica deteção16, devido à sua alta sensibilidade e seletividade de boa. Com a tecnologia de espectrometria de massa em tandem, tais como cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) e espectrometria de massa cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS/MS), a análise e quantificação dos neurotransmissores podem alcançar alto precisão e especificidade17,18. No entanto, a técnica requer instrumentação cara, bem como mão de obra qualificada substancialmente, dificultando o método a aplicar-se universalmente em laboratórios mais convencionais. Sistemas de HPLC-ECD são comumente equipados em laboratórios clínicos e mais convencionais e tornaram-se assim uma escolha comum e bom para grupos de pesquisa a ser usado para determinação de química, mas eles exigem a amostra introduzida no sistema para ser limpo e de microescala volume19. Assim, é de grande importância para purificar e condensar a amostra antes da análise. O método clássico para a etapa de purificação é extração líquido-líquido14,15,20 e off-line extração de fase sólida, incluindo alumina ativada coluna21,22 e diphenylborate (DPBA) complexação23,24,25,26.
Myeongho Lee et al . Tenho vindo a utilizar resina de polímero quimicamente modificada com éter de coroa como o adsorvente para extrair seletivamente catecolaminas de urina humana desde 200727. Além disso, em 2006, que Haibo et al. demonstrou uma abordagem de síntese facile para boronate afinidade extração adsorvente byutilizing um nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricas poliédrico (POSS) composto de nanomagnetic com base e aplicando-a para o enriquecimento de catecolaminas em urina humana (noradrenalina, adrenalina e isoproterenol)28. Eles também aproveitaram os nanomateriais para cumprir o trabalho, usando uma tecnologia chamada nano-eletrofiação e formando o material fibroso de polímero em nanoescala. O processo de eletrofiação pode ajustar o diâmetro, morfologia e alinhamento espacial do produto, controlando a tensão de funcionamento e alterando o conteúdo da solução de fiação, juntamente com outros parâmetros,29. Comparado com o cartucho convencional do SPE, electrospun Nanofibras são altamente apropriadas extrair e enriquecer os analitos de destino de uma matriz complexa, como são equipados com elevados rácios de superfície-área-volume para adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada, e apresentam mais facilmente controlado superfície químicas Propriedades, permitindo que o apego à mão dos compostos alvo. Estas propriedades fazem-lhes boas escolhas para adsorventes SPE, reduzindo a fase sólida e a dessorção solvente quantidade30,31,de32,33. Para catecolaminas em amostras de urina, electrospun nanofibras compostas de éter de coroa apolymeric com poliestireno (PCE-PS) foram usadas para extrair seletivamente três catecolaminas (NE, E e DA)34. O jornal indicou que o éter de coroa seletiva adsorvido os destinos do NE, E e DA, que foi baseada na sua geometria correta para a vinculação de catecolaminas através de formando ligações de hidrogênio. Os resultados exibidos o éter coroa material efetivamente, remoção de outros compostos interferentes contidos em amostras biológicas. Inspirado por este relatório, um novo método foi desenvolvido para a extração seletiva das catecolaminas pelo uso de electrospun de nanofibras composto composto do PCE-PS.
Neste trabalho, o método relatado anteriormente34 foi melhorado e empregados não só para analisar com êxito E, NE e o pai, mas também seus metabolitos, MHPG e DOPAC, na urina. Podemos também explorar novas possibilidades para o mecanismo do processo de adsorção. O método mostra satisfatória eficiência de extração e seletividade para os cinco analitos, e o método foi verificado na análise da urina de bebês de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis.

<table><tbody><tr><td>200 &micro; L</td> coluna de ponta <td></td><td></td> de pipeta <td>para conter nanofibras</td></tr><tr><td>Material de nanofibras</td><td></td><td></td> PCE-PS para haste de aço de <td>extração PFSPE</td></tr><tr><td>(cerca de 0,5 mm de diâmetro)</td><td></td><td></td> <td>encha as nanofibras na seringa</td></tr><tr><td>de plástico à prova de gás da coluna (5 ml)</td><td></td><td></td> <td>comprima a solução na extremidade da ponta</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>éster 2-aminoetílico do ácido difenilborínico (DPBA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>reagente complexo</td></tr><tr><td>norepinefrina (NE)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>analito</td></tr><tr><td>3-metoxi-4-hidroxifenilglicol (MHPG)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>analito</td></tr><tr><td>epinefrina (E)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>analito</td></tr><tr><td>3, 4- Ácido dihidroxifenilacético (DOPAC)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>analito</td></tr><tr><td>dopamina (DA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H-8502</td><td>analito</td></tr><tr><td>3, bromidrato de 4-dihidroxibenzilamina (DHBA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>rótulo interior</td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>ácido</td></tr> <tr><td></td><td>fosfórico de fase eluriante e móvelSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7664-38-2</td><td></td></tr><tr><td>ácido úrico</td> elúrico <td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>69-93-2</td><td>creatinina artificial na urina</td></tr><tr><td></td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>60-27-5</td><td></td></tr><tr><td>citrato trissódico</td> de urina artificial <td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>6132-04-3</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd</td><td>7447-40-7</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>12125-02-9</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>SWC0140326</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>62-76-0</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7757-82-6</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico</td> artificial <td>na urina Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10039-32-4</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>na</td> urina <td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>57-13-6</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-14-5</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10034-99-8</td><td>artificial urina</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10035-04-8</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>urina artificial</td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>77-92-9</td><td>urina artificial e fase móvel</td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>34124-14-6</td><td>fase móvel</td></tr><tr><td>ortofosfato de sódio monometálico</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7558-80-7</td><td>urina artificial e fase móvel</td></tr><tr><td>1-heptanossulfônico sal de sódio</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>22767-50-6</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio</td> em fase móvel <td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>1310-73-2</td> coluna de <td></td></tr><tr><td>ácido fenilborônico de fase móvel (coluna PBA)</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>extração de PBA</td></tr><tr><td>inerte&reg; ODS-3 5 &micro; m 4.6&times; coluna de 150 milímetros</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>coluna da HPLC para a</td></tr><tr><td>proeminência da separação SHIMADZU SIL-20AC AUTO SAMPLER</td><td>Shimadzu Corporation, Japão</td><td>Injeção automática de SIL-20AC</td> para <td></td></tr><tr><td>a cromatografia líquida eluriant do elevado desempenho de SHIMADZU LC-20AD</td><td>Shimadzu Corporation, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector eletroquímico da bomba SHIMADZU L-ECD-60A da HPLC de SHIMADZU L-ECD-60A</td><td>, Japão</td><td>Detector L-ECD-60A</td><td>para os analitos</td></tr><tr><td>ASAP 2020 Sistema de Área de Superfície Acelerada e Porosimetria</td><td>Micromeritics, analisador de</td><td>superfície e porosidade dos EUA</td><td></td>&nbsp;</tr></tbody></table>

um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

A extração e a análise dos neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da função do sistema nervoso e doenças relacionadas, mas sua medida precisa ainda é um desafio. Muitos protocolos têm sido descritos para medição do neurotransmissor por uma variedade de instrumentos, incluindo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). No entanto, existem deficiências, tais como a operação complicada ou difícil de detectar alvos múltiplos, que não podem ser evitados, e atualmente, a técnica de análise dominante é ainda HPLC acoplado com sensível eletroquímico ou detecção de fluorimétrica, devido a sua sensibilidade elevada e boa seletividade. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o pré-tratamento e a detecção de catecolaminas com cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) em amostras de urina real dos lactentes, usando electrospun de nanofibras composto composto de éter de coroa poliméricas de poliestireno como adsorvente, também conhecido como o método de extração (PFSPE) embalado-fibra de fase sólida. Mostramos como urina amostras podem ser facilmente precleaned por uma coluna de fase sólida nanofibras-embalados, e como os analitos na amostra podem ser rapidamente enriquecidos, em estudo dessorvida e detectado em um sistema ECD. PFSPE simplifica os procedimentos de pré-tratamento de amostras biológicas, permitindo a diminuição do tempo gasto e redução da perda de alvos.
Em geral, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a extração de fase sólida acoplada a um sistema de HPLC-ECD para determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e dois de seus metabólitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e ácido 3,4-diidroxi-fenilacético (DOPAC)) na urina dos bebês. O protocolo estabelecido foi aplicado para avaliar as diferenças de catecolaminas urinárias e seus metabolitos entre lactentes de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis. Análise comparativa revelou uma diferença significativa entre os dois grupos, indicando que os metabólitos de catecolaminas podem ser um marcador de candidato importante para o diagnóstico precoce dos casos em risco de danos cerebrais em crianças em MHPG urinário.

Este protocolo é um método PFSPE simples e conveniente para pré-tratamento de amostras de urina e enriquecer cinco catecolaminas para a deteção através de um sistema de HPLC-ECD; um diagrama do processo é mostrado na Figura 1. O protocolo inclui principalmente quatro etapas-ativando, carregamento, lavagem e farmacológicos - juntamente com uma pequena quantidade de nanofibras de PCE-PS e um dispositivo simples extração de fase sólida. A morfologia de nanofibra...

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar três neurotransmissores monoamina e dois de seus metabólitos na urina do bebê simultaneamente por meio de uma conveniente extração em fase sólida acoplada à cromatografia líquida de alta pressão com detecção eletroquímica. Este método pode prever e determinar compostos alvo instáveis em uma amostra completa com fácil operação em um curto espaço de tempo. Seus exemplos podem ser facilmente pré-limpos por um quorum estreito de face sólida repleta de fibras, e os analitos na amostra podem ser prontamente enriquecidos, dissolvidos e detectados em um sistema de detecção eletroquímica.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que a extração e análise de neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é fundamental para avaliar a função resistente e as doenças relacionadas. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a exposição à luz deve ser evitada e o tempo de pré-tratamento deve ser o mais curto possível. Demonstrando o procedimento, temos Lanlan Wei e Qing Han, dois alunos de doutorado de nosso laboratório.Para começar, prepare dois miligramas por mililitro de solução estoque de solução DPBA d

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

Um método para a identificação de espécies de material botânico por análise directa em espectrometria de massa de alta resolução de tempo-real e análise estatística multivariada é apresentada.

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

Foi desenvolvido um método de espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida seletiva e sensível (LC-MS / MS) acoplado com uma extração de fase sólida eficiente em uma microplaca de 96 poços de troca de catiões (MCX) de modo misto para a medição de 3-nitrotirosina livre ( 3-NT) em urina humana com alto débito, que é adequado para aplicações clínicas.

Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Apresentamos um método para anotação e classificação rápida baseada em espectrometria de massa (MS) / espectrometria de massa (MS) de alcalóides tropanos, útil tanto para a desreplicação preliminar de amostras contendo tropano quanto para a descoberta de novos alcalóides para isolamento.

Aplicações da Espectrometria de Massa em Tandem por Cromatografia Líquida na Pesquisa de Produtos Naturais: Alcalóides Tropânicos como Estudo de Caso

Aprenda um método de extração em fase sólida com cromatografia líquida de alta pressão para análise de neurotransmissores catecolaminas e metabólitos em urina de lactentes. Esta técnica permite detectar biomarcadores como MHPG para diagnóstico precoce de lesões cerebrais.

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Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

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