Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

O objetivo geral deste procedimento é determinar três neurotransmissores monoamina e dois de seus metabólitos na urina do bebê simultaneamente por meio de uma conveniente extração em fase sólida acoplada à cromatografia líquida de alta pressão com detecção eletroquímica. Este método pode prever e determinar compostos alvo instáveis em uma amostra completa com fácil operação em um curto espaço de tempo. Seus exemplos podem ser facilmente pré-limpos por um quorum estreito de face sólida repleta de fibras, e os analitos na amostra podem ser prontamente enriquecidos, dissolvidos e detectados em um sistema de detecção eletroquímica.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que a extração e análise de neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é fundamental para avaliar a função resistente e as doenças relacionadas. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a exposição à luz deve ser evitada e o tempo de pré-tratamento deve ser o mais curto possível. Demonstrando o procedimento, temos Lanlan Wei e Qing Han, dois alunos de doutorado de nosso laboratório.

Para começar, prepare dois miligramas por mililitro de solução estoque de solução DPBA dissolvendo dois miligramas do composto em um mililitro de água destilada. Armazene a solução no escuro a quatro graus Celsius. Ao preparar os extensores de analitos, lembre-se de que a estrutura química e as propriedades das catecolaminas são instáveis e, como se decompõem facilmente, os extensores do processo de preparação devem ser muito rápidos e a exposição à luz solar fina deve ser evitada.

Pese 1,0 miligramas de norepinefrina, epinefrina, dopamina, MHPG, DOPAC e DHBA padrão interno em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro. Adicione 1,0 mililitros de água destilada para dissolver cada um dos compostos, exceto a epinefrina, que deve ser dissolvida em solução de ácido clorídrico 0,01 moles por litro. Oscilar os padrões preparados no escuro a alta velocidade até que os analitos se dissolvam completamente.

Esses são os estoques primários e podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius por várias semanas. Para preparar os estoques de analito secundário de norepinefrina, epinefrina, dopamina, DOPAC e MHPG, transfira cinco microlitros de cada estoque de analito primário para 4.975 microlitros de água destilada em tubos de centrífuga separados de cinco mililitros. Prepare essas soluções frescas diariamente e armazene-as no escuro a quatro graus Celsius até o uso.

Para DHBA, transfira cinco microlitros de estoque primário para 4.995 microlitros de água destilada em um tubo de centrífuga de cinco mililitros e armazene-o no escuro separadamente a quatro graus Celsius. Faça diluições adicionais com o estoque de analito secundário para criar uma curva padrão. Armazene as soluções no escuro a quatro graus Celsius e prepare-as diariamente.

Em seguida, teste a tensão ideal do detector ECD, usando a coronha padrão com a concentração adequada. Varie a tensão para encontrar um valor em que os analitos tenham a melhor aparência de pico. Para preparar 10 mililitros de solvente eluente, use 5,5 mililitros de água destilada e, em seguida, adicione 1,5 mililitros de acetonitrila e três mililitros de ácido fosfórico, gota a gota, na água.

Para preparar a fase móvel, meça os componentes listados no protocolo de texto em uma garrafa limpa de um litro. Adicione 40 mililitros de acetonitrila e água destilada a 1.000 mililitros. Agite e vibre por ultrassom por 15 minutos até que a matéria na solução esteja toda dissolvida.

Usando um medidor de pH com um eletrodo de vidro, ajuste o valor do pH da fase móvel para 4.21 com uma solução saturada de hidróxido de sódio. Filtre a fase móvel com uma membrana microporosa de fluoreto de polivinilideno de 0,45 mícron e um dispositivo de sucção a vácuo para remover as impurezas. Use vibração ultrassônica por 15 minutos para desgaseificar a fase móvel todas as vezes antes de usar.

Em seguida, vórtice e centrifugue as amostras urinárias a 1.510 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente para remover a maioria das interferências de partículas. Reúna os sobrenadantes e descarte o sedimento para novos experimentos. Para extrair analitos de forma eficaz, prossiga para a extração em fase sólida de fibra compactada, ou pré-tratamento PFSPE, imediatamente após a centrifugação.

Para ativar as nanofibras, pressione 100 microlitros de metanol e 100 microlitros de água sequencialmente através da coluna PFSPE usando uma seringa de cinco mililitros de maneira lenta. A amostra de urina deve ser misturada com solução de DPPA para melhorar sua hidrofobicidade e ajudar as catecolaminas e metabólitos a serem absorvidos pelas fibras. A solução DHBA também deve ser adicionada como padrão interno.

Misture 100 microlitros de amostra de urina com 100 microlitros de dois miligramas por mililitro de solução DPBA e 30 microlitros de 100 nanogramas por mililitro de solução de padrão interno DHBA em um tubo Eppendorf de 0,5 mililitro. Em seguida, pressione a solução de amostra misturada através da coluna PFSPE com uma seringa de plástico do tipo gás de cinco mililitros usando a força da pressão do ar. Lixivie a coluna três vezes usando uma seringa de plástico do tipo gás de cinco mililitros para carregar 100 microlitros da solução de DPBA na coluna SPE e empurre a solução lentamente através do cartucho com pressão de ar.

Esta etapa de enxágue é necessária porque a solução de DPBA pode remover as impurezas enquanto os analitos são retidos, melhorando assim a sensibilidade e a seletividade dos analitos. Em seguida, carregue 50 microlitros do eluente na coluna PFSPE e empurre-o através da coluna, coletando o eluato com um tubo Eppendorf de 0,5 mililitro. Ligue o desgaseificador de HPLC para desgaseificar o ar no sistema.

Antes das análises de amostra, o sistema deve funcionar por mais de 0,5 horas com a fase móvel para equilibrar e reduzir o ruído da linha de base. Colete amostras de 20 microlitros do eluato usando um amostrador automático e, em seguida, injete-o no sistema HPLC ECD. Quando as execuções estiverem concluídas, desligue a célula do detector usando a interface do detector.

Não desligue a célula com o interruptor na parte traseira do detector, pois isso pode danificar o instrumento. Altere manualmente a composição da fase móvel para 10% de metanol e 90% de água. Depois de funcionar por pelo menos 30 minutos, mude manualmente a fase móvel para metanol de grau HPLC.

Execute o sistema por cerca de 15 minutos para protegê-lo em metanol. A falha em executar esta etapa seguindo o tempo de execução recomendado pode resultar em danos à coluna e ao detector. Desligue o fluxo e, em seguida, desligue o desgaseificador.

Prossiga para a análise de catecolaminas conforme descrito no protocolo de texto. O cromatograma de uma amostra de água enriquecida com os alvos e o padrão interno é mostrado sem extração. Sob a condição de HPLC no protocolo, os cinco picos-alvo do método PFSPE são bem separados e significativamente mais altos do que aqueles extraídos por um cartucho comercial de ácido fenilborônico.

Além disso, o pico de DOPAC não apareceu no resultado da extração do cartucho de PBA, indicando que a coluna de PBA não foi capaz de extrair DOPAC. Quando a amostra de urina foi extraída, o método PFSPE não só conseguiu extrair os alvos com boa identificação de picos, mas também se livrar da maior parte da interferência na urina. Curvas de calibração foram construídas para cada composto plotando a razão da área do pico, mostrando boa linearidade com baixa concentração.

Para validação com amostras de urina real, foram testadas as amostras urinárias de 28 lactentes de alto risco e 22 lactentes saudáveis. Embora algumas catecolaminas não tenham sido significativamente diferentes entre os grupos de alto risco e saudáveis, os bebês de alto risco apresentaram maiores quantidades do metabólito MHPG do que o grupo controle. Portanto, o nível de MHPG urinário pode ser um marcador potencial para a identificação precoce de bebês de alto risco.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em minutos. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de preparar as cinzas frescas, operar rapidamente e evitar a exposição à luz solar direta. A adição de solução de ácido difenilborato nas etapas de absorção e enxágue também é crítica.

Após este procedimento, como medidas falta de terminação de catecolaminas e metabólitos no plasma ou no líquido cefalorraquidiano. Alsliver pode ser realizado para determinar a universalidade deste protocolo no teste de outros fluidos biológicos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem a relação entre déficits de neurodesenvolvimento e o nível de catecolaminas urinárias em amostras de crianças.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o método de extração em fase sólida com figuras nair e um dispositivo simples, o DPBA de resíduos corporativos de fíbulos de ar PCE PS pode ajudar a limpar os neurotransmissores de catecolaminas nas amostras de urina. Essa técnica se estende ao diagnóstico precoce de cassis com risco de dano cerebral em bebês. Porque a análise comparativa revelou diferenças anormais no MHPG unário de crianças com autismo, indicando que os metabólitos das catecolaminas podem ser importantes marcadores candidatos.