Name: Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a fabricar um microreator de fluxo para digestão enzimática rápida de proteínas, permitindo identificação por espectrometria de massa com ionização por electrospray. Este método rápido e econômico integra-se facilmente a plataformas microfabricadas.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa NSF/DBI-1255991 para o IML.

1. Preparação do capilar microrreactor <ol><li> Cortar o diâmetro interno 100 um (ID) x 360 uM exterior capilar diâmetro (DO) a um comprimento de 7-8 cm, e a 20 uM ID x 90 um OD capilar de 3-5 cm com o cutelo de capilar em vidro; verificar sob o microscópio que ambas as extremidades capilares têm um corte limpo, em linha reta, sem quaisquer rebarbas salientes. </li><li> Inserir a 20 um x 90 um ID OD capilar para um final de 100 uM ID x 360 uM OD capilar, para um comprimento de ~ 6 mm; em caso de necessidade, observar esta operação sob um microscópio. </li><li> Aplique uma pequena gota de E6000 cola em torno da junção dos 90 mm OD / 100 capilares mm ID com o fim de um Q-tip, e deixe a cola cura O / N à temperatura ambiente. </li><li> Cortar a 20 um x 90 um ID OD capilar inserido com um comprimento de ~ 10-15 mm; este vai ser o emissor de ionização por electropulverização. </li><li> Pré-cortar a 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; PEEK OD e 1/16 &quot;banheira de PTFE ODing em pedaços de 4-5 cm de comprimento; estas serão as mangas utilizados em uniões capilares para fornecer uma conexão livre de vazamento. </li><li> Ligar a extremidade oposta da 100 mm Dl x 360 uM OD capilar para uma união PEEK; usar uma luva 1/32 &quot;PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento. </li><li> Inserir / apertar uma peça de ~ 5 cm de comprimento tubagem de PTFE 1/16 &quot;para a extremidade oposta da união. </li><li> Pesar ~ 4 mg de C18 (5 uM), em partículas de um pré-limpos / secos frasco de 2 ml de vidro; adicionar 0,5 ml de isopropanol, fechar o recipiente e dispersar a pasta no banho ultrasonicator. </li><li> Retirar com uma seringa de 250 ul a cerca de 200 pasta ul, inserir a agulha da seringa no &quot;tubo de 1/16 PTFE da união PEEK, e dispensar lentamente a pasta para o 100 mm ID x 360 mm OD capilar; observar ao microscópio como a capilar enche de partículas até um comprimento de 2-3 mm de embalagem é obtida, o que irá ser o micro-reactor (Figura 1) a 20 μ.m ID capilar retém as partículas na micro-reactor por meio de um efeito de distorção. 15 </li><li> Lavar o microrreactor com ~ 50 ul de solução de H2O / CH3CN 50:50 v / v, e em seguida, com solução de ~ 50 ul de H2O / CH3CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Preparação das Soluções Amostra Nota: As operações que envolvam o manuseamento de solventes e ácidos orgânicos e preparação da solução são para ser executadas numa hotte. Usar óculos, luvas e vestuário de protecção. <ol><li> Lavar com CH3OH e secar alguns frascos de vidro (4 mL) e tubos de polipropileno (15 ml). </li><li> Preparar 10 ml de uma solução de H2O / CH3CN (98: 2 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 9,8 ml de H2O com 200 ul de CH3CN; misture com ultra-sons. </li><li> Preparar 10 ml de uma solução de H2O / CH3CN (50:50 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 5 ml de H 2 &lt;/ sub&gt; O com 5 ml CH 3 CN; misture com ultra-sons. </li><li> Prepare a 4 ml de uma solução aquosa acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons. </li><li> Prepare a 4 ml de uma solução orgânica acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons. </li><li> Pesar 16 mg de NH 4 HCO 3 com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicionar 4 ml de H 2 O / CH 3 CN: solução (98 2 v / v) e dispersa-se por ultra-sons; isto resulta em uma solução 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) em tampão aquoso. </li><li> Pesar 5 mg de uma proteína padrão (por exemplo, albumina de soro bovino, a hemoglobina α / β, citocromo C, anidrase carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc) com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicione 4 ml wate DIR e dispersar por sonicação; Isto normalmente resulta numa solução de elevada concentração de nível uM. </li><li> Prepare 1 ml de solução de proteína (1-2? M), diluindo a solução de concentração elevada de nível um, com um volume adequado de NH 4 HCO 3 (50 mM), tampão aquoso; misture com ultra-sons. </li><li> Preparar a solução de tripsina (5 ^ M) por dissolução de 20 ug de tripsina de grau de sequenciação-em 170 mL de NH 4 HCO 3 (50 mM), tampão aquoso; dispersar por sonicação. </li></ol> 3. Configuração Experimental Nota: O sistema LTQ-MS está equipado com uma fonte ESI modificado que inclui uma XYZ-estágio home-construído, que permite a interface do espectrômetro de massa para várias abordagens de entrada da amostra. <ol><li> Desligue o microreator capilar a partir da união PEEK e se conectar à PEEK Tee. </li><li> Insira fio Pt A ~ 2 cm de comprimento no lado-braço do PEEK T; utilizar uma &quot;manga PEEK 1/32 para fornecer umaconexão e para o isolamento do fio Pt livre de vazamento. </li><li> Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para a extremidade oposta do PEEK T; usar uma luva 1/32 &quot;PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento. </li><li> Fixe o Tee PEEK na XYZ-stage e posicione o ESI emissor ~ 2 mm de distância da massa capilar de entrada espectrômetro. </li><li> Ligue o fio de Pt à fonte de alimentação de energia ESI do espectrômetro de massa. </li><li> Ligar a extremidade oposta do capilar de transferência de amostras para a união de aço inoxidável; usar uma luva 1/16 &quot;PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento. </li><li> Conectar um 4-5 cm de comprimento &quot;1/16 tubagem de PTFE para a extremidade oposta da união de aço inoxidável e inserir a agulha da seringa de 250 ul na tubagem de PTFE; ligar a bomba e ajustar a taxa de fluxo no valor desejado (por exemplo, 2 ul / min). </li><li> em tandem entrada parâmetros MS de aquisição de dados para o pacote de software que controla o instrumento de MSd salvar como um arquivo método para pronta a configuração para realizar a análise; para o sistema LTQ-MS, use os parâmetros de análise dependentes seguintes dados: a exclusão dinâmica habilitado para 180 segundos com largura de massa exclusão ± 1,5 m / z; uma MS varredura seguido por um zoom e MS 2 varreduras em 5 melhores picos mais intensos, aumentar a largura de digitalização ± 5 m / z; dissociação induzida por colisão (CID) parâmetros definidos no isolamento largura de 3 m / z, energia de colisão normalizada de 35%, a activação Q 0.25, e tempo de activação 30 ms. </li></ol> 4. Setup Microfluidic <ol><li> Preparar um dispositivo de microfluidos de vidro ou substratos poliméricos; 16-18 a disposição do dispositivo é fornecida na Figura 2A, que consiste de um micro-reactor (1) (0,13 mm Comprimento largura x 2 mm x 50 mm de profundidade) ligada a uma entrada (2 ), saída (3) e uma porta lateral (4); os canais comunicantes para manipulações são fluídicos ~110 uM de largura e ~ 50 mm de profundidade; uma estrutura de múltiplos canais (5), que consiste em ~ 1,5-2 uM de profundidade x 10 m de largura x 100 mm de comprimento colocados microcanais de 25 um para além, irá actuar como um filtro para a retenção das partículas no microrreactor. </li><li> Ative as conexões de fluido de entrega para o chip por meio de colagem conectores especializados para as portas de entrada, ou através da elaboração de um suporte polimérico que acomoda acessórios para fornecimento de fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Prepara-se uma pasta fluida de partículas de C18 (5 uM) tal como descrito no passo 1.8; fornecer a pasta para o micro-reactor com uma seringa usando 1/16 &quot;tubagem de PTFE ligado à porta lateral do chip (4); selar a porta após o carregamento de partícula com cola epóxi e cura durante 1 hora num forno a 90 ° C 16. </li><li> Inserir um capilar (20 uM ID x 90 um comprimento OD x 10 mm) no orifício de saída, selar com cola E6000, e deixar cura S / N; isso vai se tornar o emissor ESI ( <strong&gt; 6). </li><li> Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para o orifício de entrada do chip (2); ligar a extremidade oposta do tubo capilar a uma seringa de 250 ul e a bomba de seringa, tal como descrito em 3,6-3,7. </li><li> Coloque um leve conector PEEK T na linha de transferência de amostras imediatamente antes da abertura de entrada (2) e inserir um fio de Pt sobre o lado do braço do T, como descrito no ponto 3.2; este será o eletrodo ESI. </li><li> Fixar o dispositivo de microfluidos na fase XYZ com o emissor ESI posicionado ~ 2 mm de distância do capilar massa espectrómetro de entrada; preparar a MS para análise tal como descrito em 3.8. </li></ol> 5. Amostra de carregar, digestão proteolítica e eluição por análise por MS Nota: Todos os passos de transferência de solução / amostra são realizadas com o auxílio de uma bomba de seringa e deveria permitir a alguns minutos adicionais para completar, para compensar os mortos-volumes associados com as linhas de transferência de e para o micro-reactor; o tempo necessário dependerá das taxas de fluxo envolvidos. <ol><li> Lavar o microrreactor e prepará-la para a análise por infusão de uma solução aquosa de NH 4 HCO 3 (50 mM) em H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul. </li><li> Carregar a amostra de proteína (1 uM) no micro-reactor por infusão da solução de amostra a 2 mL / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul. </li><li> Infundir a solução de tripsina (5 uM) sobre a proteína adsorvida no micro reactor em 2 ul / min durante 1-3 min. </li><li> Extingue-se o processo de digestão proteolítica, por lavagem do micro-reactor com uma solução aquosa acidificada de TFA (0,01% v / v) em H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul. </li><li> Iniciar eluindo a digestão de proteínas a partir do micro-reactor por infusão de uma solução orgânica acidificada de TFA (0,01%v / v) em H2O / CH3CN (50:50 v / v) em 300 nl / min. </li><li> Ligue o processo de aquisição de dados de MS e a voltagem ESI (~ 2000 V); adquirir dados de MS, utilizando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no passo 3.8; observar a eluição dos péptidos trípticos. </li></ol> 6. Processamento de Dados <ol><li> Processar os dados em tandem MS com um motor de busca compatível com o formato de dados MS-primas. <ol><li> Processar os arquivos raw LTQ-MS, utilizando um organismo banco de dados específico de proteína minimamente redundantes; fazer o upload dos dados brutos no motor de busca, definir as tolerâncias de massa pai e de iões fragmento a 2 e 1 Da, respectivamente, e usar apenas fragmentos totalmente trípticos com até dois perderam clivagens para a busca; não permitem modificações pós-translacionais; definir os de média e alta confiança falsos taxas de detecção (FDR) para 1% e 3%, respectivamente, e não permitem modificações pós-translacionais. </li></ol></li><li> Filtrar os dados para selecionar apenas de alta confiançapéptido corresponde às proteínas na base de dados; avaliar os resultados de proteína e de nível de péptido. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O microreator descrito neste trabalho fornece um fácil de implementar configuração experimental para a realização de digestão enzimática de proteínas para permitir a análise MS e identificação em menos de 30 min. As vantagens deste sistema, em comparação com métodos convencionais, incluem a simplicidade, a velocidade e baixo consumo de reagentes e baixo custo. Em particular, não há necessidade de caros esferas de tripsina imobilizada e os cartuchos. A preparação do microreator capilar é simples (Figura 1A),</str...

A identificação e caracterização das proteínas purificadas é frequentemente conseguido através de técnicas de MS. A proteína é digerido com uma enzima e os seus péptidos são ainda analisados ​​por MS utilizando uma configuração experimental simples de infusão. A digestão proteolítica é necessário para a geração de fragmentos peptídicos pequenos que caem na gama de massa da maioria dos analisadores útil MS, e que pode ser facilmente fragmentado por baixo de energia de colisão de dissociação induzida para gerar informação sobre a sequência de aminoácidos. Para as proteínas isoladas ou misturas de proteínas simples, não há mais necessidade de separação cromatográfica dos péptidos antes da detecção MS. Uma mistura de péptidos 25-50 podem ser facilmente analisadas por infusão da amostra com uma bomba de seringa directamente na fonte de iões de MS. O espectrómetro de massa pode realizar a análise e confirmar a sequência de uma proteína dentro de um curto espaço de tempo. Com os métodos modernos de aquisição de dados, este processo pode ser realizado Within alguns minutos ou mesmo segundos. O fator limitante para completar todo o processo em uma escala de tempo curta é a etapa de digestão proteolítica. Normalmente, isto é realizado ao longo de algumas horas (ou O / N), em solução, a 37 ºC, utilizando substrato: rácios de enzimas de (50-100): 1. Para reduzir o tempo de digestão enzimática para minutos ou segundos, microrreactores enzima imobilizada, sob a forma de reactores de microfluidos ou cartuchos disponíveis comercialmente, foram descritos. 06/01 Tipicamente, a enzima é imobilizada por ligação covalente, não-covalente / adsorção física, complexo formação ou encapsulamento, 3,6 a eficiência melhorada do processo enzimático a ser activada pela grande superfície para volume e rácios de enzima e substrato. As vantagens adicionais de reactores imobilizadas incluem a redução da autólise e interferência do enzima na análise de MS, melhorou a estabilidade da enzima e reutilização. Uma variedade de abordagens, utilizando vidro ou dispositivos microfabricados poliméricos têm sido descritos,usando enzimas imobilizadas em esferas magnéticas por interações antígeno-anticorpo, 7,8 aprisionados em redes de nanopartículas de ouro, 9 encapsulado em titânia de alumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 ou capturados através de Ni-NTA ou His-Tag formação do complexo. 6 Alternativamente , capilares tubulares abertas com enzimas imobilizadas têm sido desenvolvidos, assim. 12 além disso, a clivagem proteolítica aumentada foi demonstrada utilizando a irradiação de microondas controlado 13 ou assistida por pressão ou ciclagem tecnologia pressão (PCT) para reduzir os tempos de reacção a 30-120 min. 14 Apesar das várias vantagens de reactores de enzimas imobilizadas, os custos de cartuchos comerciais é alta, a disponibilidade de dispositivos de microfluidos para uso de rotina é limitado, e o uso de tecnologias de micro-ondas ou de PCT resultados em necessidade de instrumentação adicional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método que circumvents estas desvantagens, e que pode ser facilmente implementado em cada laboratório para capacitar investigadores com uma abordagem simples e eficaz para a realização de clivagem enzimática das proteínas na preparação para análise por MS em poucos minutos. A abordagem baseia-se na utilização de, C18-partículas hidrofóbicas, que são pré-carregados em um capilar ou dispositivo de microfluidos, e a adsorção da proteína (s) de interesse sobre essas partículas, seguido por digestão enzimática durante a infusão da enzima sobre o de leito fixo e de proteína (s) capturado. Nesta abordagem, o substrato é imobilizada através de interacções não covalentes, e a enzima é infundido através da proteína imobilizada. A eficiência proteolítica digestão é aumentada pelas grandes áreas de superfície de partícula que expõem a proteína para o processamento enzimático, as distâncias e os tempos de difusão de e para a superfície de partículas reduzido, uma melhor transferência de massa, sem ligação covalente que pode afectar a actividade da enzima, a capacidade Avaliado com a rapideze combinações de diferentes enzimas, descartável, e a multiplexação, se o processo é executado num formato de microfluidos. Esta abordagem é demonstrada com o uso de uma mistura de proteínas padrão e tripsina a enzima mais comumente utilizado para a digestão proteolítica antes da detecção ESI-MS. O espectrómetro de massa utilizados para a detecção neste estudo foi um instrumento linear armadilha de quadrupolo (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Armadilha de íons ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>O espectrômetro de massa LTQ é usado para adquirir dados MS em tandem</td></tr><tr><td>Estágio XYZ Newport</td><td></td><td>Múltiplas peças</td><td>O estágio XYZ construído em casa é usado para adaptar a fonte comercial LTQ nano-ESI para receber informações de vários sistemas de entrega de amostras</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Óptica Edmund</td><td>G81-278</td><td>O microscópio é usado para observar o processo de embalagem do microrreator</td></tr><tr><td>Balança analítica/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>A balança é utilizada para pesar as amostras de proteínas</td></tr><tr><td>Banho ultrassónico/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>O banho sónico é utilizado para misturar/homogeneizar as amostras e dispersar a pasta de partículas C18</td></tr><tr><td>Bomba de seringa 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>A microbomba é usada para carregar, enxaguar e eluir a amostra e a enzima no e do microrreator capilar embalado</td></tr><tr><td>Sistema de água ultrapura Milli-Q</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>O sistema de água MilliQ é usado para preparar água DI purificada</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida (100 &micro; m ID x 360 &micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Este capilar é usado para a fabricação do microrreator</td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida (20&nbsp; &micro; m ID x 100 &micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Este capilar é usado para a fabricação do emissor ESI</td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida (50&nbsp; &micro; m ID x 360 &micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Este capilar é usado para transferir as amostras e o eluente da bomba de seringa para o microrreator capilar</td></tr><tr><td>Cutelo capilar</td><td>de vidro Supelco</td><td>23740-U</td><td>Esta é uma ferramenta para cortar capilares de sílica fundida no comprimento desejado</td></tr><tr><td>Cola</td><td>Produtos Ecléticos</td><td>E6000 Artesanato</td><td>Esta cola é usada para fixar o emissor ESI no microrreator capilar ou no chip microfluídico</td></tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Esta cola é usada para selar o orifício de entrada microfluídico através do qual as partículas C18 são carregadas</td></tr><tr><td>Partículas C18 de fase reversa (5&nbsp; &micro; m)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Estas são partículas C18 nas quais as proteínas são adsorvidas; as partículas foram extraídas de um 4&nbsp; mm x 20 cm coluna C18 LC da Agilent</td></tr><tr><td>Seringa/vidro (250 &micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>As seringas de vidro são usadas para carregar a pasta de partículas C18 no microrreator capilar e para entregar a amostra e os eluentes ao microrreator</td></tr><tr><td>União PEEK redutora interna (1/16 "a 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Esta união é usada para conectar o 250 &micro; l seringa para o microrreator para carregar o 5 &micro; Pasta de partículas m</td></tr><tr><td>União de aço inoxidável (1/16")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>A união de aço inoxidável é usada para conectar a agulha da seringa de vidro ao conector em T PEEK de microvolume capilar de infusão</td></tr><tr><td>(1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>O T Peek é usado para conectar o capilar de transferência de amostras ao microrreator capilar; em seu braço lateral, permite a inserção do conector em T do fio Pt</td></tr><tr><td>(peso leve)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Este conector em T é usado para aplicar tensão ESI ao chip microfluídico através do fio Pt da linha de transferência de amostra</td></tr><tr><td>(0,404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>O fio Pt fornece conexão elétrica para geração de ESI e é conectado à fonte de alimentação ESI do espectrômetro de massa</td></tr><tr><td>, tubulação de PTFE (1/16" OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>O tubo de Teflon é usado para permitir uma conexão hermética entre a agulha da seringa e a união de aço inoxidável&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulação PEEK (0,015 " ID x 1/16" OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>O tubo Peek é usado como uma luva para permitir uma conexão hermética entre a união de aço inoxidável e o 50&nbsp; &micro; m Tubo PEEK capilar de transferência ID</td></tr><tr><td>(0,015" ID x 1/32" OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>O tubo Peek é usado como uma luva para permitir uma conexão sem vazamentos entre os capilares de sílica fundida e o Peek Tee</td></tr><tr><td>Cortador de tubos de polímero de corte limpo</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Este cortador é usado para pré-cortar o 1/16" e 1/32' Tubo de polímero Peek que é usado como manga para conexões sem vazamentos em peças de ~4-5 cm de comprimento</td></tr><tr><td>Frasco âmbar (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Os frascos são usados para preparar soluções de amostra e a pasta de partículas C18&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco âmbar (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Os frascos são usados para preparar soluções de amostra</td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Os frascos são usados para preparar soluções tampão</td></tr><tr><td>Cilindro (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>O cilindro é usado para medir volumes de solvente</td></tr><tr><td>Cilindro (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>O cilindro é usado para medir volumes de solvente</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (1.000 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>As ponteiras de pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (100 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>As ponteiras de pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (10 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>As ponteiras da pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra</td></tr><tr><td>Substratos de vidro</td><td>Nanofilme</td><td>B270 coroa branca, 3" x 3"</td><td>Estes são substratos de vidro para fabricação de microchips</td></tr><tr><td>Encaixe de porca macho (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Este encaixe é usado para conectar capilares de transferência ao chip microfluídico</td></tr><tr><td>Montagem de nanoport</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Este encaixe é usado para conectar capilares de transferência ao chip microfluídico</td></tr><tr><td>Padrões de proteína</td><td>Sigma</td><td>Múltiplo #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau HPLC</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, grau</td> <td>HPLCFisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, grau HPLC</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de amônio</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção ms com um micro-reator de fluxo-through

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

A grande maioria de espectrometria de massa (MS) baseados em métodos de análise de proteínas envolvem um passo de digestão enzimática antes da detecção, tipicamente com tripsina. Este passo é necessário para a geração de péptidos de baixo peso molecular, geralmente com PM &lt;3000-4000 Da, que caem dentro do intervalo de varrimento efectivo de instrumentação de espectrometria de massa. protocolos convencionais envolvem O / N digestão enzimática a 37 ºC. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de uma variedade de estratégias, que envolvem normalmente a utilização de um micro-reactor com enzimas imobilizadas ou de uma variedade de processos físicos complementares que reduzem o tempo necessário para a digestão proteolítica de alguns minutos (por exemplo, microondas ou alta pressão). Neste trabalho, nós descrevemos um método simples e de baixo custo que pode ser implementado em qualquer laboratório para a realização rápida digestão enzimática de uma proteína. O (ou mistura de proteína) proteína é adsorvida em alta perf de fase inversa C18-ligadoormance partículas de sílica com cromatograf ia líquida (HPLC), pré-carregados numa coluna capilar, e com tripsina em tampão aquoso é administrada por perfusão durante as partículas para um curto período de tempo. Para permitir a detecção em linha de MS, os peptídeos trípticos são eluídas com um sistema de solvente com o aumento do teor orgânico directamente na fonte de iões de MS. Esta abordagem evita a utilização de partículas de alto preço enzima imobilizada e não necessitam de qualquer ajuda para completar o processo. a digestão de proteínas e a análise da amostra completa pode ser realizada em menos de 3 minutos ~ e ~ 30 min, respectivamente.

Um resultado representativo de um processo de digestão proteolítica realizado simultaneamente com uma mistura de proteínas, com os micro-reactores acima descritos (Figuras 1 ou 2), é fornecida na Tabela 1. A tabela compreende as sequências de péptidos únicas que identificam uma proteína em particular, a cruz o resultado de correlação (Xcorr) (isto é, uma pontuação que caracteriza a qualidade do jogo experimental-a-teórica para o espectro de mass...

Um protocolo rápido para digestão proteolítica com um microrreator tríptico de fluxo interno acoplado a um espectrômetro de massa de ionização por eletrospray (ESI) é apresentado. A fabricação do microrreator, a configuração experimental e o processo de aquisição de dados são descritos.

Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever a fabricação de um microreator enzimático de passagem contínua que realiza digestão enzimática rápida de proteínas, permitindo a identificação de proteínas com um espectrômetro de massas por ionização por eletrospray. O método pode auxiliar na ilustração da sequência de aminoácidos de proteínas isoladas e purificadas, apoiando a caracterização estrutural e funcional posterior. A principal vantagem deste protocolo é que ele é rápido, econômico e adequado para integração em fluxos de trabalho que utilizam plataformas microfabricadas.Para começar, use um cortador de capilares de vidro para cortar o tubo capilar maior com um comprimento de sete a oito centímetros e o menor com um comprimento de três a cinco centímetros. Utilize um microscópio para verificar se ambas as extremidades dos capilares apresentam um corte limpo e reto, sem rebarbas salientes. Insira o capilar menor cerca de seis milímetros em uma das extremidades do capilar maior.Em seguida, use um cotonete para aplicar uma pequena gota de cola ao redor da junção dos capilares e deixe a cola curar durante a noite à temperatura ambiente. Depois, corte o capilar inserido em um comprimento de cerca de 10 a 15 milímetros. Esta extremidade funcionará como o emissor de ionização por eletrosspray.Insira a extremidade oposta do capilar de maior diâmetro em um tubo PEEK de 1/32 de polegada previamente cortado com comprimento entre quatro e cinco centímetros e conectado a uma união PEEK. Em seguida, insira e aperte o pedaço de cinco centímetros de comprimento do tubo PTFE de 1/16 na extremidade oposta da união. Em um frasco de vidro limpo e seco de dois mililitros, pese quatro miligramas de partículas C18 e adicione 0,5 mililitros de isopropanol.Feche o frasco. Coloque-o em banho ultrassônico e sonique para dispersar as partículas uniformemente na solução. Em seguida, use uma seringa de 250 microlitros para aspirar 200 microlitros da suspensão de C18.Insira a seringa no tubo de PTFE de 1/16 de polegada e dispense lentamente a suspensão no capilar grande. Observe ao microscópio enquanto o capilar é preenchido com partículas, até que se obtenha um empacotamento de partículas com dois a três milímetros de comprimento. O tubo capilar menor retém essas partículas no microreator por meio do efeito de chave de abóbada.Por fim, lave o microrreator com 50 microlitros de uma solução 50:50 de água e acetonitrila, seguido por 50 microlitros de uma solução contendo 49 microlitros de água misturados com um microlitro de acetonitrila. Desconecte o microrreator capilar do acoplamento PEEK e conecte-o a um T de PEEK. Em seguida, insira um fio de platina com dois centímetros de comprimento, isolado com uma luva de PEEK de 1/32 polegada, para fornecer uma conexão estanque ao braço lateral do T de PEEK.Conecte um capilar de transferência de meio metro de comprimento à extremidade oposta do PEEK-T. Utilize uma luva PEEK de 1/32 de polegada para garantir uma conexão sem vazamentos. Fixe o PEEK-T no estágio XYZ.E posicione o emissor de ionização por eletrospray a cerca de dois milímetros de distância do capilar de entrada do espectrômetro de massas. Em seguida, conecte o fio de platina à fonte de alimentação de ionização por eletrospray do espectrômetro de massas. Além disso, conecte a extremidade oposta do capilar de transferência da amostra ao acoplamento de aço inoxidável, utilizando uma luva PEEK de 1/16 de polegada para garantir uma conexão estanque.Em seguida, conecte um pedaço de tubo de PTFE de 1/16 de polegada com comprimento de quatro a cinco centímetros à extremidade oposta do acoplamento de aço inoxidável. Insira os parâmetros de aquisição de dados de espectrometria de massas em tandem conforme descrito no protocolo de texto acompanhante no pacote de software que controla o instrumento de espectrometria de massas. Salve-os como um arquivo de método para preparar a configuração para realizar a análise.O sistema de MS LTQ é equipado com uma fonte ESI modificada que inclui uma plataforma XYZ construída artesanalmente, a qual permite a interface do espectrômetro de massas com diversas abordagens de entrada de amostra. Carregue uma seringa de 250 microlitros com uma solução aquosa de bicarbonato de 50 milimolares dissolvida em 2% de acetonitrila. Em seguida, conecte a seringa ao microreator e coloque-a sob a bomba de seringa.Lave o microrreator com dois microlitros por minuto durante cinco minutos, para prepará-lo para a análise. Em seguida, carregue a amostra de proteína de interesse em uma seringa de 250 microlitros e infunda a solução da amostra a dois microlitros por minuto durante cinco minutos. A seguir, posicione uma seringa de 250 microlitros contendo uma solução de tripsina a cinco micromolar sob a bomba de seringa e infunda sobre a proteína adsorvida no microrreator a dois microlitros por minuto durante um a três minutos.É fundamental descongelar e preparar uma nova solução de tripsina antes de cada experimento. Isso garantirá que a enzima proteolítica mantenha sua atividade e o pH operacional do microrreator, que é um pH de aproximadamente 8. Carregue outra seringa de 250 microlitros com uma solução aquosa contendo 0,1% de ácido trifluoroacético adicionado a 2% de acetonitrila.Use esta solução para interromper o processo de digestão proteolítica, lavando o microrreator a dois microlitros por minuto durante cinco minutos. Em seguida, troque para uma seringa contendo ácido trifluoroacético 0,1% adicionado a acetonitrila 50%, e ative o processo de aquisição de dados em espectrometria de massas ajustando a tensão de ionização por eletrospray a cerca de 2000 volts. Use a solução acidificada para iniciar a eluição do digesto proteico do microrreator a 300 nanolitros por minuto durante 20 a 30 minutos.Adquira os dados de espectrometria de massas utilizando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no protocolo textual complementar. Processe os arquivos brutos de MS LTQ utilizando uma base de dados de proteínas minimamente redundante, primeiro enviando os dados brutos ao mecanismo de busca. Em seguida, defina as tolerâncias de massa dos íons pai e fragmento como dois e um dalton, respectivamente, e utilize apenas fragmentos totalmente tripsínicos com até dois clivagens perdidas para a busca.Além disso, defina as taxas de descoberta falsa de alta e média confiança em 1% e 3%, respectivamente, e não permita modificações pós-traducionais, a menos que se esteja especificamente buscando modificações particulares. Por fim, filtre os dados para selecionar apenas as correspondências de peptídeos de alta confiança. É mostrado aqui um espectro de massas composto por peptídeos tripsínicos gerados a partir de uma mistura de proteínas que foi submetida à proteólise no microrreator.Essas etiquetas representam os íons de peptídeos triptícos mais intensos e fornecem suas sequências e identificadores proteicos correspondentes. Este microreator oferece uma configuração experimental de fácil implementação para realizar a digestão enzimática de proteínas e permite uma análise e identificação por espectrometria de massas em menos de 30 minutos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que manter a limpeza dos frascos e dos instrumentos que entram em contato com as soluções é essencial para evitar a contaminação das amostras.Após este procedimento, outros métodos de aquisição de dados de espectrometria de massas podem ser utilizados para permitir uma melhor caracterização dos peptídeos gerados e responder a questões adicionais relacionadas à estrutura das proteínas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de proteômica desenvolverem protocolos mais rápidos para a análise de proteínas e explorarem o desenvolvimento de novas plataformas microfluídicas que permitam a exploração em alto rendimento de amostras biológicas. Esta técnica é limitada à análise de misturas proteicas relativamente simples que geram de 25 a 50 peptídeos.Esses peptídeos podem ser analisados por experimentos simples de infusão e não necessitam separação cromatográfica líquida antes da análise por espectrometria de massas. Não se esqueça de que o trabalho com solventes orgânicos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como evitar chamas abertas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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