Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

O objetivo geral deste protocolo é descrever a fabricação de um mircoreator tríptico de fluxo contínuo que realiza a digestão enzimática rápida de proteínas para permitir a identificação de proteínas com um espectrômetro de massa de ionização por eletrospray. O método pode ajudar a ilustrar a sequência de aminoácidos de proteínas isoladas e purificadas para apoiar a caracterização a jusante da estrutura e função. A principal vantagem desse protocolo é que ele é rápido, econômico e propenso à integração em fluxos de trabalho que fazem uso de plataformas microfabricadas.

Para começar, use um cutelo capilar de vidro para cortar o tubo capilar de vidro maior com um comprimento de sete a oito centímetros e o menor com um comprimento de três a cinco centímetros. Use um microscópio para verificar se ambas as extremidades capilares têm um corte limpo e reto, sem rebarbas salientes. Insira o capilar menor cerca de seis milímetros em uma extremidade do maior.

Em seguida, use um cotonete para aplicar uma pequena gota de cola ao redor da junção dos capilares e deixe a cola curar durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, corte o capilar inserido em um comprimento de cerca de 10 a 15 milímetros. Esta extremidade atuará como emissor de ionização por eletrospray.

Insira a extremidade oposta do capilar de diâmetro maior em um tubo PEEK de 1/32 de polegada que foi pré-cortado entre quatro e cinco centímetros de comprimento e conectado a uma união PEEK. Em seguida, insira e aperte o pedaço de tubo de PTFE 1/16 de cinco centímetros de comprimento na extremidade oposta da união. Em uma lima de vidro limpa e seca de dois mililitros, pese quatro miligramas de partículas C18 e adicione 0,5 mililitros de isopropanol.

Feche o frasco. Coloque-o no banho de ultrassom e sonicate para dispersar as partículas uniformemente na solução. Em seguida, use uma seringa de 250 microlitros para extrair 200 microlitros da pasta C18.

Insira a seringa no tubo de PTFE de 1/16 de polegada e distribua a pasta lentamente no capilar grande. Observe ao microscópio como o capilar se enche de partículas, até que dois a três milímetros de empacotamento de partículas sejam alcançados. O tubo capilar menor retém essas partículas no microrreator por meio de um efeito trapezoidal.

Por fim, enxágue o microrreator com 50 microlitros de uma solução de 50 a 50 de água e acetonitrila, seguido de 50 microlitros de uma solução contendo 49 microlitros de água, misturada com um microlitro de acetonitrila. Desconecte o microrreator capilar da união PEEK e conecte-o a um PEEK-T. Em seguida, insira um fio de platina de dois centímetros de comprimento, isolado com uma luva PEEK de 1/32 de polegada para fornecer uma conexão sem vazamentos no braço lateral do PEEK-T.

Conecte um capilar de transferência de amostra de meio metro de comprimento à extremidade oposta do PEEK-T. Use uma luva PEEK de 1/32 de polegada para fornecer uma conexão sem vazamentos. Prenda o PEEK-T no estágio XYZ.

E posicione o emissor de ionização por eletrospray a cerca de dois milímetros de distância do capilar de entrada do espectrômetro de massa. Em seguida, conecte o fio de platina à fonte de alimentação de ionização por eletrospray do espectrômetro de massa. Além disso, conecte a extremidade oposta do capilar de transferência de amostra à união de aço inoxidável, usando uma luva PEEK de 1/16 de polegada para fornecer uma conexão sem vazamentos.

Em seguida, conecte um pedaço de tubo de PTFE de 1/16 de polegada de comprimento de quatro a cinco centímetros de comprimento à extremidade oposta da união de aço inoxidável. Insira os parâmetros de aquisição de dados tandem MS conforme descrito no protocolo de texto que acompanha no pacote de software que controla o instrumento MS. Salve-os como um arquivo de método para preparar a configuração para executar a análise.

O sistema LTQ MS é equipado com uma fonte ESI modificada que inclui um estágio XYZ construído em casa, que permite a interface do espectrômetro de massa com as várias abordagens de entrada de amostra. Carregue uma seringa de 250 microlitros com uma solução aquosa de bicarbonato 50 milimolar dissolvido em 2% de acetonitrila. Em seguida, conecte a seringa ao microrreator e coloque-a sob a bomba da seringa.

Enxágue o microrreator e dois microlitros por minuto por cinco minutos, para prepará-lo para análise. Em seguida, carregue a amostra de proteína de interesse em uma seringa de 250 microlitros e infunda a solução de amostra a dois microlitros por minuto por cinco minutos. Em seguida, coloque uma seringa de 250 microlitros carregada com uma solução de tripsina de cinco micromolares sob a bomba da seringa e infunda sobre a proteína absorvida no microrreator a dois microlitros por minuto por um a três minutos.

É fundamental que se descongele e prepare a solução de tripsina antes de cada experimento. Isso garantirá que a enzima protolítica retenha sua atividade e seu pH operacional do microrreator, que é um pH de cerca de 8. Carregue outra seringa de 250 microlitros com uma solução aquosa consistindo de 0% 1% de ácido trifluoroacético adicionado a 2% de acetonitrila.

Use esta solução para extinguir o processo de digestão proteolítica enxaguando o microrreator a dois microlitros por minuto por cinco minutos. Em seguida, mude para uma seringa cheia de ácido trifluoroacético 01% adicionado a 50% de acetonitrila e ligue o Processo de Aquisição de Dados MS na tensão de ionização Electrospray para cerca de 2000 volts. Use a solução acidificada para começar a eluir o digestor de proteínas do microrreator a 300 nanolitros por minuto por 20 a 30 minutos.

Adquira dados de espectrometria de massa usando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no protocolo de texto que o acompanha. Processe os arquivos brutos LTQ MS usando um banco de dados de proteínas minimamente redundante, primeiro carregando os dados brutos no mecanismo de pesquisa. Em seguida, defina as tolerâncias de massa de íons pai e fragmento para dois e um daltons, respectivamente, e use apenas fragmentos totalmente trípticos com até duas clivagens perdidas para a pesquisa.

Além disso, defina as taxas de descoberta falsa de confiança alta e média para 1% e 3%, respectivamente, e não permita modificações pós-tradução, a menos que procure especificamente por modificações específicas. Por fim, filtre os dados para selecionar apenas as correspondências de peptídeos de alta confiança. Aqui é mostrado um espectro de massa composto de peptídeos trípticos que foram gerados a partir de uma mistura de proteínas que foi submetida à proteólise no microrreator.

Esses rótulos representam os íons de peptídeo tríptico mais intensos e fornecem sua sequência e identificador de proteína correspondente. Este microrreator fornece um experimento fácil de implementar para realizar a digestão enzimática de proteínas e permite uma análise e identificação de massa em menos de 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que preservar a limpeza dos frascos e instrumentação que entram em contato com as soluções é fundamental para evitar a contaminação da amostra.

Seguindo este procedimento, outros métodos de aquisição de dados de espectrometria de massa podem ser usados para permitir uma melhor caracterização dos peptídeos generativos e responder a questões adicionais relacionadas à estrutura das proteínas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores no campo da proteonômica desenvolvessem protocolos mais rápidos para a análise de proteínas e explorassem o desenvolvimento de novas plataformas microfalíticas que permitissem a exploração de amostras biológicas de alto rendimento. Esta técnica é limitada à análise de misturas de proteínas bastante simples que geram 25 a 50 peptídeos.

Esses peptídeos podem ser analisados por experimentos simples de infusão e não requerem separação por cromatografia líquida antes da análise de MS. Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como evitar chamas abertas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.