Protocolo de varredura do relógio para análise de imagem: plugins ImageJ

O objetivo geral desses protocolos de varredura tipo relógio é permitir a caracterização rápida da intensidade média de pixels dentro, ao longo da borda de, e/ou na parte externa de regiões de interesse selecionadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais e a ensinar analistas de imagens sobre a intensidade média de pixels em regiões de interesse específicas. As principais vantagens da técnica de varredura tipo relógio aqui são que ela pode ser usada para caracterizar rapidamente a intensidade média de pixels a partir da órbita em uma ou múltiplas regiões de interesse.

Para a análise padrão de varredura de relógio, no menu Arquivo, no programa ImageJ apropriado, selecione Abrir para abrir um arquivo de imagem de interesse. Por exemplo, aqui, será analisada uma seção de tecido com neurônios marcados para uma proteína de interesse. Selecione uma ferramenta de desenho apropriada e delimite a região de interesse.

Selecione Plugins e Clock Scan no menu Arquivo para abrir o protocolo padrão de varredura de relógio, janela de opções pop-up. A janela do gerenciador de região de interesse, com o contorno adicionado automaticamente, também será aberta. Na janela de opções do Plugin, use as barras de rolagem para alterar as coordenadas x e y no centro da região de interesse, conforme apropriado.

Dependendo da quantidade da região de fundo fora do objeto que deve ser coberta pela análise, use a barra de rolagem de limite de varredura para ajustar os limites de varredura. Selecione as caixas de seleção de raio real, subtrair fundo, transformada polar e/ou plotar com desvio padrão conforme apropriado para o experimento. Em seguida, clique em OK para executar o plugin.

Uma vez concluída a análise, utilize o comando de lista para acessar os dados numéricos para análises posteriores. Para a análise de varredura do relógio em múltiplas regiões, abra um arquivo de imagem contendo múltiplas regiões de interesse. Por exemplo, aqui, um painel de quadros capturados dentro da mesma seção de tecido, conforme acabou de ser demonstrado, será analisado.

Clique em Analisar, depois em Ferramentas, depois em Gerenciador de Região de Interesse e use a ferramenta de desenho apropriada para delimitar cada região de interesse. A ferramenta de linha segmentada é útil para selecionar regiões de interesse assimétricas e para excluir marcação de fundo. Clique em Adicionar na janela do Gerenciador de Região de Interesse para adicionar cada região de interesse ao gerenciador conforme for selecionada.

No menu Plugins, selecione Multi Clock Scan para abrir a janela pop-up de opções do protocolo e redefina o limite de varredura, conforme necessário. Verifique o gráfico com desvio padrão e/ou subtraia as caixas de fundo, conforme apropriado para o experimento. Em seguida, clique em OK para executar o protocolo, o qual gerará duas janelas de gráfico de saída.

Para análise de varredura de relógio de uma pilha de imagens, abra uma pilha de imagens de interesse. Aqui, será analisada uma pilha de imagens de um gânglio da raiz dorsal isolado, marcado com um fluoróforo sensível ao cálcio que foi obtido antes e depois da estimulação com eletrodo intracelular. Delimite a região de interesse dentro da pilha de imagens.

Adicione a pilha de imagens selecionada ao gerenciador de região de interesse, conforme acabou de ser demonstrado, e selecione Multi Clock Scan para abrir a janela pop-up de opções do protocolo. Reinicie o limite de varredura conforme necessário e marque a opção de plotar com desvio padrão e/ou subtrair caixas de fundo, conforme apropriado para o experimento. Em seguida, clique em OK para executar o protocolo, gerando duas janelas de gráfico de saída.

Nesta análise representativa de uma seção de tecido de neurônios marcados com fluorescência, uma região de interesse foi delimitada através do sinal intenso para a proteína de interesse, e foi realizada uma análise padrão por varredura radial para coletar perfis de intensidade de pixels radiais a partir do centro da região de interesse até o limite de varredura definido. As varreduras radiais foram normalizadas em relação ao raio da região de interesse na direção da varredura. Uma média foi calculada para gerar um perfil integral de intensidade de pixels radiais, revelando que a maior parte da proteína de interesse foi detectada na membrana plasmática da célula.

Como foi selecionado o gráfico com desvio padrão para esta análise, as linhas verticais de desvio padrão indicaram a variação entre as intensidades dos pixels dos perfis individuais de varredura radial a uma determinada distância da origem da varredura. Nesta análise, múltiplas regiões de interesse dentro da amostra de tecido neuronal foram escaneadas, como acabou de ser demonstrado, gerando um perfil integral de intensidade dos pixels para cada objeto escaneado, na sequência em que foram adicionados ao gerenciador de regiões de interesse. E, um perfil médio de intensidade dos pixels para cada região de interesse selecionada.

Portanto, essas barras de desvio padrão representam a variabilidade entre varreduras integrais de objetos individuais, e não varreduras radiais individuais. Aqui, foi realizada uma análise de pilha de imagens de um neurônio isolado de gânglio da raiz dorsal, capturado em diferentes momentos, antes e após a estimulação, por meio de eletrodo intracelular. Ao final da análise, foram exibidos um perfil de intensidade integral de pixels das instâncias individuais do objeto de interesse em diferentes imagens dentro da pilha, e um perfil médio de intensidade de pixels para todas as instâncias do objeto.

Além disso, a análise de desvio padrão de uma pilha de imagens escaneadas por relógio demonstra a variabilidade dos dados entre os escaneamentos integrais ao longo da pilha de imagens. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir intensidades de pixels utilizando plugins de escaneamento por relógio. Nosso objetivo ao desenvolver esses plugins foi tornar esse tipo de análise de imagem livremente disponível para todos os pesquisadores.

Acreditamos que o protocolo de varredura por relógio será utilizado em diversas áreas de pesquisa, incluindo, mas não se limitando a, aplicações de imagem biológica, química e física. À medida que continuamos a desenvolver e operar esses plugins de varredura por relógio, agradeceremos quaisquer comentários e sugestões de partes interessadas sobre como melhorar essas ferramentas.