Protocolo de varredura do relógio para análise de imagem: plugins ImageJ

O objetivo geral desses protocolos de varredura de relógio é permitir a caracterização rápida da intensidade média de pixels dentro, ao longo da borda e / ou fora de regiões de interesse selecionadas. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave e ensinar aos analistas de imagem sobre a intensidade média de pixels em regiões específicas de interesse. As principais vantagens da técnica de varredura do relógio aqui são que ela pode ser usada para caracterizar rapidamente a intensidade média de pixels da órbita em uma ou várias regiões de interesse.

Para análise de varredura de relógio padrão, no menu Arquivo, no programa ImageJ apropriado, selecione Abrir para abrir um arquivo de imagem de interesse. Por exemplo, aqui, uma seção de tecido com neurônios marcados para uma proteína de interesse será analisada. Selecione uma ferramenta de desenho apropriada e contorne a região de interesse.

Selecione Plugins e Varredura de Relógio no menu Arquivo para abrir o protocolo de varredura de relógio padrão, janela de opção pop-up. A janela do gerenciador de região de interesse, com a estrutura de tópicos adicionada automaticamente, também será aberta. Na janela de opções Plug-in, use as barras de rolagem para alterar as coordenadas x e y no centro da região de interesse, conforme apropriado.

Dependendo de quanto da região de fundo fora do objeto deve ser coberta pela digitalização, use a barra de rolagem de limite de varredura para ajustar os limites de varredura. Marque as caixas de seleção raio real, subtrair plano de fundo, transformação polar e/ou plotar com desvio padrão conforme apropriado experimentalmente. Em seguida, clique em OK para executar o plug-in.

Quando a análise estiver concluída, use o comando list para acessar os dados numéricos para análise posterior. Para análise de varredura de relógio de várias regiões, abra um arquivo de imagem contendo várias regiões de interesse. Por exemplo, aqui, um painel de quadros capturados dentro da mesma seção de tecido, como acabamos de demonstrar, será analisado.

Clique em Analisar, depois em Ferramentas, depois em Gerenciador de Região de Interesse e use a ferramenta de desenho apropriada para delinear cada região de interesse. A ferramenta de linha segmentada é útil para selecionar regiões assimétricas de interesse e para excluir a rotulagem de plano de fundo. Clique em Adicionar na janela Gerenciador de Região de Interesse para adicionar cada região de interesse ao gerenciador conforme ela é selecionada.

no menu Plugins, selecione Multi Clock Scan para abrir a janela pop-up de opções de protocolo e redefinir o limite de varredura, conforme necessário. Verifique o gráfico com desvio padrão e/ou subtraia caixas de fundo, conforme apropriado experimentalmente. Em seguida, clique em OK para executar o protocolo, que gerará duas janelas de plotagem de saída.

Para análise de varredura de relógio de uma pilha de imagens, abra uma pilha de imagens de interesse. Aqui, uma pilha de imagens de um gânglio de raiz dorsal isolado, marcado com uma fluorescente sensível ao cálcio que foi fotografada antes e depois da estimulação do eletrodo intracelular, será analisada. Descreva a região de interesse dentro da pilha de imagens.

Adicione a pilha de imagens selecionada ao gerenciador de região de interesse, como acabamos de demonstrar, e selecione Multi Clock Scan para abrir a janela pop-up de opções de protocolo. Redefina o limite de varredura conforme necessário e verifique o gráfico com desvio padrão e/ou subtraia as caixas de fundo, conforme apropriado experimentalmente. Em seguida, clique em OK para executar o protocolo, gerando duas janelas de plotagem de saída.

Nesta análise representativa de uma seção de tecido de neurônios marcados com fluorescência, uma região de interesse foi desenhada através do sinal brilhante para a proteína de interesse, e uma análise de varredura de relógio padrão foi realizada para coletar varreduras de intensidade de pixel radial do centro da região de interesse até o limite de varredura delineado. As varreduras radiais foram normalizadas para o raio da região de interesse na direção da varredura. Uma média, para produzir um perfil de intensidade de pixel de rádio integral, revelando que a maior parte da proteína de interesse foi medida na membrana plasmática da célula.

Como o gráfico com desvio padrão foi selecionado para esta análise, as linhas de desvio padrão vertical indicaram as intensidades entre pixels dos perfis de varredura radial individuais a uma determinada distância da origem da varredura. Nesta análise, várias regiões de interesse dentro da amostra de tecido neuronal foram escaneadas, como acabamos de demonstrar, gerando um perfil de intensidade de pixel integral para cada objeto escaneado na sequência em que foram adicionados ao gerenciador de região de interesse. E um perfil médio de intensidade de pixel para cada região de interesse selecionada.

Essas barras de desvio padrão, portanto, representam a variabilidade entre varreduras integrais de objetos individuais, em vez de varreduras radiais individuais. Aqui, foi realizada uma análise de pilha de imagens de um neurônio ganglionar da raiz dorsal isolado capturado em diferentes momentos, antes e depois da estimulação, via eletrodo intracelular. No final da análise, um perfil de intensidade de pixel integral das instâncias individuais do objeto de interesse em diferentes imagens dentro da pilha e um perfil de intensidade de pixel médio para todas as instâncias do objeto foram exibidos.

Além disso, a análise de desvio padrão de uma pilha de imagens digitalizadas por relógio demonstra a variabilidade de dados entre as varreduras integrais em toda a pilha de imagens. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir intensidades de pixel usando plug-ins de varredura de relógio. Nosso objetivo ao desenvolver esses plug-ins era tornar esses tipos de análise de imagem disponíveis gratuitamente para todos os investigadores.

Acreditamos que o protocolo de varredura do relógio será usado para as muitas áreas de pesquisa, incluindo, mas não se limitando a, aplicações de imagens biológicas, químicas e físicas. À medida que continuamos a desenvolver e operar esses plug-ins de varredura de relógio, apreciaremos qualquer feedback e sugestões de partes interessadas sobre como melhorar essas ferramentas.