Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa
June 30th, 2017
Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta.
O objetivo geral desta metodologia é avaliar quantitativamente as respostas fenotípicas dinâmicas de populações heterocelulares a pertubações, discriminando entre subpopulações. A maioria das interações fisiológicas acontece na presença de vários tipos de células. Este método pode ajudar os biólogos celulares a avaliar como as células heterogêneas respondem a pressões ambientais idênticas e como as diferentes influenciam umas às outras.
Esta técnica tem várias vantagens, discrimina entre vários tipos de células, permite a análise simultânea de subpopulações, incluindo taxas de nascimento e mortalidade e dinâmica morfológica. Embora este protocolo possa ser usado para estudar muitos processos biológicos, demonstraremos o fluxo de trabalho usando células tumorais H3255 e células CCD19LU fibroblastos tratadas com Erlotinibe, um medicamento quimioterápico. Para começar, após preparar as suspensões celulares em tubos de acordo com o protocolo de texto, inverta os tubos para misturar as células em solução para padronizar a semeadura.
Em seguida, pipete 10 microlitros de cada suspensão celular em um tubo de microcentrífuga e adicione 10 microlitros de azul de tripano. Pipete 10 microlitros da solução em uma lâmina de contagem de células e insira a lâmina em um contador de células automatizado. Repita a contagem de células pelo menos três vezes ou até que as contagens obtidas sejam consistentes.
Usando uma pipeta multicanal, semeie um total de 1.500 células em 100 microlitros de RPMI nos poços de uma placa de 96 poços. Placa cada suspensão de célula em triplicado com configurações de placa idênticas para cada ponto de tempo. Incube as células durante a noite.
Adicione DMSO ao pó de Erlotinibe para fazer uma solução estoque de Erlotinibe a 10 milimolares. Em seguida, use o meio de cultura celular para diluir o medicamento até duas vezes a concentração final mais alta de 10 micromolares. Dilua o medicamento em série quatro vezes na proporção de 1:10, para um total de cinco concentrações de medicamentos e nenhum controle de medicamentos.
Pipete 100 microlitros de solução de medicamento nos poços apropriados da placa de células de 96 poços para uma concentração final de medicamento de 1x diluído em meio. Em seguida, para corar as células para classificação baseada em fluorescência, prepare cinco microgramas por mililitro de coloração nuclear e cinco coloração micromolar de células mortas em PBS. Para classificação baseada em morfologia, prepare cinco microgramas por mililitro de coloração nuclear, cinco coloração de células mortas micromolares e cinco coloração de células micromolares em PBS.
Adicione 20 microlitros de solução de corante a cada poço. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius protegidas da luz por 30 minutos. Para adquirir imagens, use etanol a 70% para limpar o fundo da placa e coloque a placa na câmara de imagem.
Na guia de configuração, em seleção de canal, clique no botão de adição para adicionar os canais apropriados à imagem. Na seleção de layout, defina uma pilha z de imagens de teste a cada dois mícrons, começando em zero mícrons e terminando em 20 mícrons, para identificar o plano de foco. Clique em instantâneo, abaixo de cada canal, para avaliar as intensidades e otimizar os tempos de exposição.
Insira valores mais altos ou mais baixos em tempo, conforme necessário. Os núcleos nas células devem estar em foco para garantir a precisão da análise a jusante. No esquema da placa, destaque os poços apropriados.
Em seguida, no esquema de poços, destaque os 25 campos a serem visualizados de maneira semelhante. Em executar experimento, identifique a placa no nome da placa e, em seguida, clique no botão Iniciar para executar o protocolo de aquisição de imagem com um objetivo de 10x para gerar imagens TIFF em tons de cinza nos canais escolhidos. Depois de instalar os softwares de código aberto, CellProfiler e análise CellProfiler, abra o CellProfiler, clique em Arquivo, Importar, Pipeline do arquivo e selecione o arquivo apropriado.
Selecione o pipeline de classificação baseado em fluorescência para classificar as células como H3255 ou CCD19LU com base na intensidade do EGFP e para calcular as características da morfologia. Clique em Exibir configurações de saída e selecione o local dos arquivos de imagem para análise e o destino dos dados extraídos. Antes de executar a análise, o protocolo deve ser testado no modo de teste para verificar os valores dos parâmetros.
É importante que a segmentação nuclear e celular seja precisa. Este protocolo foi projetado para identificar células com coloração de núcleos variável, garantir que o valor de pixel pelo qual os núcleos são expandidos seja grande o suficiente para mascarar os núcleos com a maior coloração de DNA, mas pequeno o suficiente para não mascarar os núcleos circundantes. Para classificar populações com base na fluorescência, primeiro, redimensione a faixa de intensidade de GFP, depois meça a intensidade de GFP de cada núcleo identificado e classifique os objetos com base em um limite definido pelo usuário.
Em seguida, clique em analisar imagens para iniciar a análise. Quando a análise for concluída, vá para a pasta de saída padrão para exibir os dados calculados. Para classificação baseada em morfologia, execute o protocolo apropriado no perfilador de células para gerar recursos de morfologia de células inteiras.
Abra o software Cell Profiler Analysis, selecione o arquivo de propriedades do banco de dados gerado no Cell Profiler e clique em abrir. Clique na guia Classificador no canto superior esquerdo da tela. Para chamar imagens de células aleatórias do experimento, clique em buscar, as imagens aparecerão na janela não classificada.
Classifique manualmente as células como positivas ou negativas, que aqui representam H3255 ou CCD19LU selecionando e arrastando as células para o compartimento apropriado. Depois de classificar pelo menos 50 células por subpopulação, clique em Treinar Classificador e, em seguida, clique em Verificar Progresso. Por fim, clique em Pontuar tudo para gerar uma tabela com contagens de células para cada subpopulação.
Em uma cultura a frio heterocelular de células tumorais H3255 e CCD19LU fibroblastos, os núcleos foram identificados e segmentados com base na coloração de DNA. As populações de células foram classificadas por fluorescência induzida artificialmente ou treinamento em algoritmo de aprendizado de máquina para identificar tipos de células com base nas diferenças morfológicas. Existe uma alta concordância entre as metodologias baseadas em fluorescência e morfologia.
Os dois métodos de classificação foram independentemente implícitos nas mesmas imagens e concordaram 97,4% e 92,5% nas populações não tratadas e tratadas, respectivamente. Aqui, foram investigadas alterações na morfologia celular e na resposta ao tratamento com Erlotinibe. Após três dias de tratamento medicamentoso, foi observada uma diminuição na área dos núcleos e um aumento na área celular das células H3255.
Isso foi possivelmente devido à morte celular. Para testar se o erlotinibe tinha um efeito citotóxico ou citostático nas células, as células mortas foram identificadas com base na coloração com iodeto de propídio. Foram observados efeitos citotóxicos e citostáticos do Erlotinibe nas células H3255, com aumento do número de mortes e diminuição do número de nascimentos após o tratamento medicamentoso.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas não consecutivas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como interferência de RA ou CRISPR, podem ser realizados para abordar questões adicionais que investigam a genômica funcional. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer explorarem a influência das células estromais na progressão do tumor em vários tipos de câncer.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar as respostas heterocelulares a estímulos ambientais, especificamente como analisar dados de imagem baseados em microscopia de maneira de alto rendimento.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo para investigar a dinâmica populacional heterocelular em resposta a perturbações. A metodologia utiliza uma plataforma baseada em imagens para gerar conjuntos de dados quantitativos para a caracterização de múltiplos fenótipos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Técnicas de Imagem
- Dinâmica Populacional
Contexto
- Interações fisiológicas frequentemente ocorrem entre múltiplos tipos celulares.
- Entender como células heterogêneas respondem a pressões ambientais é crucial.
- Este método permite a avaliação de interações entre diferentes populações celulares.
- Pode ser aplicado a vários processos biológicos.
Propósito do Estudo
- Avaliar quantitativamente as respostas fenotípicas dinâmicas de populações heterocelulares.
- Discriminar entre subpopulações sob condições idênticas.
- Demonstrar o fluxo de trabalho usando tipos celulares e tratamentos específicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de suspensões celulares e padronização da semeadura.
- Uso de azul de tripano para contagem de células e análise automatizada.
- Tratamento medicamentoso com Erlotinib e coloração por fluorescência para classificação.
- Aquisição e análise de imagens usando o software CellProfiler.
Principais Resultados
- Alta concordância entre metodologias baseadas em fluorescência e morfologia.
- Precisão de classificação de 97,4% e 92,5% para populações não tratadas e tratadas, respectivamente.
- Identificação e segmentação bem-sucedidas de núcleos celulares baseadas na coloração.
Conclusões
- O protocolo discrimina efetivamente entre múltiplos tipos celulares.
- Permite a análise simultânea de subpopulações, incluindo taxas de nascimento e morte.
- Esta metodologia pode ser adaptada para vários estudos biológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
