Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

O objetivo geral desta metodologia é avaliar quantitativamente as respostas fenotípicas dinâmicas de populações heterocelulares a perturbações, ao mesmo tempo em que discrimina entre subpopulações. A maioria das interações fisiológicas ocorre na presença de múltiplos tipos celulares. Este método pode ajudar os biólogos celulares a avaliar como células heterogêneas respondem a pressões ambientais idênticas e como tipos celulares diferentes se influenciam mutuamente.

Esta técnica apresenta várias vantagens: discrimina entre múltiplos tipos celulares, permite análise simultânea de subpopulações, incluindo taxas de nascimento e morte, além da dinâmica morfológica. Embora este protocolo possa ser usado para estudar diversos processos biológicos, demonstraremos o fluxo de trabalho utilizando células tumorais H3255 e células fibroblásticas CCD19LU tratadas com Erlotinib, uma droga quimioterápica. Para começar, após o preparo das suspensões celulares em tubos de acordo com o protocolo descrito, inverta os tubos para misturar as células em solução, padronizando assim a semeadura.

Em seguida, pipete 10 microlitros de cada suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e adicione 10 microlitros de azul de tripano. Pipete 10 microlitros da solução para uma lâmina de contagem de células e insira a lâmina em um contador automático de células. Repita a contagem celular pelo menos três vezes, ou até que as contagens obtidas sejam consistentes.

Usando uma pipeta multicanal, semeie um total de 1.500 células em 100 microlitros de RPMI nos poços de uma placa de 96 poços. Plaque cada suspensão celular em triplicata com configurações idênticas de placa para cada ponto temporal. Incube as células durante a noite.

Adicione DMSO ao pó de Erlotinib para preparar uma solução estoque de Erlotinib a 10 milimolar. Em seguida, use o meio de cultura celular para diluir a droga até duas vezes a concentração final mais alta de 10 micromolar. Dilua a droga sequencialmente quatro vezes em uma proporção de 1:10, obtendo um total de cinco concentrações da droga e um controle sem droga.

Pipete 100 microlitros de solução do fármaco nos poços apropriados da placa de 96 poços contendo células, para uma concentração final do fármaco de 1x diluída no meio. Em seguida, para corar as células para classificação baseada em fluorescência, prepare cinco microgramas por mililitro de corante nuclear e cinco micromolares de corante para células mortas em PBS. Para classificação baseada em morfologia, prepare cinco microgramas por mililitro de corante nuclear, cinco micromolares de corante para células mortas e cinco micromolares de corante celular em PBS.

Adicione 20 microlitros de solução de corante a cada poço. Em seguida, incube as amostras a 37 °C, protegidas da luz, por 30 minutos. Para adquirir imagens, use etanol 70% para limpar a parte inferior da placa e coloque a placa na câmara de imagem.

No separador de configuração, em seleção de canal, clique no botão de adição para incluir os canais apropriados na imagem. Em seleção de layout, defina um empilhamento z de imagens de teste a cada dois mícrons, começando em zero mícron e terminando em 20 mícrons, para identificar o plano de foco. Clique em instantâneo, sob cada canal, para avaliar as intensidades e otimizar os tempos de exposição.

Digite valores maiores ou menores no campo de tempo conforme necessário. Os núcleos nas células devem estar em foco para garantir a precisão da análise subsequente. No esquema da placa, destaque os poços apropriados.

Em seguida, no esquema dos poços, destaque os 25 campos a serem imageados de maneira semelhante. Em executar experimento, identifique a placa no nome da placa e, em seguida, clique no botão iniciar para executar o protocolo de aquisição de imagens com uma objetiva de 10x para gerar imagens TIFF em escala de cinza nos canais escolhidos. Após instalar os softwares de código aberto, CellProfiler e CellProfiler Analyst, abra o CellProfiler, clique em Arquivo, Importar, Pipeline do arquivo e selecione o arquivo apropriado.

Selecione o pipeline de classificação baseado em fluorescência para classificar as células como H3255 ou CCD19LU com base na intensidade de EGFP e para calcular as características de morfologia. Clique em Visualizar configurações de saída, então selecione o local dos arquivos de imagem para análise e o destino para os dados extraídos. Antes de executar a análise, o protocolo deve ser testado no modo de teste para verificar os valores dos parâmetros.

É importante que a segmentação nuclear e celular seja precisa. Este protocolo foi desenvolvido para identificar células com diferentes colorações nucleares, garantindo que o valor de pixel pelo qual os núcleos são expandidos seja suficientemente grande para mascarar os núcleos com a maior coloração de DNA, mas pequeno o bastante para não mascarar núcleos adjacentes. Para classificar populações com base na fluorescência, primeiro reescalone a faixa de intensidade de GFP, depois meça a intensidade de GFP de cada núcleo identificado e classifique os objetos com base em um limiar definido pelo usuário.

Em seguida, clique em analisar imagens para iniciar a análise. Quando a análise estiver concluída, acesse a pasta de saída padrão para visualizar os dados calculados. Para classificação baseada em morfologia, execute o protocolo apropriado no Cell Profiler para gerar características de morfologia de células inteiras.

Abra o software de análise Cell Profiler, selecione o arquivo de propriedades do banco de dados gerado no Cell Profiler e clique em abrir. Clique na aba Classificador no canto superior esquerdo da tela. Para chamar imagens aleatórias de células do experimento, clique em buscar; as imagens aparecerão na janela não classificada.

Classifique manualmente as células como positivas ou negativas, que aqui representam H3255 ou CCD19LU, selecionando e arrastando as células para o compartimento apropriado. Após classificar pelo menos 50 células por subpopulação, clique em Treinar Classificador e, em seguida, clique em Verificar Progresso. Por fim, clique em Pontuar Todos para gerar uma tabela com as contagens celulares para cada subpopulação.

Em uma cultura a frio heterocelular de células tumorais H3255 e fibroblastos CCD19LU, os núcleos foram identificados e segmentados com base na coloração de DNA. As populações celulares foram classificadas artificialmente por fluorescência induzida ou por meio de treinamento de algoritmo de aprendizado de máquina para identificar os tipos celulares com base em diferenças morfológicas. Há uma alta concordância entre as metodologias baseadas em fluorescência e morfologia.

Os dois métodos de classificação foram aplicados independentemente às mesmas imagens e concordaram em 97,4% e 92,5% nas populações não tratadas e tratadas, respectivamente. Aqui, foram investigadas alterações na morfologia celular e na resposta ao tratamento com Erlotinib. Após três dias de tratamento com o fármaco, observou-se uma diminuição na área dos núcleos e um aumento na área celular nas células H3255.

Isso possivelmente foi devido à morte celular. Para testar se o Erlotinibe tinha um efeito citotóxico ou citostático sobre as células, as células mortas foram identificadas com base na coloração com iodeto de propídio. Foram observados tanto efeitos citotóxicos quanto citostáticos do Erlotinibe sobre as células H3255, com um aumento no número de mortes e uma diminuição no número de nascimentos após o tratamento com o fármaco.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas não consecutivas, desde que seja executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como interferência de RA ou CRISPR, podem ser realizados para abordar questões adicionais sobre genômica funcional. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia do câncer explorarem a influência das células estromais na progressão tumoral em múltiplos tipos de câncer.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar respostas heterocelulares a estímulos ambientais, especificamente como analisar dados de imagem baseados em microscopia de maneira de alto rendimento.