Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

O objetivo geral desta metodologia é avaliar quantitativamente as respostas fenotípicas dinâmicas de populações heterocelulares a pertubações, discriminando entre subpopulações. A maioria das interações fisiológicas acontece na presença de vários tipos de células. Este método pode ajudar os biólogos celulares a avaliar como as células heterogêneas respondem a pressões ambientais idênticas e como as diferentes influenciam umas às outras.

Esta técnica tem várias vantagens, discrimina entre vários tipos de células, permite a análise simultânea de subpopulações, incluindo taxas de nascimento e mortalidade e dinâmica morfológica. Embora este protocolo possa ser usado para estudar muitos processos biológicos, demonstraremos o fluxo de trabalho usando células tumorais H3255 e células CCD19LU fibroblastos tratadas com Erlotinibe, um medicamento quimioterápico. Para começar, após preparar as suspensões celulares em tubos de acordo com o protocolo de texto, inverta os tubos para misturar as células em solução para padronizar a semeadura.

Em seguida, pipete 10 microlitros de cada suspensão celular em um tubo de microcentrífuga e adicione 10 microlitros de azul de tripano. Pipete 10 microlitros da solução em uma lâmina de contagem de células e insira a lâmina em um contador de células automatizado. Repita a contagem de células pelo menos três vezes ou até que as contagens obtidas sejam consistentes.

Usando uma pipeta multicanal, semeie um total de 1.500 células em 100 microlitros de RPMI nos poços de uma placa de 96 poços. Placa cada suspensão de célula em triplicado com configurações de placa idênticas para cada ponto de tempo. Incube as células durante a noite.

Adicione DMSO ao pó de Erlotinibe para fazer uma solução estoque de Erlotinibe a 10 milimolares. Em seguida, use o meio de cultura celular para diluir o medicamento até duas vezes a concentração final mais alta de 10 micromolares. Dilua o medicamento em série quatro vezes na proporção de 1:10, para um total de cinco concentrações de medicamentos e nenhum controle de medicamentos.

Pipete 100 microlitros de solução de medicamento nos poços apropriados da placa de células de 96 poços para uma concentração final de medicamento de 1x diluído em meio. Em seguida, para corar as células para classificação baseada em fluorescência, prepare cinco microgramas por mililitro de coloração nuclear e cinco coloração micromolar de células mortas em PBS. Para classificação baseada em morfologia, prepare cinco microgramas por mililitro de coloração nuclear, cinco coloração de células mortas micromolares e cinco coloração de células micromolares em PBS.

Adicione 20 microlitros de solução de corante a cada poço. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius protegidas da luz por 30 minutos. Para adquirir imagens, use etanol a 70% para limpar o fundo da placa e coloque a placa na câmara de imagem.

Na guia de configuração, em seleção de canal, clique no botão de adição para adicionar os canais apropriados à imagem. Na seleção de layout, defina uma pilha z de imagens de teste a cada dois mícrons, começando em zero mícrons e terminando em 20 mícrons, para identificar o plano de foco. Clique em instantâneo, abaixo de cada canal, para avaliar as intensidades e otimizar os tempos de exposição.

Insira valores mais altos ou mais baixos em tempo, conforme necessário. Os núcleos nas células devem estar em foco para garantir a precisão da análise a jusante. No esquema da placa, destaque os poços apropriados.

Em seguida, no esquema de poços, destaque os 25 campos a serem visualizados de maneira semelhante. Em executar experimento, identifique a placa no nome da placa e, em seguida, clique no botão Iniciar para executar o protocolo de aquisição de imagem com um objetivo de 10x para gerar imagens TIFF em tons de cinza nos canais escolhidos. Depois de instalar os softwares de código aberto, CellProfiler e análise CellProfiler, abra o CellProfiler, clique em Arquivo, Importar, Pipeline do arquivo e selecione o arquivo apropriado.

Selecione o pipeline de classificação baseado em fluorescência para classificar as células como H3255 ou CCD19LU com base na intensidade do EGFP e para calcular as características da morfologia. Clique em Exibir configurações de saída e selecione o local dos arquivos de imagem para análise e o destino dos dados extraídos. Antes de executar a análise, o protocolo deve ser testado no modo de teste para verificar os valores dos parâmetros.

É importante que a segmentação nuclear e celular seja precisa. Este protocolo foi projetado para identificar células com coloração de núcleos variável, garantir que o valor de pixel pelo qual os núcleos são expandidos seja grande o suficiente para mascarar os núcleos com a maior coloração de DNA, mas pequeno o suficiente para não mascarar os núcleos circundantes. Para classificar populações com base na fluorescência, primeiro, redimensione a faixa de intensidade de GFP, depois meça a intensidade de GFP de cada núcleo identificado e classifique os objetos com base em um limite definido pelo usuário.

Em seguida, clique em analisar imagens para iniciar a análise. Quando a análise for concluída, vá para a pasta de saída padrão para exibir os dados calculados. Para classificação baseada em morfologia, execute o protocolo apropriado no perfilador de células para gerar recursos de morfologia de células inteiras.

Abra o software Cell Profiler Analysis, selecione o arquivo de propriedades do banco de dados gerado no Cell Profiler e clique em abrir. Clique na guia Classificador no canto superior esquerdo da tela. Para chamar imagens de células aleatórias do experimento, clique em buscar, as imagens aparecerão na janela não classificada.

Classifique manualmente as células como positivas ou negativas, que aqui representam H3255 ou CCD19LU selecionando e arrastando as células para o compartimento apropriado. Depois de classificar pelo menos 50 células por subpopulação, clique em Treinar Classificador e, em seguida, clique em Verificar Progresso. Por fim, clique em Pontuar tudo para gerar uma tabela com contagens de células para cada subpopulação.

Em uma cultura a frio heterocelular de células tumorais H3255 e CCD19LU fibroblastos, os núcleos foram identificados e segmentados com base na coloração de DNA. As populações de células foram classificadas por fluorescência induzida artificialmente ou treinamento em algoritmo de aprendizado de máquina para identificar tipos de células com base nas diferenças morfológicas. Existe uma alta concordância entre as metodologias baseadas em fluorescência e morfologia.

Os dois métodos de classificação foram independentemente implícitos nas mesmas imagens e concordaram 97,4% e 92,5% nas populações não tratadas e tratadas, respectivamente. Aqui, foram investigadas alterações na morfologia celular e na resposta ao tratamento com Erlotinibe. Após três dias de tratamento medicamentoso, foi observada uma diminuição na área dos núcleos e um aumento na área celular das células H3255.

Isso foi possivelmente devido à morte celular. Para testar se o erlotinibe tinha um efeito citotóxico ou citostático nas células, as células mortas foram identificadas com base na coloração com iodeto de propídio. Foram observados efeitos citotóxicos e citostáticos do Erlotinibe nas células H3255, com aumento do número de mortes e diminuição do número de nascimentos após o tratamento medicamentoso.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas não consecutivas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como interferência de RA ou CRISPR, podem ser realizados para abordar questões adicionais que investigam a genômica funcional. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer explorarem a influência das células estromais na progressão do tumor em vários tipos de câncer.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar as respostas heterocelulares a estímulos ambientais, especificamente como analisar dados de imagem baseados em microscopia de maneira de alto rendimento.