Novos Métodos para Estudar Codificação Gustatória

O objetivo geral desses métodos é estudar a codificação gustativa em um animal simples, o mandi-casecsta, registrando a atividade de múltiplos neurônios receptores in vivo, enquanto são administrados e monitorados pulsos precisamente cronometrados de substâncias gustativas. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a gustação, como a forma pela qual os sabores são codificados por populações de neurônios receptores gustativos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite registros in vivo de múltiplos neurônios gustativos antes, durante e após estímulos de substâncias gustativas precisamente aplicados.

Indivíduos novos neste método podem achar difícil realizá-lo porque o procedimento de dissecação é intricado. Por esse motivo, esperamos que a demonstração visual do método seja útil. Essas técnicas foram desenvolvidas por Sam Writer quando ele era estudante de pós-graduação no meu laboratório, juntamente com Alejandra, e Kui Sun demonstrará esses procedimentos.

Três dias após a eclosão, escolha uma mariposa de qualquer sexo que tenha aparência geralmente saudável. As asas devem estar totalmente estendidas, e a probóscide e as antenas devem estar bem formadas e intactas. Em uma capela de exaustão, insira a mariposa selecionada em um tubo de contenção até que a cabeça fique exposta.

Em seguida, imobilize a mariposa inserindo papel-toalha na outra extremidade do tubo. Agora, utilizando ar pressurizado proveniente de uma seringa, remova os pelos da cabeça exposta. Depois, coloque o tubo sobre uma plataforma de argila em uma placa de Petri.

Oriente a cabeça com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, proteja as antenas e o probóscide. Primeiro, faça coberturas para cada estrutura utilizando ponteiras de pipeta de 200 microlitros cortadas em comprimentos de meio centímetro.

Para manipular o probóscide, prepare um gancho a partir de um pedaço de arame. Estenda o probóscide para dentro de uma das tampas até que a parte mais próxima do probóscide esteja protegida. Fixe o tubo à parte dorsal da cápsula cefálica usando cera firme para batique.

Em seguida, separe cuidadosamente as antenas e fixe os tubos com cera de batique. Agora, estabilize o cérebro cortando o músculo compressor da fivela. Sob o microscópio de dissecação, use instrumentos de microdissecção para abrir a cápsula cefálica, fazendo um pequeno corte logo abaixo da probóscide.

Para confirmar que o músculo foi cortado, ofereça uma solução de sacarose ao terço distal do probóscide e, durante cinco minutos, certifique-se de que o probóscide não se estende. Em seguida, feche a cápsula cefálica usando uma camada de cera de batique derretida. Para perfundir o cérebro com solução salina, construa um copo de cera ao redor do lado ventral da cabeça.

Usando um cera elétrica, comece a construir um copo de cera ao longo da parte frontal da cabeça, movendo-se em direção à traseira. Mantenha os tubos do probóscide e das antenas dentro do copo. Continue construindo o copo para fora e para cima até que alcance o nível dos olhos.

Usando pinças, pegue as palpos labiais e fixe-os ao copo de cera com cera derretida. Em seguida, selar quaisquer aberturas no copo de cera e nos tubos usando uma camada fina de epóxi binário. Misture o epóxi usando um palito de dente.

Primeiro, cubra as superfícies externa e interna do copo. Em seguida, preencha a parte do tubo de contenção que envolve o pescoço, para que a cabeça seja mantida com mais firmeza. Após 20 minutos, verifique o copo quanto a vazamentos.

Para iniciar a cirurgia cerebral, primeiro remova os palpos labiais. Para abrir o lado ventral da cápsula cefálica, corte a cutícula ao longo da parte traseira e frontal da cabeça e ao redor dos olhos. Em seguida, corte ao longo da parte traseira da cabeça e faça mais cortes na parte frontal da cabeça, próximo ao probóscide.

Em seguida, levante suavemente a aba da cutícula com pinça para expor o cérebro. Agora, realize o passo mais crítico: expor a ZES e os nervos maxilares. Remova lentamente e com cuidado o tecido adiposo e a traqueia.

Lave o cérebro frequentemente com soro fisiológico fresco. Tenha muito cuidado, pois é muito fácil esmagar os nervos maxilares. Quando a ZES e os nervos maxilares finalmente estiverem visíveis, estarão cobertos por uma bainha fina.

Para remover esta bainha, drene qualquer salina em excesso e, em seguida, enfraqueça a bainha aplicando uma solução de colagenase dispase a 10%. Após a imersão por cinco minutos, enxágue a solução várias vezes com salina. Depois, após várias lavagens com salina, remova cuidadosamente a bainha utilizando pinças de microdissecação superfinas.

Por fim, fixe uma linha de gotejamento salino no copo de perfusão. Esta seção descreve como construir e utilizar um sistema de entrega de substâncias gustativas. O sistema é composto por um tubo de teste com várias aberturas.

As aberturas fornecem entrada para o probóscide do animal, o coletor de substâncias gustativas, um sensor de cor e permitem a passagem de água. Para construir este sistema, prepare primeiro um tubo de teste para o probóscide. Faça um orifício do tamanho do probóscide utilizando uma pistola de solda.

Em seguida, construa uma seção telada dentro do tubo para manter o probóscide no lugar. Corte cinco milímetros acima do orifício, coloque a malha no local com cera e reconecte os tubos usando cera e epóxi. Utilize um sistema de perfusão pressurizado para entregar os substâncias gustativas.

Conecte quantos tubos de substância gustativa forem necessários a um manifold. Para conectar o tubo de saída da substância gustativa, faça um orifício cerca de um centímetro acima da malha e, em seguida, fixe o tubo de saída a ele com epóxi. Em cada substância gustativa, inclua um corante artificial para ser detectado por um sensor de cor.

Fixe um sensor de cor ao aparelho em um orifício a meio centímetro acima da malha e fixe-o no local usando epóxi. Utilize uma bomba peristáltica para fornecer água destilada ao sistema por meio de tubo de silicone. Colete a água residual com um recipiente grande.

Use uma bomba pneumática para administrar os substâncias gustativas com jatos de ar. Agora, comece a bombear água limpa através da tubulação e administre pulsos de substância gustativa para testar o sensor de cor. Em seguida, introduza dois terços do probóscide da mariposa no tubo de teste.

Usando pinças, estenda a probóscide e empurre-a suavemente para dentro do orifício. Em seguida, fixe a probóscide no lugar com cera dental macia e uma camada de epóxi. Agora, conecte a linha de perfusão com soro fisiológico e ajuste o fluxo de perfusão.

Em seguida, imergir o eletrodo de terra do tetrodo de fios torcidos na banho salino. Depois, utilizando um micromanipulador, posicionar o tetrodo ao lado do nervo maxilar e avançá-lo lentamente para dentro do nervo. Após detectar sinais de potenciais de ação, deixar o preparo estabilizar por pelo menos 10 minutos antes de iniciar as gravações.

Registros foram realizados de neurônios receptores gustativos antes, durante e após a administração do tastante utilizando o protocolo descrito. O início e o término de um pulso de um segundo de cada tastante foram monitorados pelo sensor de cor. Os tastantes provocaram potenciais de ação que foram detectados por cada um dos quatro canais.

Nos trens de potenciais, podiam-se observar potenciais de ação individuais. Utilizou-se um software de classificação de potenciais para atribuir esses potenciais a neurônios únicos. A resposta de três neurônios receptores gustativos diferentes a seis substâncias gustativas administradas em sequência revela diferentes níveis de atividade de base e seletividade às substâncias gustativas.

Além disso, as respostas tinham diferentes durações. Algumas estão sincronizadas com a duração do estímulo, enquanto outras persistem após o término do estímulo. Registros intracelulares também podiam ser realizados nos axônios dos receptores gustativos utilizando eletrodos de vidro afiados convencionais.

Os registros intracelulares foram muito semelhantes às respostas observadas usando a técnica de tetrodo descrita, mas os registros com tetrodo foram mais fáceis de realizar, duraram mais tempo e foram mais robustos. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de expor os nervos maxilares e a zona subesofágica em mandi-casecsta, e ser capaz de montar um sistema de entrega de substâncias gustativas com controle temporal preciso. Ao realizar este protocolo, use luvas de segurança laboratorial e uma máscara facial, porque o pó fino em escamas liberado por mandi-casecsta pode ser alérgico.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em três horas e meia. Após este procedimento, também podem ser realizadas gravações simultâneas de múltiplas áreas cerebrais para responder a questões adicionais, como, por exemplo, como as respostas dos neurônios receptores gustativos aos substâncias gustativas são transformadas quando são transmitidas aos neurônios pós-sinápticos-alvo.