Novos métodos para estudar codificação gustativa

O objetivo geral desses métodos é estudar a codificação gustativa em um mandi-casecsta animal simples, registrando a atividade de vários neurônios receptores in vivo, enquanto fornece e monitora pulsos precisamente cronometrados de saborizantes. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre gustação, como como os provadores são codificados por populações de neurônios receptores gustativos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite gravações in vivo de vários neurônios gustativos antes, durante e depois de estímulos gustantes entregues com precisão.

Indivíduos novos neste método podem achar desafiador porque o procedimento de dissecção é complexo. Por isso, esperamos que a demonstração visual do método seja útil. Essas técnicas foram desenvolvidas por Sam Writer quando ele era um estudante de pós-graduação em meu laboratório, junto com Alejandra, Kui Sun demonstrará esses procedimentos.

Três dias após a eclosão, escolha uma mariposa de ambos os sexos que tenha uma aparência geralmente saudável. As asas devem estar totalmente estendidas e a tromba e as antenas devem estar bem formadas e intactas. Em uma hotte, insira a traça selecionada em um tubo de retenção até que a cabeça fique exposta.

Em seguida, imobilize a mariposa inserindo papel de seda na outra extremidade do tubo. Agora, usando ar pressurizado fornecido por uma seringa, remova o cabelo da cabeça exposta. Em seguida, coloque o tubo em uma plataforma de argila em uma placa de Petri.

Oriente o lado dorsal da cabeça para cima. Em seguida, proteja as antenas e a tromba. Primeiro, faça tampas para cada estrutura a partir de pontas de pipeta de 200 microlitros cortadas em comprimentos de meio centímetro.

Para manipular a tromba, prepare um gancho a partir de um pedaço de arame. Estenda a tromba em uma das tampas até que a parte mais proximal da tromba esteja protegida. Prenda o tubo na parte dorsal da cápsula da cabeça usando cera batik firme.

Em seguida, cubra cuidadosamente as antenas e prenda os tubos com cera batik. Agora, estabilize o cérebro cortando o músculo compressor da fivela. Sob o microscópio de dissecação, use ferramentas de microdissecção para abrir a cápsula da cabeça, fazendo um pequeno corte logo abaixo da tromba.

Para confirmar que o músculo foi cortado, ofereça solução de sacarose aos dois terços distais da tromba e, por cinco minutos, certifique-se de que a tromba não se estenda. Em seguida, feche a cápsula da cabeça usando uma camada de cera batik derretida. Para perfundir o cérebro com solução salina, construa um copo de cera ao redor do lado ventral da cabeça.

Usando uma cera elétrica, comece a construir um copo de cera ao longo da frente da cabeça, movendo-se para trás. Mantenha os tubos de tromba e antenas dentro do copo. Continue construindo o copo para fora e para cima até atingir o nível dos olhos.

Usando uma pinça, pegue os palpos labiais e prenda-os ao copo de cera usando cera derretida. Em seguida, sele todas as aberturas no copo de cera e nos tubos usando uma camada de coisa em epóxi binário. Misture o epóxi usando um palito.

Primeiro, cubra as superfícies externa e interna do copo. Em segundo lugar, preencha a parte do tubo de contenção ao redor do pescoço para que a cabeça fique mais firme. Após 20 minutos, verifique se há vazamentos no copo.

Para iniciar a cirurgia cerebral, primeiro corte os palpos labiais. Para abrir o lado ventral da cápsula da cabeça, corte a cutícula ao longo da parte de trás e da frente da cabeça e ao redor dos olhos. Em seguida, corte ao longo da parte de trás da cabeça e faça mais cortes ao longo da frente da cabeça, perto da tromba.

Em seguida, levante suavemente a aba da cutícula com uma pinça para expor o cérebro. Agora, execute a etapa mais crítica, expondo a SEZ e os nervos maxilares. Remova lenta e cuidadosamente o tecido adiposo e a traqueia.

Enxágue o cérebro frequentemente com solução salina fresca. Tenha muito cuidado, porque é muito fácil esmagar os nervos maxilares. Quando a SEZ e os nervos maxilares estiverem finalmente visíveis, eles serão cobertos por uma bainha fina.

Para remover esta bainha, drene o excesso de solução salina e, em seguida, enfraqueça a bainha aplicando uma solução de dispersão de colagenase a 10%. Após cinco minutos de imersão, enxágue a solução várias vezes com soro fisiológico. Em seguida, após vários enxágues com solução salina, remova suavemente a bainha usando uma pinça de microdissecção superfina.

Por fim, prenda uma linha de gotejamento salino no copo de perfusão. Esta seção descreve como criar e usar um sistema de entrega de saborizantes. O sistema consiste em um tubo de teste com várias aberturas.

As aberturas fornecem entrada para a tromba do animal, o coletor de saborizantes, um sensor de cor e permitem a passagem da flor pela água. Para construir este sistema, primeiro prepare um tubo de teste para a tromba. Faça um furo do tamanho de uma tromba usando um ferro de solda.

Em seguida, construa uma seção com tela dentro do tubo para manter a tromba no lugar. Corte cinco milímetros acima do buraco, coloque a malha com cera e reconecte os tubos usando cera e epóxi. Use um sistema de perfusão pressurizado para fornecer os saborizantes.

Junte quantos tubos de saborizante forem necessários a um coletor. Para conectar o tubo de saída do saborizante, faça um orifício cerca de um centímetro acima da malha e, em seguida, prenda o tubo de saída a ele com epóxi. Em cada sabor, inclua um corante artificial a ser detectado por um sensor de cor.

Conecte um sensor de cor ao aparelho em um orifício de meio centímetro ao redor da malha e prenda-o usando epóxi. Use uma bomba peristáltica para fornecer água destilada ao sistema por meio de tubos de silício. Colete as águas residuais com um recipiente grande.

Use uma bomba pneumática para fornecer aos saborizantes baforadas de ar. Agora, comece a bombear água limpa através da tubulação e forneça pulsos de saborizante para testar o sensor de cor. Agora, carregue os dois terços da tromba da mariposa no tubo de ensaio.

Usando uma pinça, estenda a tromba e empurre-a suavemente para dentro do orifício. Em seguida, sele a tromba no lugar com cera dental macia e uma camada de epóxi. Agora, conecte a linha de perfusão salina e defina o fluxo de perfusão.

Em seguida, mergulhe o eletrodo de aterramento do tetrodo de fio trançado no banho de solução salina. Em seguida, usando um micromanipulador, posicione o tetrodo próximo ao nervo maxilar e avance-o lentamente para dentro do nervo. Depois de detectar sinais de pico, deixe a preparação estabilizar por pelo menos 10 minutos antes de fazer as gravações.

As gravações foram feitas a partir de neurônios receptores gustativos antes, durante e após a entrega do saborizante usando o protocolo descrito. O início e o deslocamento de um pulso de um segundo de cada saborizante foram monitorados pelo sensor de cor. Os saborizantes provocaram picos que foram detectados por cada um dos quatro canais.

Dentro dos trens de pico, potenciais de ação individuais podem ser observados. O software de classificação de picos foi usado para atribuir esses picos a neurônios únicos. A resposta de três neurônios receptores gustativos diferentes a seis saborizantes entregues em sequência revela diferentes níveis de atividade basal e seletividade para os saborizantes.

Além disso, as respostas tiveram tempos diferentes. Alguns estão presos à duração do estímulo, enquanto outros duram mais do que o estímulo. Registros intracelulares também podem ser feitos a partir de axônios receptores gustativos usando eletrodos de vidro pontiagudos convencionais.

As gravações intracelulares foram muito semelhantes às respostas observadas usando a técnica de tetrode descrita, mas as gravações de tetrode foram mais fáceis de fazer, mais duradouras e mais robustas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de expor os nervos maxilares e a zona subesofágica em mandi-casecsta, e ser capaz de construir um sistema de entrega de saborizante com controle temporal preciso. Ao executar este protocolo, use luvas de segurança de laboratório e uma máscara facial, pois o pó fino derramado por mandi-casecsta pode ser alergênico.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em três horas e meia. Após este procedimento, gravações simultâneas de várias áreas do cérebro também podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como como as respostas dos neurônios receptores gustativos aos saborizantes são transformadas quando são transmitidas aos neurônios-alvo pós-sinápticos.