Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das HDAC-hemmende Potenzial von Verbindungen zu bestimmen und die Selektivität gegenüber HDAC6 oder HDAC1 in Zellen mittels eines einzigen ultraschnellen Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Assays zu ermitteln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelentwicklung zu beantworten, beispielsweise, ob ein HDAC-Inhibitor in lebenden Zellen selektiv für HDAC6 gegenüber den HDACs der Klasse I ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nur ein einziger Inkubationsschritt mit Zellen, Inhibitoren und selektiven Substraten erforderlich ist, um die Wirksamkeit gegenüber zwei HDAC-Isoformen gleichzeitig zu bestimmen.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die frühe Arzneimittelforschung selektiver HDAC-Inhibitoren, da sie erfasst, ob die HDAC6-Selektivität in lebenden Zellen erhalten bleibt, wodurch endogene Proteinacetylierungsassays vermieden werden. Obwohl diese Methode die Selektivität von HDAC-Inhibitoren in HeLa-Zellen bewertet, kann sie ebenfalls auf andere Zelllinien wie primäre und andere Tumorzellen, einschließlich klinischer Proben, angewendet werden. Kultivieren Sie HeLa-Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 % in einem T75-Zellkulturgefäß in minimal essentiellen Medien, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, Penicillin G und Streptomycin.

Die Zellen zweimal mit je fünf Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung waschen. Anschließend den Puffer abziehen und ein Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzufügen. Zum Lösen der Zellen fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach fünf Minuten neun Milliliter MEM-Kulturmedium zu den Zellen geben und die Zellsuspension gründlich resuspendieren. Die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführen und anschließend die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Die Dichte der Zellsuspension in MEM auf 60.000 Zellen pro Milliliter einstellen.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter der Zellsuspension in die Kontroll- und Testöffnungen einer sterilen, flachen, zellkulturgeeigneten 96-Loch-Platte hinzu. Danach geben Sie 100 Mikroliter MEM-Kulturmedium in die Leeröffnungen der 96-Loch-Platte. Inkubieren Sie die 96-Loch-Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 96-Loch-Platte. Vermeiden Sie beim Absaugen des Mediums, dass Zellen von der Vertiefung abgelöst und entfernt werden. Dies kann erreicht werden, indem eine niedrige Absauggeschwindigkeit verwendet und die Absaugspitzen sorgfältig in die untere Ecke der Vertiefungsoberfläche platziert werden.

Fügen Sie anschließend 25 µL der zweifach konzentrierten Testverbindungen in MEM zu den Testansätzen hinzu, einschließlich Trichostatin A, MS275 und Tubastatin A. Geben Sie 25 µL MEM zu den Kontroll- und Blindansätzen hinzu. Fügen Sie danach 25 µL der Substratmischung zu den Kontroll- und Testansätzen hinzu. Geben Sie anschließend 25 µL MEM zu den Blindansätzen hinzu.

Die 96-Well-Platte acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Um die Zelllyse durchzuführen, zunächst 10 Mikroliter sechsfach RIPA-Puffer, ergänzt mit Proteaseinhibitor, in jedes Well der 96-Well-Platte geben. Die Reaktion durch Zugabe von 160 Mikrolitern kaltem Acetonitril zu jedem Well stoppen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen.

Stellen Sie die Platte 10 Minuten lang in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus dem Gefrierschrank und übertragen Sie 220 Mikroliter des Inhalts jedes Wells in eine nicht sterile, konische 96-Well-Platte mit kegelförmigem Boden. Zentrifugieren Sie die Platte bei 5.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Nach der Zentrifugation 200 Mikroliter Überstand in eine mit dem UHPLC-System kompatible 96-Well-Platte überführen. Anschließend die Platte mit ablösbarer Wärmesiegel-Folie mittels eines Plattenversiegelers versiegeln. Das System der Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie vorbereiten, indem es mit dem mobilen Phasensystem befüllt wird.

Platzieren Sie die 96er-Platte in einen Probengeber, der einen Plattenhalter enthält. Führen Sie die Probenanalyse gemäß den im Text angegebenen UHPLC-ESI-MS/MS-Bedingungen durch. Zur Datenanalyse integrieren Sie die Peakfläche jedes Substrats und seines deacetylierten Produkts mit der entsprechenden UHPLC-Integrationssoftware.

Bestimmen Sie für jedes Substrat das Peakflächenverhältnis von deacetyliert zu acetyliert in jedem Chromatogramm. Schließen Sie die Test- und Kontrollproben ein. Berechnen Sie abschließend die prozentuale HDAC-Hemmung jeder Testprobe gemäß der Gleichung im textlichen Protokoll.

Das UHPLC-MS-Chromatogramm einer Probe wird hier dargestellt. Die Peaks, die den in die Zellen gegebenen Substraten entsprechen, werden gemäß ihrer Massenübergänge detektiert, wie in Tabelle eins des schriftlichen Protokolls beschrieben. MOCPAC wird durch HDAC1 deacetyliert, wodurch der Peak des deacetylierten MOCPAC entsteht.

Ebenso wird BATCP durch HDAC6 deacetyliert und erzeugt so den deacetylierten BATCP-Peak. Schließlich liefert MAL den deacetylierten MAL-Peak, der die Deacetylierung mehrerer endogener HDACs unspezifisch widerspiegelt. Gezeigt ist hier die Abbildung mit dem Chromatogramm, das mit verschiedenen Konzentrationen des HDAC-Inhibitors Trichostatin A erhalten wurde. Eine Dosis-Wirkungs-Analyse gängiger HDAC-Inhibitoren wurde durchgeführt.

Die integrierten Werte, die aus MOCPAC und dMOCPAC erhalten wurden, wurden verwendet, um die Wirksamkeit von Standardinhibitoren gegen HDAC1 zu berechnen. Nach der Berechnung der IC50-Werte zeigte MS275, ein selektiver Inhibitor der Klasse-I-HDAC, niedrigere IC50-Werte für HDAC1 als Tubastatin A, ein bekannter HDAC6-Inhibitor. Andererseits wurden die isolierten Werte aus BATCP und dBATCP verwendet, um die Wirksamkeit der Standardsubstanzen gegen HDAC6 zu berechnen.

Dieses Mal lieferte Tubastatin A einen niedrigeren IC50-Wert als MS275, was deren Isoformenselektivitätsprofil bestätigt. Trichostatin A ist ein potenter, nichtselektiver Inhibitor. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 72 Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Zellbehandlungszeit und der Analyse der 96-Well-Platte.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die hier angegebenen Inkubationszeiten für HeLa-Zellen gelten. Bei Verwendung einer anderen Zelllinie müssen diese optimiert werden. Mit diesem Verfahren könnten anschließend die selektiven HDAC-hemmenden Aktivitäten anderer Isoformen gemessen werden, sofern spezifische Substrate vorhanden sind.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln und anderen Chemikalien äußerst gefährlich sein kann und Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel stets getragen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.