Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral
31 de julho de 2017
O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO 2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .
O objetivo geral do tratamento da acidose em um modelo de corte corticoestriatal em um modelo de oclusão da artéria cerebral média é estudar o efeito neuroprotetor do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre como a acidose pós-condicionamento pode proteger a lesão cerebral isquêmica e desenvolver uma nova estratégia para a terapia do AVC. A principal vantagem desta técnica é poder usar modelos de experimentos amplamente disponíveis para estudar a neuroproteção da acidose pós-condicionamento.
Demonstrando o procedimento estará Yarong Zheng, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece removendo o cérebro do crânio de um camundongo decapitado com uma espátula fina e jogando-o cuidadosamente em um copo contendo ACSF regular gelado equilibrado com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Aplique cola crioprecipitada na placa vibratone em duas tiras.
Coloque um pedaço de agarose a três por cento na tira de cola mais distante da lâmina para apoiar o cérebro. Em seguida, use uma pinça para transferir o cérebro para o papel de filtro. Corte o pólo frontal e o cerebelo com uma lâmina.
Coloque o tecido cerebral verticalmente na tira livre de cola com o cérebro encostado na agarose. Adicione ACSF gelado ao reservatório de corte para submergir o cérebro e adicione gelo à área do suporte de gelo. Mantenha o ACSF no reservatório borbulhando com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.
Depois de configurar o vibratone para cortar seções de 400 mícrons e posicionar corretamente o cérebro em relação à lâmina de corte, pressione o botão start-stop para iniciar o corte automático. Use uma pipeta Pasteur com uma ponta cortada para transferir cinco fatias de cérebro, uma a uma, e coloque-as no suporte de tecido em ACSF regular gelado borbulhado com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Após 30 minutos em temperatura ambiente, coloque as fatias do cérebro em banho-maria a 37 graus Celsius por dez minutos para recuperar a função sináptica.
Coloque o ACSF livre de glicose e o ACSF ácido no banho-maria a 37 graus Celsius e borbulhe as soluções com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de nitrogênio e 20 por cento de dióxido de carbono e 80% de oxigênio, respectivamente, por 30 minutos. Transfira cuidadosamente quatro das cinco fatias de cérebro para um ACSF pré-aquecido a 37 graus Celsius, sem glicose, e incube por 15 minutos. Para estudar a janela de tempo para o pré-condicionamento ácido, transfira uma fatia diretamente do ACSF livre de glicose para o ACSF ácido e transfira as outras três fatias para o ACSF regular para reperfusão.
Após três minutos, transfira a fatia em ACSF ácido para ACSF normal. Em seguida, após cinco minutos em ACSF regular, transfira uma das fatias do ACSF regular para o suporte de tecido em ACSF ácido por três minutos. Transfira outra fatia da mesma maneira 15 minutos após a reperfusão.
A fatia restante que foi colocada em ACSF livre de glicose, mas não em ACSF ácido, é definida como o grupo de privação de glicose de oxigênio. Transfira as fatias do ACSF para os poços de uma placa de 24 poços contendo a solução TTC. Estique a fatia na solução.
Em seguida, incube a 37 graus Celsius em banho-maria raso por 30 minutos. Em seguida, transfira as fatias para tubos de centrífuga limpos e pesados de 1,5 mililitro cobertos com papel alumínio e meça o peso seco das fatias. Após a pesagem, extraia Formazan adicionando uma solução de etanol e sulfóxido de dimetila aos tubos em uma relação volume/peso de 10 para um.
Incubar longe da luz por 24 horas. No dia seguinte, transfira a solução de etanol dimetilsulfóxido dos tubos para uma placa de 96 poços e meça a absorbância em 490 nanômetros usando um leitor de placas. Primeiro, confirme a anestesia adequada pela ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé.
Em seguida, coloque o camundongo anestesiado com a sonda LDF presa ao crânio em decúbito dorsal e fixe com fios de algodão estéreis. Desinfete a pele raspada do pescoço com álcool etílico 75%. Então, depois de fazer uma incisão na pele perimediana no pescoço, dissecar os tecidos moles com uma pinça para expor os vasos sanguíneos.
Adicione uma gota de solução salina aos tecidos expostos para mantê-los hidratados. Em seguida, use uma pinça oftálmica para dissecar a artéria carótida comum do tecido circundante e do nervo vago. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago.
Coloque uma pinça de microvaso na extremidade distal da artéria carótida comum. E dê um nó morto com suturas de seda 6-0 na extremidade proximal. Em seguida, dê um nó solto proximal ao grampo como uma sutura temporária.
Em seguida, use uma tesoura microoftálmica para fazer uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós o mais próximo possível do nó morto. Agora insira um monofilamento embotado de 12 milímetros através da incisão no lúmen da artéria e avance-o alguns milímetros. Aperte o nó solto ao redor da ponta do monofilamento e, em seguida, remova o clamp.
Em seguida, use uma pinça oftálmica para avançar o filamento na artéria carótida interna até que o software LDF mostre um declínio acentuado no fluxo sanguíneo. Registre a hora de início da oclusão. Em seguida, corte a sonda LDF e coloque o camundongo em uma incubadora de 30 graus Celsius durante a duração de uma hora de oclusão.
55 minutos após o início da oclusão, reanestesiar o animal com isoflurano e posicioná-lo como antes. Em seguida, abra a incisão no pescoço e reexponha a artéria carótida comum. Após o período de oclusão, use uma pinça oftálmica para puxar suavemente o filamento para obter a reperfusão.
Em seguida, transforme a sutura temporária em permanente, apertando o nó. Para o tratamento da acidose, altere o gás inalado pelo cone do nariz para 20% de dióxido de carbono, 20% de oxigênio e 60% de nitrogênio por cinco minutos. Depois de fechar a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida, coloque o camundongo em uma gaiola aquecida a 30 graus Celsius até que o camundongo recupere a consciência.
Este histograma mostra os resultados do ensaio TTC realizado em fatias corticais após privação de oxigênio, glicose e pós-condicionamento ácido, conforme demonstrado neste vídeo. Três minutos de tratamento com acidose foram neuroprotetores se o tratamento foi iniciado imediatamente ou cinco minutos após a privação de glicose de oxigênio, mas não se as fatias foram reperfundidas por 15 minutos. Os camundongos foram submetidos a 60 minutos de oclusão da artéria cerebral média e tratados com a inalação de dióxido de carbono a 20% por cinco minutos aos cinco, 50 ou 100 minutos após a reperfusão.
O volume do infarto foi quantificado por duas, três, cinco colorações com cloridrato de trifeniltetrazólio 24 horas após a reperfusão, conforme indicado pelas linhas pontilhadas pretas. Este histograma mostra a porcentagem de volume de infarto para cada condição. A neuroproteção do pós-condicionamento ácido foi robusta mesmo quando o tempo de início foi adiado para 50 minutos após a reperfusão.
No entanto, o tratamento da acidose iniciado aos 100 minutos não bloqueou a lesão isquêmica. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a neuroproteção do pós-condicionamento da acidose no modelo OGD de fatias cerebrais e no modelo MSO de camundongos. Ao tentar os procedimentos, é importante lembrar que a extensão e a duração da acidose são muito importantes para reproduzir os efeitos protetores.
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Visão Geral
Este estudo investiga os efeitos neuroprotetores da pós-condicionamento ácido (APC) contra a isquemia cerebral utilizando dois modelos. O primeiro modelo envolve a transferência de fatias corticoestriatais para um tampão ácido após a privação de oxigênio e glicose in vitro, enquanto o segundo modelo utiliza a inalação de 20% de CO2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Terapia para AVC
- Neuroproteção
Antecedentes
- A pós-condicionamento ácido é uma abordagem inovadora para proteger contra lesões cerebrais isquêmicas.
- Compreender os mecanismos do tratamento da acidose pode levar a novas estratégias terapêuticas.
- O estudo utiliza modelos experimentais amplamente disponíveis para a pesquisa.
- Questões fundamentais sobre os efeitos neuroprotetores da acidose são abordadas.
Objetivo do Estudo
- Explorar como o pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral.
- Desenvolver novas estratégias para a terapia do acidente vascular cerebral.
- Utilizar modelos experimentais para estudar a neuroproteção.
Métodos Utilizados
- Modelo in vitro utilizando fatias corticoestriatais.
- Modelo in vivo envolvendo oclusão da artéria cerebral média.
- Aplicação de tampão ácido e inalação de CO2.
- Uso de cola de crioprecipitado na montagem experimental.
Resultados Principais
- Demonstrou os efeitos neuroprotetores da APC em ambos os modelos.
- Forneceram informações sobre os mecanismos do tratamento da acidose.
- Mostrou a viabilidade do uso de modelos experimentais comuns.
- Destacou as aplicações potenciais na terapia de acidente vascular cerebral.
Conclusões
- A pós-condicionamento ácido oferece uma abordagem promissora para atenuar lesões cerebrais isquêmicas.
- É necessário realizar mais pesquisas para compreender plenamente seus mecanismos.
- Essa técnica poderá levar a avanços nas estratégias de tratamento do acidente vascular cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A pós-condicionamento ácido (APC) oferece uma abordagem baseada em mecanismos para avaliar estratégias neuroprotetoras em modelos de isquemia cerebral. Ao utilizar sistemas in vitro e in vivo amplamente disponíveis, o APC permite a validação precoce de alvos e a investigação de vias para terapêuticas contra o acidente vascular cerebral. Isso reforça a confiança preditiva na identificação de compostos promissores, associando a proteção mediada pela acidose à redução do infarto e aos resultados de viabilidade tecidual.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas sobre a neuroproteção mediada por acidose em lesões isquêmicas.
- Valor Operacional: Utiliza modelos de fatia corticoestriatal e MCAO para validar o engajamento do alvo e a redução de riscos biológicos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólio ao associar o momento da administração da APC à redução do volume de infarto e à viabilidade tecidual.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos por meio de paradigmas de DGO e reperfusão.
- Valor Operacional: Permite ensaios padronizados e reprodutíveis utilizando coloração com TTC e quantificação do peso seco.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em modelos murinos in vitro de fatias e in vivo para leituras consistentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a relevância da doença por meio de modelos de isquemia focal mediada por MCAO e de OGD corticoestriatal.
- Valor Operacional: Garante a continuidade translacional dos mecanismos baseados em fatias para os resultados de infarto em animais inteiros.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao mostrar que a eficácia da APC é dependente do tempo, com perda da proteção após atraso de 100 minutos na reperfusão.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A APC insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação de eficácia pré-clínica, fornecendo um método reprodutível para avaliar candidatos neuroprotetores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a acidose como moduladora pós-isquêmica da evolução do infarto.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas orientadas por pontos finais (absorbância de TTC, volume de infarto) para comparação de compostos.
- Análises: Permite a comparação estatística da neuroproteção em diferentes janelas temporais (reperfusão imediata, 5 min, 15 min, 50 min, 100 min).
- Pesquisa Translacional: Conecta a proteção em fatias in vitro à redução de infarto in vivo, apoiando o avanço alinhado a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de diversos agentes neuroprotetores sob condições isquêmicas padronizadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Proporciona desvio de risco mecanicista ao isolar a acidose como uma variável protetora na lesão por isquemia-reperfusão.
- Valor Operacional: Utiliza modelos acessíveis (fatias de camundongo, MCAO) e reagentes padrão (ACSF, TTC, CO2) para garantir reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao identificar intervenções ineficazes precocemente (por exemplo, APC aos 100 min não mostra proteção).
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis neuroprotetores dependentes do tempo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia murina, cortes cerebrais e protocolos de isquemia-reperfusão.
- Depende de controle preciso de gases (20% CO2, equilíbrio O2/N2) e soluções com temperatura regulada (banhos de água a 37°C).
- Necessita padronização do tempo de reperfusão e da duração da acidose entre os braços in vitro e in vivo.
- Deve levar em consideração a variabilidade na coloração com TTC e na quantificação do infarto ao comparar condições.
- Limitado a modelos de isquemia aguda; condições crônicas ou comorbidades não são abordadas no material original.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Cortical Slice Preparation
2:43
Oxygen-glucose Deprivation and Acidic Postconditioning
4:03
Determination of Slice Viability
5:04
Middle Cerebral Artery Occlusion
7:22
Reperfusion and Acidic Postconditioning
8:16
Results: Acidic Preconditioning Protects Against Reperfusion Injury
9:32
Conclusion
