Name: Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda os efeitos neuroprotetores do pós-condicionamento ácido contra isquemia cerebral usando modelos in vitro de fatias corticostriatais e in vivo de oclusão da artéria cerebral média em camundongos.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 e 81402907), Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang (LR15H310001) e o Programa para a equipe líder de Zhejiang da equipe de inovação S &amp; T (2011R50014).

Todos os experimentos foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Zhejiang e estavam em completa conformidade com os Institutos Nacionais de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Foram feitos esforços para minimizar qualquer dor ou desconforto, e o número mínimo de animais foi usado. 1. OGD de fatias Corticostriatal <ol><li> Preparação da solução: <ol><li> Preparar 1000 ml de r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH 2 PO 4, 2 mmol / L de MgSO4, 26 mmol / L NaHCO3, 2 mmol / L de CaCl 2, 10 mmol / L de glicose, pH final 7,4). Bolha com 5% de CO 2 e 95% de O 2 ao longo da experiência. </li><li> Preparar 200 mL ACSF sem glicose (GF-ACSF) como acima mas excluindo a glucose, borbulhar com 5% de CO 2 e 95% de N2. Bolha os gases por 30 min antes de aplicar para brEm fatias para reduzir o teor de oxigênio na solução. Continue borbulhando até o procedimento OGD terminar. </li><li> Prepare ácida ACSF (a-ACSF) equilibrando 200 ml de r-ACSF com 20% de CO 2 e 80% de O 2. Bolha os gases durante 30 minutos antes de aplicar a fatias do cérebro para reduzir o pH da solução para pH 6.8 e continuar borbulhando até o procedimento APC terminar. </li><li> Coloque três suportes de tecido em r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivamente. </li></ol></li><li> Preparação da fatia do cérebro: Nota: foram utilizados camundongos C57Bl / 6J de oito semanas de idade neste estudo. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), com um período de ciclo de luz-escuro de 12 h e acesso a alimentos e água com sedimentos. <ol><li> Sacrifique um mouse com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite o mouse. Dissecesse o cérebro usando pequenas tesouras e fórceps. Remova o cérebro com uma espátula fina e coloque-o cuidadosamente em um copo de vidro comtenção gelada r-ACSF equilibrada com 5% de CO 2 e 95% de O 2. NOTA: Estas etapas devem ser feitas de forma rápida, mas meticulosamente possível. </li><li> Mantenha o cérebro no r-ACSF gelado por 5 min. Ajuste a pressão do gás para evitar movimentos do cérebro. </li><li> Coloque cola de crioprecipitado na placa de vibração em duas tiras. Coloque um pedaço de agarose a 3% sobre a tira de cola para longe da lâmina para suportar o cérebro. </li><li> Inverta uma placa de Petri de 10 cm sobre gelo e depois coloque um papel de filtro no prato. Humedecer o papel de filtro com gotas de r-ACSF geladas. </li><li> Transfira o cérebro para o papel de filtro com fórceps. Corte o poste frontal e o cerebelo com lâmina e pinça. NOTA: As seções transversais devem ser tão lisas quanto possível e vertical para o plano sagital. </li><li> Coloque o tecido cerebral restante verticalmente sobre a outra tira de cola e mantenha o cérebro encostado à agarose. Adicione o r-ACSF gelado ao reservatório de corte paraMergulhe o cérebro e adicione gelo na área do suporte de gelo. Manter o r-ACSF no reservatório borbulhar com 5% de CO 2 e 95% de O 2. </li><li> Levante o reservatório e ajuste a posição da navalha para colocar a navalha tão perto do cérebro quanto possível e logo acima do cérebro. </li><li> Escolha o modo &quot;CONT&quot; para cortar as seções do cérebro continuamente. Defina a espessura de corte para 400 μm, a freqüência de vibração para 6 a 8 e a velocidade para 3 - 4. Pressione o botão &quot;iniciar / parar&quot; para iniciar o corte automático. </li><li> Corte a ponta de uma pipeta Pasteur de 3 mL para fazer uma abertura correspondente ao tamanho das fatias do cérebro. NOTA: A abertura deve ser grande o suficiente para evitar danos adicionais nas fatias do cérebro. </li><li> Extrair cinco fatias de cérebro de um por um, com a pipeta de ponta-cutPasteur e colocá-los no suporte do tecido em gelada r-ACSF borbulhar com 5% de CO 2 e O 2 95%. Não colete a primeira fatia produzida. Ajuste a pressão do gás para avoiD movimentos das fatias do cérebro. NOTA: As fatias do cérebro não devem cobrir uma a outra. </li><li> Coloque fatias de cérebro com r-ACSF à temperatura ambiente durante 30 min e depois a 37 ° C em banho-maria por mais 10 min para recuperar funções sinápticas. </li></ol></li><li> OGD e APC: <ol><li> Coloque gf-ACSF e a-ACSF em um banho-maria a 37 ° C e borbulhe os tampões com os gases correspondentes, conforme mencionado acima em 1.1.2 e 1.1.3 durante 30 min. </li><li> Deixe uma fatia no r-ACSF como um controle. Transfira as outras quatro fatias de cérebro no suporte de tecido com gf-ACSF pré-aquecido com cuidado e incube durante 15 min. Transfira as fatias de volta para o suporte de tecido em r-ACSF para obter reperfusão. </li><li> Para estudar a janela de tempo da APC, transfira uma fatia diretamente de gf-ACSF para a-ACSF. Transfira as outras três fatias para o r-ACSF em primeiro lugar, e depois transfira duas delas para o suporte de tecido em a-ACSF 5 e 15 min após a reperfusão, respectivamente. </li><li> IncubatE as duas fatias em a-ACSF por 3 min e depois transferi-las de volta para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h. Defina as restantes fatias no r-ACSF como o grupo OGD. </li><li> Para um estudo de resposta à dose, transferir as quatro fatias para o suporte de tecido em r-ACSF no início após OGD e incubar durante 5 min. Em seguida, deixe uma fatia no r-ACSF como o grupo OGD e transfira as outras três fatias para a-ACSF. Incubar as fatias em a-ACSF por 1, 3 e 5 min, respectivamente, e depois transferi-las para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h. </li></ol></li><li> Determinação da viabilidade da fatia: <ol><li> Preparar 0,25% de solução salina normal de cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Adicione 1,25 g de pó de TTC a 500 ml de solução salina normal. NOTA: Depois que o pó se dissolver completamente, transfira a solução para uma placa de 24 poços (500 μL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C. TTC e tecido corado com TTC são light senSitive. </li><li> Transfira as fatias para uma placa de 24 poços (uma fatia por poço) contendo solução de TTC e estique a fatia na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min. </li><li> Transfira as fatias para limpar os tubos de centrífuga de 1,5 mL cobertos com papel alumínio e medir o peso seco das fatias. </li><li> Adicionar etanol / sulfóxido de dimetilo (1: 1) nos tubos da centrífuga (v: w = 10: 1) para extrair o formazan. Incubar as fatias em etanol / dimetilsulfóxido à temperatura ambiente longe da luz durante 24 h. </li><li> Adicione todo o etanol / sulfóxido de dimetilo nos tubos em uma placa de 96 poços e mede a absorvância a 490 nm por um leitor de placas. </li><li> Normalize a absorvância para o peso seco da fatia e viabilidade expressa como a porcentagem da fatia de controle. </li></ol></li></ol> 2. MCAO <ol><li> Preparação: <ol><li> Desinfecte o banco de trabalho, a superfície do Doppler Laser FlowmetrY (LDF) e seus acessórios com 70% de álcool etílico. </li><li> Preparar instrumentos autoclavados: duas tesouras, 10 cm; Duas fórceps, 10 cm; Uma pinça oftálmica, 11 cm; Uma tesoura micro oftálmica, 9 cm; Uma braçadeira de microvento, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Várias suturas cirúrgicas (△ 1/2 4 × 10); cotonetes. </li><li> Prepare uma seringa (sem agulha) com solução salina para manter uma área de operação hidratada. </li><li> Prepare o gás de anestesia (100% O 2 + isoflurano). </li></ol></li><li> Detecção do fluxo sanguíneo cerebral: <ol><li> Configure o instrumento LDF. </li><li> Injete analgésicos por via intraperitoneal no mouse: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg e buprenorfina 0,1 mg / kg. </li><li> Coloque o mouse em uma câmara de indução com 4% de isoflurano em oxigênio para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibração parem. </li><li> Coloque o mouse em posição inclinada com o nariz encaixado naE cone de nariz e manter isoflurano a 1,5% para o procedimento subseqüente. </li><li> Aplique pomada de dexpantenol em ambos os olhos. </li><li> Desinfecte a cabeça com 70% de álcool etílico. </li><li> Faça uma incisão da pele paramediana direita entre olhos e ouvidos usando um bisturi para expor o bregma. </li><li> Esfregue o crânio com algodão estéril. </li><li> Aplique uma a duas gotas de cola cirúrgica na superfície do crânio. </li><li> Coloque a ponta da sonda de fibra óptica de 5 mm caudal para a bregma e 6 mm lateral à linha média. </li><li> Comece a gravar o fluxo sanguíneo no software do computador. Aguarde até ocorrer uma linha de base estável do fluxo sanguíneo e aplique um catalisador de 20 μL sobre a cola para consertar a sonda. NOTA: uma linha de base ideal deve ser mais de 500 fluxos. </li><li> Se a linha de base for inferior a 200 fluxos, ajuste a posição finamente para obter uma linha de base adequada. Mantenha a sonda unida ao crânio durante a duração da experiência. </li><li> Desinfecte a cabeça com iodophor afTer a sonda de fibra óptica anexada. </li></ol></li><li> MCAO: <ol><li> Coloque e repare o mouse anestesiado (com a sonda LDF anexada ao crânio) em posição supina e mantenha a temperatura do corpo usando uma lâmpada de calor ao longo da cirurgia. Desinfecte o pescoço com 70% de álcool etílico. </li><li> Faça uma incisão cutânea paramediana no pescoço usando um bisturi; Dissimulam os tecidos moles com fórceps para expor os vasos. Adicione uma gota de solução salina aos tecidos expostos para mantê-los hidratados. </li><li> Dissecar a artéria carótida comum do tecido circundante e do nervo vago usando pinça oftálmica. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Desinfecte novamente a pele do pescoço com iodóforo após exposição à artéria carótida comum. </li><li> Coloque uma braçadeira de microvasos na extremidade distal da artéria carótida comum e, em seguida, amarre um nó morto com suturas de seda 6-0 na extremidade proximal. Coloque o grampo o mais proximamente possível para operações subsequentes. Certifique-se de que o comprimento deO recipiente entre o grampo eo nó morto é o maior tempo possível para as operações subsequentes. </li><li> Faça uma sutura temporária proximal ao grampo, amarrando um nó solto. Certifique-se de que haja espaço suficiente entre dois nós para a inserção de monofilamentos. </li><li> Faça uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós com tesoura micro-oftálmica. Certifique-se de que a incisão seja tão próxima ao nó morto quanto possível para as operações subsequentes. Tenha cuidado para não cortar a embarcação. </li><li> Insira um monofilamento com mola de 12 mm com a incisão para entrar no lúmen da artéria e avance-o alguns mm. Aperte o nó solto em torno da ponta do monofilamento e retire o grampo. </li><li> Avance o filamento para a artéria carótida interna (10 mm para ocultar a artéria cerebral média) com pinça oftálmica até o software LDF mostrar um declínio acentuado (&gt; redução de 80% no fluxo sanguíneo basal) no fluxo sanguíneo. Registre o tempo de início da oclusão. NOTA: a configuração do instrumento LDF éDescrito na seção 2.2. </li><li> Ocultar a artéria cerebral média durante 1 h. Corte a sonda LDF e coloque os ratos em uma incubadora de 30 ° C durante o período de oclusão. </li></ol></li><li> Reperfusão e APC: <ol><li> Re-anestesiar os animais com isoflurano como descrito acima 55 minutos após o início da oclusão. Coloque e repare ratos em posição supina. Abra a incisão do pescoço e reexponha a artéria carótida comum. </li><li> Retire suavemente o filamento com pinça oftálmica após o período de oclusão para obter reperfusão e torne a sutura temporária em permanente, apertando o nó. </li><li> Para o tratamento de acidose, mudar o gás inalado pelo cone de nariz para os gases de mistura contendo 20% de CO2, 20% de O2 e 60% de N 2 durante 5 min a 5, 50, ou 100 minutos após a reperfusão. Feche a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida. </li><li> Coloque ratos em uma gaiola de calor a 30 ° até que os ratos recuperem a consciênciaE depois devolver os ratos para limpar, gaiolas individuais. Forneça ratos com uma placa de Petri de água e alimentos umedecidos. Monitore os ratos de perto após a cirurgia por dor excessiva e morte. </li></ol></li><li> Medição do volume do infarto do cérebro: <ol><li> Medir o volume do infarto cerebral usando TTC coloração 24 h após a reperfusão. </li><li> Prepare a solução TTC de 0,25% como mencionado no passo 1.4.1 antes do tempo designado de sacrifício. Transfira a solução para uma placa de 24 poços (1 mL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C. NOTA: TTC e tecido corado com TTC são sensíveis à luz. </li><li> Às 24 h após a reperfusão, sacrificar o animal com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite os ratos. Dissie os cérebros usando pequenas tesouras e fórceps. Examine os pontos de sangue nos cérebros para excluir os ratos submetidos a hemorragia subaracnóidea no círculo de Willis. </li><li> Coloque o cérebro em um slide de vidro limpo em -20 °<html> C embalagem de gelo. Coloque o cérebro e o vidro deslize em um refrigerador de -20 ° C por 5 minutos para facilitar o corte do cérebro. </li><li> Retire o cérebro eo vidro deslize de -20 ° C e coloque-os de volta no pacote de gelo de -20 ° C. Dissecar o pólo frontal e o cerebelo com lâmina e pinça. </li><li> Corte as seções do cérebro horizontalmente até uma espessura de 1 mm com uma lâmina para produzir 5 fatias. Transfira as fatias para dentro da placa de 24 poços contendo solução TTC (1 fatia por poço) com fórceps e estique as fatias na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min. </li><li> Aspirar a solução TTC. Adicione 10% de formaldeído (1 mL por poço) e incuba à temperatura ambiente durante 30 min. Coloque as fatias na ordem em que foram cortadas em uma folha de celofane e digitalizar os segmentos na imagem fotográfica fotográfica. </li><li> Analise o tamanho do infarto como uma porcentagem de toda a fatia do cérebro usando o software de análise ImageJLass = &quot;xref&quot;&gt; 8 com base na identificação visual; Veja a Figura 2 (esquerda). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrupting+reperfusion+as+a+stroke+therapy%3A+ischemic+postconditioning+reduces+infarct+size+after+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).</li>
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<li>Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+the+neuroprotective+effect+of+propofol+on+hypoxic+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Inj%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice.</a> Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. Em fatias de cérebro, a APC é conseguida através da incubação de fatias corticostriatais de camundongos em tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 após o início da reperfusão, enquanto que no modelo MCAO, a APC é conseguida inalando 20% de CO 2 para ratos após reperfusão. Ambos os modelos refletem a neuroproteção da APC contra a isquemia cerebral. A proteção foi comparável à alcançada pelo pós...

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Grandes esforços foram feitos para encontrar tratamentos efetivos para AVC nas últimas décadas, no entanto, a conquista é bastante insatisfatória. O pós-condicionamento é um processo manipulado por tensões subtoxicas após um episódio isquêmico. O pós-condicionamento, incluindo o pós-condicionamento isquêmico, hipóxico, baixo teor de glicose e remoto, desencadeia mecanismos adaptativos endógenos e provou ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral 1 , 2 , 3 , 4 . Contudo, o pós-condicionamento isquêmico pode introduzir lesões adicionais. O pós-condicionamento isquêmico remoto dos membros geralmente precisa de vários ciclos de 5 a 20 min de oclusão e reperfusão nos membros traseiros ipsilaterais ou bilaterais 5 , 6 , 7 . ºPortanto, essas manipulações pós-condicionamento são perigosas ou impraticáveis ​​na prática clínica. Para superar essas desvantagens, desenvolvemos APC como terapia para isquemia cerebral focal em camundongos 8 . Induzido simplesmente por inalação de 20% de CO 2 , APC reduz significativamente a lesão cerebral isquêmica de uma maneira mais viável e segura. Recentemente, provamos que a APC estende a janela de reperfusão, destacando o significado da APC para terapia de AVC 9 . Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. O primeiro é o modelo de privação de oxigênio-glicose (OGD) em fatias corticostriatais de camundongos. A rápida preparação e transferência das fatias do cérebro para um ambiente artificial, geralmente fluido cerebrospinal artificial (ASCF), pode manter a viabilidade celular e circuitos neuronais, o que possibilita o estudo da função cerebral in vitro 10 &lt;Sup&gt; 11 . OGD em ASCF imita a isquemia cerebral e induz a lesão isquêmica 12 , 13 , 14 . Após OGD, as fatias de cérebro são atualizadas em ASCF (r-ASCF) regulares para fornecer reperfusão e depois tratadas com APC usando ASCF ácido borbulhou com 20% de CO 2 . A fatia corticostriatal mantém a caracterização histológica intacta em comparação com células primárias cultivadas. Para estudar a função cerebral in vivo , emprega-se o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) do mouse. A artéria cerebral média é bloqueada pela inserção de um monofilamento inflamado através da artéria carótida comum. Como um dos modelos de AVC mais amplamente utilizados, o modelo MCAO mostra relevância clínica e a aplicação de um monofilamento torna mais fácil a reperfusão. Simplesmente pela inalação de gases mistos normoxicos contendo 20% de CO 2 após o início do reperfusioN, a APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral indicada por volumes reduzidos de infarto cerebral.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólio</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>E111993</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler Fluxometria</td><td>Moor Instruments Ltd</td><td>Modelo Moor VMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>Tricloroacetaldeícol hidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>30037517</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>F111936</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 poços</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-010-024</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo, com abordagens terapêuticas limitadas. Como uma estratégia endógena para a neuroproteção, os tratamentos pós-condicionamento provaram ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral. No entanto, procedimentos complicados e possíveis problemas de segurança limitam sua aplicação clínica. Para superar estas desvantagens, desenvolvemos pós-condicionamento ácido (APC) como terapia para isquemia cerebral focal experimental. APC refere-se ao tratamento de acidose leve por inalação de CO 2 durante a reperfusão após isquemia. Aqui apresentamos dois modelos para executar APC in vitro e in vivo , respectivamente. O tratamento de privação de oxigênio-glicose (OGD) de camundongos e a oclusão corticostriatal e oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de camundongos foram empregados para imitar a isquemia cerebral. APC pode ser simplesmente conseguido através da transferência de fatias de cérebro para tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 , oR por camundongos que inalam 20% de CO 2 . A APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral, como reflete a viabilidade do tecido e o volume do infarto cerebral.

No modelo da fatia corticostriatal descrita acima, a viabilidade corticostriatal da fatia foi quantificada por meio de ensaio TTC às 1 h após a reperfusão. A conversão TTC foi calculada normalizando a absorção a 490 nm para a fatia de controle. De acordo com a conversão de TTC, a APC protegeu contra lesões de reperfusão induzidas por OGD de uma maneira dependente de tempo e de início. Em detalhes, tanto 1 quanto 3 minutos de tratamento de acidose melhoraram significativamente a viabilida...

O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO 2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

O objetivo geral do tratamento da acidose em um modelo de fatia corticoestriatal em um modelo de oclusão da artéria cerebral média é estudar o efeito neuroprotetor da pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como o pós-condicionamento por acidose pode proteger contra lesão cerebral isquêmica e a desenvolver novas estratégias para a terapia do acidente vascular cerebral. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de utilizar modelos experimentais amplamente disponíveis para estudar a neuroproteção proporcionada pelo pós-condicionamento ácido.Quem demonstrará o procedimento será Yarong Zheng, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece removendo o cérebro do crânio de um camundongo decapitado com uma espátula fina e colocando-o cuidadosamente em um béquer contendo ACSF comum gelado, equilibrado com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Aplique cola de crioprecipitado na placa do vibrátomo em duas faixas.Coloque um pedaço de agarose a três por cento na fita adesiva mais distante da lâmina para suportar o cérebro. Em seguida, use uma pinça para transferir o cérebro para papel filtro. Corte o polo frontal e o cerebelo com uma lâmina.Coloque o tecido cerebral verticalmente sobre a faixa livre de cola com o cérebro apoiado contra a agarose. Adicione ACSF gelado ao reservatório de corte para submergir o cérebro e coloque gelo na área do suporte de gelo. Mantenha o ACSF no reservatório borbulhado com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.Após ajustar o vibrátomo para cortar seções de 400 mícrons e posicionar corretamente o cérebro em relação à lâmina de corte, pressione o botão liga-desliga para iniciar o corte automático. Use uma pipeta de Pasteur com a ponta cortada para transferir cinco fatias cerebrais uma a uma e colocá-las no porta-técnicas contendo ACSF comum gelado e borbulhado com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Após 30 minutos em temperatura ambiente, coloque as fatias cerebrais em banho-maria a 37 graus Celsius por dez minutos para recuperação da função sináptica.Coloque o ACSF sem glicose e o ACSF ácido no banho-maria a 37 graus Celsius e borbulhe as soluções com cinco por cento de dióxido de carbono e 95% de nitrogênio e com 20 por cento de dióxido de carbono e 80% de oxigênio, respectivamente, por 30 minutos. Transfira cuidadosamente quatro dos cinco cortes cerebrais para o ACSF sem glicose pré-aquecido a 37 graus Celsius e incube por 15 minutos. Para estudar a janela temporal do condicionamento ácido, transfira um corte diretamente do ACSF sem glicose para o ACSF ácido e transfira os outros três cortes para ACSF comum para a reperfusão.Após três minutos, transfira a fatia de ACSF ácido para ACSF regular. Em seguida, após cinco minutos em ACSF regular, transfira uma das fatias de ACSF regular para o porta-técnicas em ACSF ácido por três minutos. Transfira outra fatia da mesma maneira 15 minutos após a reperfusão.A fatia restante que foi colocada em ACSF sem glicose, mas não em ACSF ácido, é definida como o grupo de privação de oxigênio e glicose. Transfira as fatias do ACSF para os poços de uma placa de 24 poços contendo solução de TTC. Estique a fatia na solução.Em seguida, incubar a 37 graus Celsius em banho-maria raso por 30 minutos. Em seguida, transferir as fatias para tubos c&ocirc;nicos limpos e previamente pesados de 1,5 mililitro, cobertos com papel alum&iacute;nio, e medir o peso seco das fatias. Ap&oacute;s a pesagem, extrair a formazana adicionando uma solu&ccedil;&atilde;o na propor&ccedil;&atilde;o de um para um de etanol e dimetil sulf&oacute;xido aos tubos, numa rela&ccedil;&atilde;o volume/peso de 10 para 1.Incubar ao abrigo da luz durante 24 horas. No dia seguinte, transferir a solução de etanol e dimetilsulfóxido dos tubos para uma placa de 96 poços e medir a absorbância a 490 nanômetros utilizando um leitor de placas. Primeiro, confirmar a anestesia adequada pela ausência do reflexo ao aperto do dedo do pé.Em seguida, posicione o camundongo anestesiado com o sensor de fluxo sanguíneo laser fixado em seu crânio em posição supina e fixe-o utilizando fios de algodão estéreis. Desinfete a pele depilada do pescoço com álcool etílico 75%. Em seguida, após fazer uma incisão cutânea perimediana no pescoço, disseque cuidadosamente os tecidos moles com pinça para expor os vasos sanguíneos.Adicione uma gota de soro fisiológico aos tecidos expostos para mantê-los hidratados. Em seguida, use pin&ccedil;as oft&aacute;lmicas para dissecar a art&eacute;ria car&oacute;ida comum do tecido circundante e do nervo vago. Tenha cuidado para n&atilde;o danificar o nervo vago.Coloque um clamp microvascular na extremidade distal da artéria carótida comum e faça um nó morto com sutura de seda 6-0 na extremidade proximal. Em seguida, faça um nó solto proximal ao clamp como sutura temporária.Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica oftálmica para fazer uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós, o mais próximo possível do nó morto. Agora, insira um monofilamento de 12 milímetros, com a ponta arredondada, através da incisão até a luz da artéria e avance alguns milímetros. Aperte o nó solto ao redor da ponta do monofilamento e, em seguida, remova o grampo.Em seguida, use pin&ccedil;as oft&aacute;lmicas para avan&ccedil;ar o filamento at&eacute; a art&eacute;ria car&oacute;tida interna at&eacute; que o software de LDF mostre uma queda acentuada no fluxo sangu&iacute;neo. Registre o hor&aacute;rio de in&iacute;cio da oclus&atilde;o. Em seguida, desconecte a sonda de LDF e coloque o camundongo em uma incubadora a 30 graus Celsius durante a dura&ccedil;&atilde;o de uma hora da oclus&atilde;o.55 minutos após o início da oclusão, reanestesie o animal com isoflurano e posicione-o como antes. Em seguida, abra a incisão no pescoço e reexponha a artéria carótida comum. Após o período de oclusão, use pinça oftálmica para retirar suavemente o filamento e obter a reperfusão.Em seguida, transforme a sutura temporária em permanente apertando o nó. Para o tratamento da acidose, altere o gás inalado pelo cone nasal para 20% de dióxido de carbono, 20% de oxigênio e 60% de nitrogênio durante cinco minutos. Após fechar a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida, coloque o camundongo em uma gaiola aquecida a 30 °C até que ele recupere a consciência.Este histograma mostra os resultados do ensaio TTC realizado em fatias corticais após privação de oxigênio e glicose e pós-condicionamento ácido, conforme demonstrado neste vídeo. Três minutos de tratamento com acidose foram neuroprotetores se o tratamento foi iniciado imediatamente ou cinco minutos após a privação de oxigênio e glicose, mas não quando as fatias foram reperfundidas por 15 minutos. Os camundongos foram submetidos a 60 minutos de oclusão da artéria cerebral média e tratados mediante inalação de 20% de dióxido de carbono por cinco minutos aos cinco, 50 ou 100 minutos após a reperfusão.O volume do infarto foi quantificado por duas, três, cinco colorações com cloreto de trifeniltetrazólio 24 horas após a reperfusão, conforme indicado pelas linhas pontilhadas pretas. Este histograma mostra a porcentagem de volume de infarto para cada condição. A neuroproteção proporcionada pela pós-condicionamento ácido foi robusta mesmo quando o tempo de início foi atrasado para 50 minutos após a reperfusão.No entanto, o tratamento da acidose iniciado aos 100 minutos não bloqueou a lesão isquêmica. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a neuroproteção da pós-condicionamento com acidose no modelo de fatias cerebrais submetidas à OGD e no modelo de MSO em camundongos. Ao tentar realizar os procedimentos, é importante lembrar que a extensão e a duração da acidose são muito importantes para reproduzir os efeitos protetores.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Procuramos definir a sinalização neural imunológico responsável por pré-condicionamento frio, como meios para identificar novos alvos para o desenvolvimento de terapias para proteger o cérebro antes do início da lesão. Apresentamos estratégias para esse trabalho que exigem sistemas biológicos, manipulações experimentais mais capacidades técnicas que são altamente reprodutíveis e sensíveis.

Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

Ligadura da artéria cerebral média (MCA) é uma técnica para estudo da isquemia cerebral focal em modelos animais. Neste método, o da artéria cerebral média é exposto por craniotomia e ligados por cauterização. Este método dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Existem evidências, que o pré-condicionamento isquêmico (PC) - um desafio isquêmico não-prejudicial ao cérebro - confere uma proteção transitória a um insulto isquêmico prejudicial subseqüente. Nós estabelecemos a oclusão da artéria carótida comum bilateral (BCCAO) como um estímulo pré-condicionamento isquémico para induzir tolerância precoce (TI) para a isquemia cerebral focal transiente (induzida pela oclusão da artéria cerebral média, MCAO) em C57BL6 / J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

Fonte: Zheng, Y., et al. Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a aplicação do pós-condicionamento ácido (APC) para avaliar seus efeitos neuroprotetores contra lesão isquêmica em um modelo de camundongo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Ele descreve as etapas envolvidas na reperfusão no modelo MCAO e a aplicação de APC durante a reperfusão para mitigar a excitotoxicidade, o...

 Avaliação dos efeitos neuroprotetores do pós-condicionamento ácido em um modelo de camundongo com isquemia cerebral

Fonte: Brandli, A. Pré-condicionamento isquêmico de membros remotos: uma técnica neuroprotetora em roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo não invasivo de pré-condicionamento isquêmico de membros em ratos para induzir neuroproteção sistêmica. O procedimento envolve oclusão e reperfusão arterial controladas, desencadeando vias de estresse celular que liberam fatores de proteção. Esses fatores aumentam a resistência a lesões isquêmicas e metabólicas em órgãos distantes,...

Pré-condicionamento isquêmico não invasivo de membros em modelo de rato para neuroproteção

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Aqui nós apresentamos um protocolo para induzir a depressão do borne-curso nos ratos obstruindo a artéria cerebral média através da artéria carotídea interna. Utilizamos o teste de nadada forçada de Porsolt e o teste de preferência de sacarose para confirmar e avaliar o humor depressivo induzido.

Uma técnica de oclusão da artéria cerebral média para induzir A depressão pós-AVC em ratos

O objetivo deste estudo é estabelecer e validar um modelo animal para pesquisa nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral testando infarto cerebral e função sensóriomotor após oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) após 1-90 dias em ratos.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

Este protocolo descreve o processo de indução de um modelo de coma isquêmico cerebral usando um método modificado de oclusão de quatro vasos.

Modelo de Coma Isquêmico Cerebral Induzido por Oclusão Modificada de Quatro Vasos

Aprenda os efeitos neuroprotetores do pós-condicionamento ácido contra isquemia cerebral usando modelos in vitro de fatias corticostriatais e in vivo de oclusão da artéria cerebral média em camundongos.

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

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