Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um In vitro Modelo de AVC
4 de fevereiro de 2014
Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.
O objetivo geral deste procedimento é aplicar estimulação citotóxica a microfatias cerebrais para criar um modelo de AVC in vitro. Isso é feito preparando primeiro microfatias de um cérebro recém-isolado. O segundo passo é equilibrar as micro fatias com agitação suave.
Uma vez equilibradas, as micro fatias estão prontas para receber uma variedade de manipulações experimentais. Em última análise, os resultados mostram que as micro fatias são viáveis por pelo menos duas horas após a geração. A principal vantagem de nossa técnica sobre outras técnicas existentes, como culturas neuronais embrionárias primárias, é que nossa técnica utiliza fatias de tecido cerebral maduro, que contêm mais de um tipo de célula e, portanto, são mais representativas do tecido cerebral intacto.
O primeiro passo é obter tecido cerebral fresco. Mergulhe o cérebro em uma pequena quantidade de tampão Krebs quente. Para remover qualquer resíduo de pele, pêlo ou sangue, prepare o picador macle wain com duas folhas de papel de filtro umedecidas com tampão Krebs quente.
Quando estiver pronto, coloque o cérebro no palco do helicóptero. Mantenha o cérebro e o papel de filtro úmidos com tampão de crebs quente enquanto trabalha para evitar que o cérebro deslize. Evite permitir que muito líquido se acumule na superfície.
Corte o cérebro em seções coronais de 250 micrômetros. Em seguida, gire o palco 90 graus e crie fatias sagitais de 250 micrômetros. Após esta etapa, as seções cerebrais são chamadas de microfatias.
Coloque as micro fatias em um fundo redondo com 10 a 15 mililitros de tampão de crebs quente. Agite suavemente o tubo até que as microfatias individuais sejam suspensas e, em seguida, deixe-as assentar sob a gravidade. Remova cuidadosamente o sobrenadante, que ficará turvo devido a detritos celulares suspensos, e adicione 10 mililitros de tampão fresco e quente ao tubo.
Repita o procedimento de lavagem quatro vezes para remover a maioria dos detritos depois de bem lavados. Equilibre as micro fatias a 37 graus Celsius com agitação suave ou inversão e troque o tampão Krebs a cada 15 minutos por uma hora no total. Após este tempo, adicione dois mililitros de tampão Krebs fresco a 37 graus Celsius e transfira 15 a 20 micro fatias para um tubo de poliestireno de fundo plano de cinco mililitros.
Usando uma ponta de pipeta de furo extra largo com bordas lisas, espalhe as microfatias uniformemente sobre a base do tubo em uma única camada, de modo que cada microfatia não fique a mais de alguns milímetros da atmosfera oxigenada. Depois de devidamente dispostas, incube as microfatias em banho-maria a 37 graus Celsius para fornecer oxigenação adequada às microfatias. Passe continuamente o carbogênio sobre a suspensão da microfatia com as posições da linha de gás logo acima da superfície para evitar a ruptura mecânica das microfatias para contato direto com o gás para obter os melhores resultados.
É fundamental que as micros fatias sejam arejadas corretamente. É importante que a linha de gás seja colocada na distância certa da superfície da suspensão do microsite. Várias linhas podem ser fundidas para permitir que ocorram vários estímulos.
Ao mesmo tempo, uma variedade de estímulos pode ser usada. Neste exemplo, as micro fatias sofrem estimulação AMPA. Trate as micro fatias com um estímulo citotóxico ou tampão de Krebs sozinho.
Para um controle no grupo estimulado. Remova a solução de incubação em vários momentos após a estimulação e substitua-a por 300 microlitros de tampão de homogeneização gelada no ponto de tempo desejado. Após a estimulação, homogeneizar as microfatias no gelo usando um homogeneizador de Teflon de vidro para baixo e armazenar o homogêneo a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para uma análise mais aprofundada.
As taxas de respiração mostram que as microfatias coletadas do prosencéfalo de galinha são viáveis por até duas horas após a geração. Os altos níveis de A TP e baixos níveis de A DP encontrados em microfatias também são característicos de células viáveis. Neste exemplo, o teor de potássio no tecido foi medido e encontrado logo acima do fundo após a dissecção, mas aumentou após a incubação com tampão Krebs, a adição de WABE e EGTA fez com que o conteúdo de potássio do tecido diminuísse, demonstrando que as microfatias normalmente bombeiam potássio ativamente e que os níveis não são devidos ao potássio preso no tecido morto ou espaços intersticiais.
Aqui, microfatias foram geradas a partir do estriado e do córtex sensorial de ratos machos e despolarizadas usando tampão de crebs com alto teor de potássio. A taxa de fosforilação da cola N dois B variou entre o córtex e o estriado, enquanto a taxa de fosforilação da cola a um foi semelhante entre as duas áreas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente duas horas se executada corretamente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta um modelo de fatia cerebral desenvolvido para investigar os mecanismos moleculares da lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. A técnica permite a geração de tecido cerebral maduro viável, minimizando o uso de animais e preservando a circuitria neuronal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Modelos In Vitro
Antecedentes
- A excitotoxicidade é um fator significativo nas lesões cerebrais.
- Os modelos existentes muitas vezes dependem de culturas primárias de neurônios.
- O uso de tecido cerebral maduro fornece uma representação mais precisa das condições in vivo.
- Este modelo tem como objetivo reduzir o número de animais utilizados na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo in vitro confiável de acidente vascular cerebral.
- Explorar os efeitos da estimulação citotóxica em fatias microscópicas de cérebro.
- Manter as interações celulares e os compartimentos pós-sinápticos.
Métodos Utilizados
- Preparação de microfatias de tecido cerebral recém-isolado.
- Equilíbrio das microfatias com agitação suave.
- Aplicação de diversas manipulações experimentais após o equilíbrio.
- Avaliação da viabilidade das fatias por pelo menos duas horas após a geração.
Resultados Principais
- Microfatias permanecem viáveis para uso experimental por duas horas.
- A técnica preserva múltiplos tipos celulares dentro das fatias.
- Os resultados indicam que este modelo é mais representativo do tecido cerebral intacto.
- Demonstra vantagens em comparação com os métodos tradicionais de cultura neuronal.
Conclusões
- O modelo de fatia cerebral desenvolvido é eficaz para o estudo da excitotoxicidade.
- Essa abordagem reduz o uso de animais mantendo a integridade do tecido.
- Pesquisas futuras podem aproveitar este modelo para obter maiores insights sobre os mecanismos de lesão cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem de lesão cerebral excitotóxica em tecido neural maduro aborda uma lacuna crítica na neurociência translacional, permitindo uma avaliação mais preditiva dos mecanismos moleculares relevantes ao acidente vascular cerebral isquêmico. Esta plataforma de microfatias cerebrais possibilita a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos ao preservar a complexidade celular e a arquitetura tecidual ausentes em culturas primárias de neurônios. Sua adaptabilidade entre espécies e regiões cerebrais aumenta a relevância do portfólio para descobertas iniciais e pesquisas pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias de excitotoxicidade em ambientes neurais maduros e multicelulares.
- Apoia a validação funcional de alvos ao modelar a morte celular e a sinalização em tecido intacto.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir respostas de tecido maduro de artefatos de culturas imaturas.
- Aprimora a confiança preditiva para alvos candidatos implicados em acidente vascular cerebral e neurodegeneração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado e reprodutível para quantificar resultados funcionais, como viabilidade celular e eventos de fosforilação.
- Apóia a padronização de ensaios ao permitir condições paralelas de estimulação e controle no mesmo contexto tecidual.
- Permite adaptação escalonável a múltiplas regiões cerebrais e espécies, ampliando a aplicabilidade do triagem.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre respostas de tecido neural maduro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a mecanismos relevantes para doenças ao modelar lesão excitotóxica em fatias cerebrais maduras.
- Apóia a descoberta translacional de biomarcadores por meio da medição de desfechos moleculares após estimulação.
- Proporciona continuidade desde estudos mecanicistas iniciais até a validação pré-clínica em sistemas mais complexos.
- Reduz o risco translacional ao preencher a lacuna entre culturas celulares e modelos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de microfatia cerebral se situa na interface entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica, permitindo testes de hipóteses e estudos mecanicistas antes do trabalho in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a desmistificação biológica de alvos relacionados à excitotoxicidade e neuroproteção.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis, como viabilidade celular e estado de fosforilação, para avaliação de compostos.
- Análises: Permite análise comparativa de respostas moleculares entre regiões cerebrais e condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento com desfechos relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Protocolo adaptável que apoia aplicação interprogramas e padronização em portfólios de neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de neurodegeneração.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo do tecido e a estimulação para fluxos de trabalho reproduzíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao fornecer dados de tecido maduro antes de estudos em animais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos neuroprotetores e moduladores da excitotoxicidade.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação cerebral, manipulação de tecidos e avaliação da viabilidade de fatias.
- Requer acesso a equipamentos especializados para corte de tecidos, incubação e oxigenação.
- Exige padronização rigorosa entre equipes dos protocolos de estimulação e dos pontos finais analíticos.
- Adaptável a diversas espécies e regiões cerebrais, mas pode exigir otimização do protocolo para cada contexto.
- A janela de viabilidade limita a duração do experimento a aproximadamente duas horas após a geração das fatias.
