Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um In vitro Modelo de AVC

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

O objetivo geral deste procedimento é aplicar estimulação citotóxica a microfatias cerebrais para criar um modelo de AVC in vitro. Isso é feito preparando primeiro microfatias de um cérebro recém-isolado. O segundo passo é equilibrar as micro fatias com agitação suave.

Uma vez equilibradas, as micro fatias estão prontas para receber uma variedade de manipulações experimentais. Em última análise, os resultados mostram que as micro fatias são viáveis por pelo menos duas horas após a geração. A principal vantagem de nossa técnica sobre outras técnicas existentes, como culturas neuronais embrionárias primárias, é que nossa técnica utiliza fatias de tecido cerebral maduro, que contêm mais de um tipo de célula e, portanto, são mais representativas do tecido cerebral intacto.

O primeiro passo é obter tecido cerebral fresco. Mergulhe o cérebro em uma pequena quantidade de tampão Krebs quente. Para remover qualquer resíduo de pele, pêlo ou sangue, prepare o picador macle wain com duas folhas de papel de filtro umedecidas com tampão Krebs quente.

Quando estiver pronto, coloque o cérebro no palco do helicóptero. Mantenha o cérebro e o papel de filtro úmidos com tampão de crebs quente enquanto trabalha para evitar que o cérebro deslize. Evite permitir que muito líquido se acumule na superfície.

Corte o cérebro em seções coronais de 250 micrômetros. Em seguida, gire o palco 90 graus e crie fatias sagitais de 250 micrômetros. Após esta etapa, as seções cerebrais são chamadas de microfatias.

Coloque as micro fatias em um fundo redondo com 10 a 15 mililitros de tampão de crebs quente. Agite suavemente o tubo até que as microfatias individuais sejam suspensas e, em seguida, deixe-as assentar sob a gravidade. Remova cuidadosamente o sobrenadante, que ficará turvo devido a detritos celulares suspensos, e adicione 10 mililitros de tampão fresco e quente ao tubo.

Repita o procedimento de lavagem quatro vezes para remover a maioria dos detritos depois de bem lavados. Equilibre as micro fatias a 37 graus Celsius com agitação suave ou inversão e troque o tampão Krebs a cada 15 minutos por uma hora no total. Após este tempo, adicione dois mililitros de tampão Krebs fresco a 37 graus Celsius e transfira 15 a 20 micro fatias para um tubo de poliestireno de fundo plano de cinco mililitros.

Usando uma ponta de pipeta de furo extra largo com bordas lisas, espalhe as microfatias uniformemente sobre a base do tubo em uma única camada, de modo que cada microfatia não fique a mais de alguns milímetros da atmosfera oxigenada. Depois de devidamente dispostas, incube as microfatias em banho-maria a 37 graus Celsius para fornecer oxigenação adequada às microfatias. Passe continuamente o carbogênio sobre a suspensão da microfatia com as posições da linha de gás logo acima da superfície para evitar a ruptura mecânica das microfatias para contato direto com o gás para obter os melhores resultados.

É fundamental que as micros fatias sejam arejadas corretamente. É importante que a linha de gás seja colocada na distância certa da superfície da suspensão do microsite. Várias linhas podem ser fundidas para permitir que ocorram vários estímulos.

Ao mesmo tempo, uma variedade de estímulos pode ser usada. Neste exemplo, as micro fatias sofrem estimulação AMPA. Trate as micro fatias com um estímulo citotóxico ou tampão de Krebs sozinho.

Para um controle no grupo estimulado. Remova a solução de incubação em vários momentos após a estimulação e substitua-a por 300 microlitros de tampão de homogeneização gelada no ponto de tempo desejado. Após a estimulação, homogeneizar as microfatias no gelo usando um homogeneizador de Teflon de vidro para baixo e armazenar o homogêneo a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para uma análise mais aprofundada.

As taxas de respiração mostram que as microfatias coletadas do prosencéfalo de galinha são viáveis por até duas horas após a geração. Os altos níveis de A TP e baixos níveis de A DP encontrados em microfatias também são característicos de células viáveis. Neste exemplo, o teor de potássio no tecido foi medido e encontrado logo acima do fundo após a dissecção, mas aumentou após a incubação com tampão Krebs, a adição de WABE e EGTA fez com que o conteúdo de potássio do tecido diminuísse, demonstrando que as microfatias normalmente bombeiam potássio ativamente e que os níveis não são devidos ao potássio preso no tecido morto ou espaços intersticiais.

Aqui, microfatias foram geradas a partir do estriado e do córtex sensorial de ratos machos e despolarizadas usando tampão de crebs com alto teor de potássio. A taxa de fosforilação da cola N dois B variou entre o córtex e o estriado, enquanto a taxa de fosforilação da cola a um foi semelhante entre as duas áreas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente duas horas se executada corretamente.