Name: Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda métodos de biotinilação para avaliar a expressão na superfície celular e taxas endocíticas de proteínas em astrocitos, focando na Aquaporina-4. Essas técnicas são aplicáveis a diversos tipos celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projeto foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisas em Saúde PG # 20R47867.

1. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular em astrocitos por biotinilação NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula da molécula da matriz extracelular na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais ). <ol><li> Usando o método descrito em Noel et al. 12 , preparar culturas de astrocitos corticais aproximadamente 2 semanas antes do ensaio e cultivá-las em frascos de cultura ventilados de 75 cm2. Quando os astrocitos são 80 a 90% confluentes, separe-os da superfície da cultura usando 0,05% de tripsina e, em seguida, passe-os 1: 3. </li><li> Às 48 horas anteriores ao ensaio, quando as células são novamente 80 - 90% de confluência, astrocitos de passagem 1: 3 (responsável pelo cHange no formato de cultura) em pratos de cultura celular de 60 mm de modo que estejam&gt; 70% confluentes no dia da realização do experimento. Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente entre pratos. </li><li> Às 16 h antes do ensaio, laminina de pipeta em meio de cultura até uma concentração final de 24 nM e incuba a 37 ° C. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e, em seguida, colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / mL de sulfo-NHS-LC-biotina em CM-PBS), tampão de extinção (NH4Cl 50 mM em CM-PBS), tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, coqueador de inibidor de protease 1X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (10 mM Tris (pH 7,4), EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X). </li><li> RemOve pratos segurando as culturas de astrocite da incubadora e descarte o meio. </li><li> Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado. </li><li> Pipetar 2 mL de tampão de biotina em cada poço e inclinar suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir uma cobertura completa. Deixe em gelo durante 30 min. </li><li> Remova o tampão de biotina usando um aspirador e substitua-o por um tampão de extinção de 4 mL. Deixe no gelo por 10 min. </li><li> Aspirar o buffer de extinção e substituir por um volume equivalente do mesmo. Mais uma vez, deixe no gelo durante 10 min. </li><li> Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido. </li><li> Raspe as células em 1 mL de CM-PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e volte a suspender as células em 500 μL de tampão de lise. </li><li> Deixe amostras em gelo durante 30 min, vortexando a cada 5 minutos, ou plAce eles em um rotator de extremidade a ponta a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar quaisquer materiais insolúveis em detergente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. <ol><li> Economize 50 μL deste lisado e adicione o buffer de carregamento a ele. Em seguida, desnaturar-se por aquecimento a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração &quot;entrada&quot;, contendo proteínas de superfície celular biotiniladas, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas. </li></ol></li><li> Amplie a abertura de uma ponta de pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material da extremidade usando um par de tesoura afiada. Utilizando esta ponta de pipeta, transfira 75 μL de esferas de estreptavidina-agarose (normalmente armazenadas a 4 ° C) até o lisado e incuba a 4 ° C durante 3 h no agitador / balancim. <ol><li> Como a estreptavidina-agarose é frequentemente vendida como uma pasta contendo 50% de grânulos por volume, suspensa numa solução antimicrobiana, triturar a pasta para garantir que as esferasSão uniformemente suspensos e, em seguida, pipetar 150 μL da suspensão em cada amostra. </li></ol></li><li> Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1500 xg durante 30 s a 4 ° C. <ol><li> Economize 50 μL do sobrenadante (adicione o tampão de carga e desnaturado a 95 ° C em um banho de água ou bloco de aquecimento); Isso representa a fração &quot;intracelular&quot;, e é composto principalmente de proteínas citossicas não biotiniladas. </li></ol></li><li> Ressuspender os grânulos sedimentados em 1 mL de tampão de lavagem e arrasar isto durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (como no passo 1.16), e descartar o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas. </li><li> Granular as esferas por centrifugação (1500 xg durante 30 s a 4 ° C) e descartar o tampão de lavagem subjacente. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas desnaturando isso a 95 ° C; Esta fraçãoSó contém proteínas de superfície celular biotiniladas (fração &quot;superfície celular&quot;). <ol><li> Separar a entrada, a superfície celular e as frações intracelulares por SDS-PAGE 13 e analisar pelo Western Blot 14 . NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas. </li></ol></li></ol> 2. Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular em Astrocytes por Biotinilação NOTA: No seguinte, descrevemos um experimento típico de biotinilação de pulso-perseguição usado nesta instância para rastrear a endocitose de AQP4 em astrocitos. esteO método é baseado no usado por Madrid et al. 15 . Os materiais especializados necessários incluem sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarose, glutationa reduzida e iodoacetamida (ver Tabela de Materiais ). <ol><li> Prepare culturas de astrocitos corticais de mouse em pratos de 60 mm usando os métodos descritos na seção anterior. Certifique-se de que as células estejam aproximadamente a 70% confluentes no dia do ensaio, e que cada prato contém um número equivalente de células. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotina em CM-PBS), tampão redutor (50 mM de glutationa reduzida, NaCl 75 mM e NaOH 75 mM), tampão de extinção (iodoacetamida 50 mM, BSA a 1% em CM-PBS) Tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM, 1% triton X-100, 1Coque de inibidor de protease X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X). </li><li> Prepare um meio de cultura celular fresco (DMEM suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina) e coloque-o em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Remova as culturas de astrocitos da incubadora e aspirar o meio usando um aspirador. </li><li> Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado. </li><li> Pipetar 3 mL de tampão de biotina em cada prato, incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe isso no gelo durante 30 min. </li><li> Aspirar o tampão de biotina e substituí-lo por 5 ml de meio quente. Incubar um prato de cultura a 37 ° C durante 15 min e um segundo prato à mesma temperatura durante 30 min. Deixe um outro prato aos 46; C como a amostra de 0 min. </li><li> No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido. Pipetar 6 mL de tampão redutor sobre células e deixar em gelo durante 15 min. </li><li> Remova o tampão redutor e, em seguida, substitua-o por 6 ml de tampão redutor fresco. Coloque no gelo por mais 15 min. </li><li> Remova a solução redutora e substitua-a por um tampão de remoção de 6 ml. Deixe em gelo durante 15 min. </li><li> Repita o passo de extinção mais uma vez. </li><li> Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de PBS arrefecido. </li><li> Raspe células para 1 mL de PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 μL de tampão de lise. </li><li> Deixe isso no gelo durante 30 min e vortex a cada 5 min. Alternativamente, coloque as amostras em um rotador de extremidade a ponta a 4 ° C durante este período. </li><li> CentrífugaSai a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os materiais insolúveis em detergente, então transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 μL deste lisado, adicione-lhe tampão de carga e desnaturar a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração &quot;entrada&quot;, contendo proteínas endocitadas biotiniladas, bem como proteínas não biotiniladas. </li><li> Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 μL da pasta de estreptavidina-agarose ao lisado e incuba a 4 ° C por 3 h no agitador / balancim. Consulte 1.15 para obter detalhes adicionais sobre esta etapa. </li><li> Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s a 4 ° C. </li><li> Resuspendar os grânulos em 1 mL de tampão de lavagem e rolar durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (conforme o passo 2.18), e descarte o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas. </li><li> Grânulos de pelotização por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s, a 4 ° C, e descartar oveAcumulação de buffer de lavagem. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas por desnaturação a 95 ° C; Esta fração deve conter apenas proteínas internas de superfície celular (fração &quot;endocitosa&quot;). </li><li> Separe a entrada, a superfície celular e as frações não ligadas por SDS-PAGE 13 e analise com o Western Blot 14 . NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas. </li></ol>

<ol><li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li>
<li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li>
<li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li>
<li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+family%3A+endocytosis+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li>
<li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li>
<li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation%3A+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+1.+the+use+of+%5B14-C%5Dbiotin+for+kinetic+studies+and+for+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li>
<li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin%2C+a+high+affinity+biotin-binding+protein%2C+as+a+tool+and+subject+of+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450(2012).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805(2014).</li>
<li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li>
<li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan%2C+Dynamin%2C+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Modificações: Como esses métodos foram projetados para uso com células aderentes, especificamos o uso de PBS contendo 100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para os passos de lavagem e como base de certos tampões de modo a garantir que as células permaneçam ligadas à superfície da cultura e que as junções célula-célula não sejam interrompidas. No entanto, os protocolos também podem ser aplicados a tipos de células não aderen...

As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram internalizadas novamente. Através destes métodos, a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de qualquer proteína de interesse podem ser quantificadas, permitindo assim uma avaliação mais clara da sua regulação. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular por biotinilação A biotina ou vitamina B7, anteriormente conhecida como vitamina H 6 , é uma pequena molécula solúvel em água que pode ser usada para modificar quimicamente grupos amino, sulfidrilo e carboxilo reativos de moléculas biológicas. A cultura atual de reagentes de biotinilação de superfície celular consiste principalmente de ésteres de N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados com membrana e nanotoxinas (sulfo-NHS), de biotina ou seus derivados, projetados para reagir com as aminas presentes nas cadeias laterais de resíduos de lisina de proteínas expressas em A superfície celular quando estes se tornam desprotonados em condições básicas, resultando em este último formando uma ligação amida com a unidade de biotina 7 . Assim, modificadas, as proteínas da superfície celular podem então ser isoladas através do uso de avidina, uma proteína tetramerica de 66 - 69 kDa que possui grande afinidade pela biotina, que se liga ao último com uma constante de dissociação de aproximadamente 10 a 15 , marcando-a como uma das Interações não covalentes mais fortes conhecidas 8 </suP&gt; , 9 . Uma série de métodos alternativos de quantificação da expressão protéica na superfície celular foram utilizados em estudos prévios. A rotulagem de células não permeabilizadas usando anticorpos marcados de forma fluorescente especificamente para a proteína de interesse, seguida pela visualização por microscopia de fluorescência, por exemplo, é uma abordagem comumente empregada, mas depende fortemente da disponibilidade de anticorpos que podem se ligar a epítopos extracelulares. Mais recentemente, os métodos que envolvem a utilização de proteínas quiméricas com fluoróforos sensíveis ao pH que reagem a exposição a meios ácidos também foram empregados com sucesso 10 . No entanto, tais ensaios geralmente envolvem a expressão exógena dessas construções em linhas celulares em que a proteína de interesse não é encontrada nativamente. Essas abordagens são, no entanto, capazes de fornecer informações valiosas sobre a localização subcelular e o itinerário exocítico daProteína alvo e, portanto, deve ser usado em conjunto com as abordagens baseadas em biotinilação aqui descritas se as ferramentas estiverem disponíveis. Num ensaio de biotinilação típico, as células são primeiro lavadas completamente em PBS a 4 ° C. Isso remove qualquer vestígio de proteínas séricas introduzidas pelo meio de cultura, garantindo assim que estas não consumam quantidades excessivas de biotina no próximo passo. Mais importante ainda, a redução da temperatura faz com que a endocitose desacelere significativamente. O reagente de biotinilação é então adicionado. Em seguida, as células são lavadas novamente e depois incubadas com um tampão de extinção contendo glicina ou NH4C1, cujo objectivo é inactivar todos os vestígios restantes da biotina não reagida. As células são então lisadas, após o que é adicionada streptavidina imobilizada em agarose para precipitar as proteínas biotiniladas. A análise é comumente realizada via western blot, permitindo a expressão relativa da superfície celular de vários prOteins a serem quantificados. Devido à base deste ensaio, é adequado para uso apenas com proteínas que possuem porções expostas ao ambiente extracelular. As proteínas transmembranares multipass, que provavelmente possuem uma série de lisinas reativas dentro de suas regiões de loop, são as mais favoráveis ​​a esse método, enquanto as proteínas de passagem única tendem a ser menos suscetíveis a serem biotiniladas. Mesmo nesses casos, existe a possibilidade de que mudanças conformacionais ou interações intermoleculares ocultem certos locais reativos, resultando em um rendimento de biotinilação inferior ao esperado. Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular por biotinilação Os princípios deste ensaio são em grande parte semelhantes aos da biotinilação celular, com várias exceções, sendo o mais importante o uso de reagentes reversíveis de biotinilação. Os grupos de biotina (destes) possuem disuLigação de ligações, dentro das suas estruturas, que são suscetíveis a agentes redutores; Isto é explorado para assegurar que apenas as proteínas de superfície celular tomadas nos locais intracelulares durante o período de ensaio serão deixadas biotiniladas. Um ensaio geralmente ocorre da seguinte maneira. As células são primeiro lavadas e biotiniladas com reagentes frios, então o meio de cultura de células a 37 ° C é reintroduzido e as células são devolvidas à incubadora; Isso faz com que as proteínas de superfície celular marcadas sofram endocitose. O agente redutor de glutationa - que não pode penetrar na membrana - é então adicionado para quebrar as ligações dissulfureto das porções de biotina ligadas às proteínas que permanecem na superfície celular. Finalmente, as ligações de dissulfureto quebradas são feitas reagir com iodoacetamida, consumindo os grupos de tiolos lábeis e impedindo que as ligações se reformem. Como antes, as células são então lisadas, e as proteínas marcadas são precipitadas usando estreptavidina-agarose. O disco de limitaçõesUssed na seção anterior também se aplicam aqui devido às semelhanças compartilhadas entre os métodos. Além disso, vale a pena ter em mente que as mudanças de temperatura envolvidas neste ensaio impedem a determinação exata de quanta proteína é endocitada para cada incremento de tempo, particularmente no caso de proteínas de reciclagem rapidamente ou internamente recicladas. O ensaio, portanto, apenas fornece uma estimativa semiquantitativa das taxas endocíticas. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total pode ser utilizada para rastrear a absorção de cada vesícula carregada e fornecer uma medida mais precisa da cinética da endocitose. Por conseguinte, pode proporcionar um complemento muito útil a este ensaio, assumindo que existe uma construção quimérica marcada de forma fluorescente da proteína de interesse 11 .

<table><tbody><tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inibidor coquetel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Etilenodiamina tetraacetato dissódico di-hidratado ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Bio-Rad</td> <td># 163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Descongele no gelo.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-actina (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta;-distroglicano (43DAG1 / 8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Resina de agarose estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-AQP4 policlonal de coelho</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

As proteínas de superfície celular medem uma ampla gama de funções. Em muitos casos, sua atividade é regulada por processos endocíticos que modulam seus níveis na membrana plasmática. Aqui, apresentamos protocolos detalhados para 2 métodos que facilitam o estudo de tais processos, ambos baseados no princípio da biotinilação de proteínas de superfície celular. O primeiro é projetado para permitir a determinação semi-quantitativa dos níveis relativos de uma proteína particular na superfície celular. Nele, os resíduos de lisina das proteínas da membrana plasmática das células são primeiro marcados com uma porção de biotina. Uma vez que as células são lisadas, estas proteínas podem então ser precipitadas especificamente através da utilização de estreptavidina imobilizada em agarose, explorando a afinidade natural destes últimos com a biotina. As proteínas isoladas de tal maneira podem então ser analisadas através de uma abordagem padrão de Western Blot. O segundo método fornece um meio de determinar a taxa endocítica de umaAr alvo da superfície celular durante um período de tempo. As proteínas de superfície celular são primeiro modificadas com um derivado de biotina contendo uma ligação dissulfureto clivável. As células são então deslocadas de volta para condições de cultura normais, o que provoca a absorção endocítica de uma proporção de proteínas biotiniladas. Em seguida, as ligações dissulfureto de grupos de biotina não internalizados são reduzidas usando o agente redutor impermeável à membrana glutationa. Através desta abordagem, as proteínas endocitadas podem assim ser isoladas e quantificadas com um alto grau de especificidade.

Usando a biotinilação de superfície celular para avaliar a expressão da membrana plasmática de AQP4 em astrocitos As culturas de astrocitos tratados com laminina e células de controlo não tratadas foram sujeitas a biotinilação de superfície celular usando os métodos descritos. As proteínas biotiniladas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose e depois separadas via SDS-PAGE. As frações de superfície celular foram avaliadas para AQP4 e β-dystrogl...

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Neste vídeo, serão apresentados dois métodos: biotinilação da superfície celular e biotinilação do tipo pulse-chase. Na demonstração a seguir, utilizaremos astrócitos. Essas são os tipos de células gliais mais abundantes no cérebro, e expressam a proteína de interesse, a Aquaporina-4.Os métodos que utilizamos neste artigo podem ser aplicados a diversos tipos celulares, incluindo células em suspensão ou células aderentes. Essas técnicas podem ser usadas para estudar a expressão na superfície celular e a internalização de praticamente qualquer proteína transmembranar, desde que possua um domínio extracelular acessível à biotina. O objetivo geral deste ensaio de biotinilação da superfície celular é determinar os efeitos da laminina sobre a expressão do canal permeável à água Aquaporina-4 na membrana plasmática de astrócitos.Para iniciar este procedimento, retire as culturas de astrócitos do incubador e descarte o meio por aspiração. Lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS gelado e coloque as placas sobre gelo triturado. Remova o CM-PBS por aspiração e, em seguida, pipete dois mililitros de tampão de biotina em cada poço.Incline suavemente os recipientes para frente e para trás algumas vezes para garantir cobertura completa antes de colocar as culturas no gelo por 30 minutos. Em seguida, remova o tampão de biotina, substitua-o por quatro mililitros de tampão de quenching e mantenha as culturas no gelo por 10 minutos. Depois, aspire e substitua pela mesma quantidade do tampão de quenching antes de deixar as culturas no gelo por mais 10 minutos.Em seguida, descarte o tampão de quenching e lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS gelado. Após isso, raspe as células em um mililitro de CM-PBS gelado e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, pelote as células por centrifugação a 100 g durante três minutos em uma microcentrífuga refrigerada ajustada a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o sobrenatante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise. Depois, mantenha as amostras em gelo por 30 minutos, vortexeando a cada cinco minutos. Após isso, centrifugue o lisado a 14.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para formar um pellet com quaisquer materiais detergentes e solúveis.Em seguida, transfira o sobrenatante para um novo tubo de microcentrífuga. Reserve 50 microlitros do lisado e adicione 25 microlitros de tampão de carga três X a ele. Posteriormente, desnature-o aquecendo a 95 graus Celsius em banho seco.Esta é a fração de entrada, contendo tanto proteínas da superfície celular biotiniladas quanto proteínas citosólicas não biotiniladas. Usando uma ponteira cortada, transfira 75 microlitros de perlas de agarose estreptavidina para o lisado e incube a quatro graus Celsius por três horas em agitação. Em seguida, pelote as perlas de agarose estreptavidina por centrifugação a 1.500 ×g por 30 segundos a quatro graus Celsius.Guarde 50 microlitros do sobrenadante e adicione 25 microlitros de tampão de carga três X. Em seguida, desnatureze a 95 graus Celsius em banho-maria ou bloco térmico. Esta fração representa a fração intracelular e é composta principalmente por proteínas citosólicas não biotiniladas.Em seguida, re-suspenda as microesferas sedimentadas em um mililitro de tampão de lavagem e agite suavemente por três minutos a quatro graus Celsius. Sedimente as microesferas e descarte o sobrenadante. Repita este processo mais quatro vezes para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas.Adicione 50 microlitros de tampão de carregamento diluído a uma X usando tampão de lise. Libere a biotina e a estreptavidina das perlas desnaturando-as a 95 graus Celsius. Esta fração deve conter apenas proteínas de superfície celular biotiniladas.Posteriormente, separe as frações de entrada, superfície celular e intracelular por SDS-PAGE e analise por western blot. O objetivo geral do experimento de biotinilação pulso-e-chase é determinar a taxa aproximada de internalização da Aquaporina-4 em astrócitos. Primeiro, remova as culturas de astrócitos do incubador e aspire o meio.Em seguida, lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS gelado e coloque as placas sobre gelo triturado. Aspire o CM-PBS e, então, pipete três mililitros de tampão de biotina em cada placa. Incline as placas para frente e para trás algumas vezes para garantir uma boa distribuição do tampão e deixe-as sobre gelo por 30 minutos.Em seguida, aspire o tampão de biotina e substitua-o por cinco mililitros de meio aquecido. Incube uma placa de cultura a 37 graus Celsius por 15 minutos e uma segunda placa na mesma temperatura por 30 minutos. Mantenha outra placa a quatro graus Celsius como amostra de tempo zero.Após o período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS gelado. Em seguida, aspire o CM-PBS e pipete seis mililitros de tampão redutor sobre as células, deixando a amostra em gelo por 15 minutos. Então, substitua o tampão por seis mililitros de tampão redutor fresco e coloque a amostra em gelo por mais 15 minutos.Esta etapa é crítica, pois a glutationa contida no tampão redutor clivará o grupo biotina que permanece na superfície celular. Isso garante que apenas as proteínas internalizadas estarão marcadas com biotina. Em seguida, remova a solução redutora e substitua por seis mililitros de tampão de quenching.Deixe a amostra no gelo por mais 15 minutos e repita a etapa de bloqueio mais uma vez. Em seguida, descarte o tampão de bloqueio e lave as células três vezes com quatro mililitros de PBS gelado. Aspire o PBS-CM e, então, raspe as células em um mililitro de PBS gelado, utilizando um levantador celular, e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.Pelotize as células por centrifugação a 100 g durante três minutos. Após três minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise. Mantenha a amostra em gelo por 30 minutos, e vortexie a cada cinco minutos.Centrifugue o lisado a 14.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para formar um pellet com o detergente e os materiais solúveis. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Reserve 50 microlitros deste lisado e adicione tampão de carregamento.Posteriormente, desnature as células a 95 graus Celsius, em banho seco. Esta é a fração de entrada, contendo tanto proteínas endocitadas biotiniladas quanto proteínas não biotiniladas. Usando uma ponteira cortada, adicione 150 microlitros da suspensão de agarose estreptavidina ao lisado e incube a quatro graus Celsius por três horas, em agitador.Após três horas, centrifugue as microesferas de agarose estreptavidina a 1.500 ×g durante 30 segundos a quatro graus Celsius para obter o pellet. Reuspenda as microesferas em um mililitro de tampão de lavagem e agite por três minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue novamente para obter o pellet e descarte o sobrenadante.Repita este processo mais quatro vezes para minimizar a ligação não específica de proteínas citosólicas não biotiniladas. Em seguida, pelotize as microesferas por centrifugação a 1.500 ×g durante 30 segundos, a quatro graus Celsius. Descarte o tampão de lavagem sobrenadante e adicione 50 microlitros de tampão de carga 1×.Libere a biotina e a estreptavidina das microesferas, desnaturando a 95 graus Celsius. Esta fração deve conter apenas proteínas da superfície celular internalizadas. Em seguida, separe as frações de entrada, superfície celular e não ligada por SDS-PAGE e analise por Western blotting.Mostradas aqui estão as frações da superfície celular, intracelular e total de astrócitos não tratados e de astrócitos tratados com 24 nanomolares de laminina, analisadas para Aquaporina-4 e beta-distroglicana. Este histograma ilustra as diferenças nos níveis de Aquaporina-4 na superfície celular, em astrócitos não tratados e tratados com laminina, normalizados em relação à beta-distroglicana. Nesta figura, as frações de proteínas internalizadas coletadas aos zero, 15 e 30 minutos foram analisadas para Aquaporina-4.E este histograma resume a internalização da Aquaporina-4, com base em quatro experimentos independentes, normalizados em relação aos valores do ponto temporal de zero minuto. O asterisco indica um aumento estatisticamente significativo na quantidade de Aquaporina-4 endocitada entre 15 e 30 minutos. Quando o glutationa é usado para quebrar a ligação dissulfeto no análogo de biotina clivável, a contribuição da Aquaporina-4 da superfície celular para a fração biotinilada é drasticamente reduzida.Resultando em uma diferença clara entre as amostras de zero minuto e 15 minutos. Quando a etapa é omitida, o sinal proveniente do pool da superfície celular torna a mudança entre os dois pontos temporais indetectável. Após este procedimento, outros métodos como imunofluorescência e microscopia TIRF podem ser aplicados para responder perguntas adicionais, incluindo o tráfego físico da carga.

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Endocitose regulada governa o celular níveis de expressão de superfície da maioria das proteínas da membrana. Aqui nós utilizamos redutível, membrana reagentes Biotinilação impermeant para medir a taxa endocítica do transportador de dopamina (DAT), uma proteína de membrana politópica. O método facilita uma abordagem simples para medir a taxa de proteínas mais endocítica membrana plasmática.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Este vídeo demonstra o isolamento de proteínas intracelulares e de superfície celular de uma cultura de astrócitos. A cultura de astrócitos é colocada no gelo para inibir a endocitose e, em seguida, as proteínas da superfície celular são marcadas com um reagente de biotinilação. As células são lisadas para liberar as proteínas da superfície celular biotiniladas e as proteínas intracelulares não biotiniladas. Finalmente, grânulos revestidos com estreptavidina são usados para separar as proteínas...

Isolamento de Proteínas de Superfície Celular e Intracelulares de uma Cultura de Astrócito

Este vídeo demonstra um método para avaliar a internalização da proteína-alvo nos astrócitos corticais de camundongos usando biotinilação, seguida de lise celular, extração de proteína à base de estreptavidina, desnaturação e análise de Western blot para confirmar a internalização bem-sucedida.

Avaliação da internalização de proteínas de superfície alvo usando um derivado de biotina

Fonte: Creighton, B. A., et al. Visualização e análise do transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a visualização do transporte de carga intracelular em astrócitos cultivados usando uma sonda acidotrópica fluorescente que marca seletivamente vesículas endolisossômicas ácidas. A aquisição de imagens de lapso de tempo e a aquisição de pilha Z com um microscópio confocal permitem o rastreamento de cargas marcadas com fluorescência...

Visualização do transporte intracelular de carga em astrócitos cultivados

O tráfego de membrana envolve o transporte de proteínas da membrana plasmática para o interior da célula (ou seja, endocitose) seguido de tráfego para lisossomos para degradação ou para a membrana plasmática para reciclagem. Os métodos descritos neste artigo são projetados para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática.

Os ensaios de proteção de L-glutationa baseados em células para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática

Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Aprenda métodos de biotinilação para avaliar a expressão na superfície celular e taxas endocíticas de proteínas em astrocitos, focando na Aquaporina-4. Essas técnicas são aplicáveis a diversos tipos celulares.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação (Vídeo) | JoVE Journal

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Explorar mais vídeos