Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Neste vídeo, dois métodos serão apresentados, biotinilação da superfície celular e biotinilação de perseguição de pulso. Na demonstração a seguir, usaremos astrócitos. Esses são os tipos de células gliais mais abundantes no cérebro e expressam nossa proteína de interesse, que é a Aquaporina-4.

Os métodos que usamos neste artigo podem ser aplicados a muitos tipos diferentes de células, e podem incluir células em suspensão ou células aderentes. Essas técnicas podem ser usadas para estudar a expressão da superfície celular e a internalização de praticamente qualquer proteína transmembrana, desde que possua um domínio extracelular acessível à biotina. O objetivo geral deste ensaio de biotinilação de superfície celular é determinar os efeitos da laminina na expressão do canal permeável à água Aquaporina-4 na membrana plasmática dos astrócitos.

Para iniciar este procedimento, remova as culturas de astrócitos da incubadora e descarte o meio por aspiração. Lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS resfriado e coloque os pratos em gelo picado. Remova o CM-PBS por aspiração e, em seguida, pipete dois mililitros de tampão de biotina em cada poço.

Incline suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir uma cobertura completa antes de colocar as culturas no gelo por 30 minutos. Em seguida, remova o tampão de biotina, substitua-o por quatro mililitros de tampão de têmpera e mantenha as culturas no gelo por 10 minutos. Em seguida, aspire e substitua com a mesma quantidade do tampão de têmpera antes de deixar as culturas no gelo por 10 minutos.

Em seguida, descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS resfriado. Em seguida, raspe as células em um mililitro de CM-PBS resfriado e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, peletizar as células por centrifugação a 100 g por três minutos em uma microcentrífuga refrigerada ajustada para quatro graus Celsius.

Depois disso, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise. Em seguida, deixe as amostras no gelo por 30 minutos, agitando a cada cinco minutos. Em seguida, centrifugue o lisado a 14.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para granular qualquer detergente e materiais solúveis.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 microlitros do lisado e adicione 25 microlitros de três tampão de carregamento X a ele. Posteriormente, desnature-o aquecendo a 95 graus Celsius em banho seco.

Esta é a fração de entrada, contendo proteínas biotiniladas da superfície celular, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas. Usando uma ponta de pipeta cortada, transfira 75 microlitros de grânulos de estreptavidina agarose para o lisado e incube-o a quatro graus Celsius por três horas em um shaker. Em seguida, esfolar as esferas de estreptavidina agarose por centrifugação a 1.500 g durante 30 segundos a quatro graus Celsius.

Economize 50 microlitros do sobrenadante e adicione 25 microlitros de três amortecedores de carga X. Em seguida, desnature-o a 95 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento. Isso representa a fração intracelular e é composto principalmente de proteínas citosólicas não biotiniladas.

Depois, ressuspenda as contas peletizadas em um mililitro de tampão de lavagem e balance-as por três minutos a quatro graus Celsius. Retire as contas e descarte o sobrenadante. Repita esse processo mais quatro vezes para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas.

Adicione 50 microlitros de tampão de carga diluído a um X usando tampão de lise. Libere biotina e estreptavidina das contas desnaturando-as a 95 graus Celsius. Esta fracção deve conter apenas proteínas biotiniladas da superfície celular.

Posteriormente, separar a entrada, a superfície celular e as frações intracelulares por SDS-PAGE e analisar por western blotting. O objetivo geral do experimento de biotinilação de perseguição de pulso é determinar a taxa aproximada de internalização da Aquaporina-4 em astrócitos. Primeiro, remova as culturas de astrócitos da incubadora e aspire o meio.

Em seguida, lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS resfriado e coloque os pratos sobre gelo picado. Aspire o CM-PBS e, em seguida, pipete três mililitros de tampão de biotina em cada prato. Incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe-os no gelo por 30 minutos.

Em seguida, aspire o tampão de biotina e substitua-o por cinco mililitros de meio quente. Incube uma placa de cultura a 37 graus Celsius por 15 minutos e uma segunda placa na mesma temperatura por 30 minutos. Deixe outro prato a quatro graus Celsius como a amostra de zero minuto.

No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com quatro mililitros de CM-PBS resfriado. Em seguida, aspirar o CM-PBS e, em seguida, pipetar seis mililitros de tampão redutor sobre as células e deixar a amostra no gelo durante 15 minutos. Em seguida, substitua o meio por seis mililitros de tampão redutor fresco e coloque a amostra no gelo por mais 15 minutos.

Esta etapa é crítica, pois a glutationa contida no tampão redutor clivaria o moasis de biotina remanescente na superfície celular. Isso garante que apenas proteínas internalizadas sejam marcadas com biotina. Em seguida, remova a solução redutora e substitua-a por seis mililitros de tampão de têmpera.

Deixe a amostra no gelo por mais 15 minutos e repita a etapa de têmpera mais uma vez. Em seguida, descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes, com quatro mililitros de PBS resfriado. Aspire o CM-PBS e, em seguida, raspe as células em um mililitro de PBS resfriado, usando um levantador de células, e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.

Pulverizar as células por centrifugação a 100 g durante três minutos. Após três minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise. Deixe a amostra no gelo por 30 minutos e vortex a cada cinco minutos.

Centrifugar o lisado a 14 000 g, durante 10 minutos a quatro graus Celsius, para granular o detergente e os materiais solúveis. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 microlitros deste lisado e adicione buffer de carregamento.

Posteriormente, desnaturar as células a 95 graus Celsius, em banho seco. Esta é a fração de entrada, contendo proteínas endocitadas biotiniladas, bem como proteínas não biotiniladas. Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 microlitros da pasta de estreptavidina agarose ao lisado e incube-o a quatro graus Celsius por três horas, em um shaker.

Após três horas, esfolar as esferas de estreptavidina agarose por centrifugação, a 1.500 g, durante 30 segundos, a quatro graus Celsius. Ressuspenda as contas em um mililitro de tampão de lavagem e balance-as por três minutos a quatro graus Celsius. Retire as contas e descarte o sobrenadante.

Repita esse processo mais quatro vezes para minimizar a ligação não específica de proteínas citosólicas não biotiniladas. Em seguida, peletizar os grânulos por centrifugação a 1.500 g por 30 segundos, a quatro graus Celsius. Descarte o tampão de lavagem sobrejacente e adicione 50 microlitros de um tampão de carregamento.

Libere biotina e estreptavidina das contas, desnaturando a 95 graus Celsius. Esta fração deve conter apenas proteínas da superfície celular internalizada. Em seguida, separe as frações de entrada, superfície celular e não ligadas, por SDS-PAGE, e analise por Western blotting.

Aqui são mostradas as frações de superfície celular, intracelular e total dos astrócitos não tratados e astrócitos tratados com laminina 24 nanomolar, sondados para Aquaporina-4 e beta-distroglicano. Este histograma ilustra as diferenças nos níveis de superfície celular da Aquaporina-4, nos astrócitos não tratados e tratados com laminina, normalizados contra o beta-ditroglicano. Nesta figura, as frações proteicas internalizadas coletadas em zero, 15 e 30 minutos foram sondadas para Aquaporina-4.

E este histograma resume a internalização da Aquaporina-4, para quatro experimentos independentes, normalizados em relação aos valores do ponto de tempo de zero minuto. O asterisco indica um aumento estatisticamente significativo na quantidade de Aquaporina-4, endocitada entre 15 e 30 minutos. Quando a glutationa é usada para quebrar a ligação dissulfeto no análogo da biotina clivável, a contribuição da superfície celular Aquaporina-4 para a fração biotinilada é drasticamente reduzida.

Resultando em uma clara diferença entre as amostras de zero minuto e 15 minutos. Quando a etapa é omitida, o sinal originado do pool de superfície celular torna a alteração entre os dois pontos de tempo indetectável. Após esse procedimento, outros métodos, como imunofluorescência e microscopia TIRF, podem ser aplicados para responder a perguntas adicionais, incluindo o tráfego físico da carga.