Avaliação da internalização de proteínas de superfície alvo usando um derivado de biotina

Trate astrócitos corticais de camundongos com um derivado de biotina clivável.

Incube a baixa temperatura para evitar a internalização de proteínas e facilitar a ligação da biotina às proteínas de superfície alvo.

Lave e adicione um meio quente e, em seguida, incube para induzir a internalização das proteínas biotiniladas.

Lave e trate com um agente redutor impermeável à membrana para clivar a biotina não internalizada.

Adicione um reagente de têmpera para interromper a reação e lave.

Colha as células e centrifugue. Remova o sobrenadante.

Adicione um tampão de lise para lisar as células, liberando as proteínas biotiniladas não biotiniladas e internalizadas.

Centrifugue para pellet os restos da célula.

Colete o sobrenadante contendo proteínas, adicione esferas de estreptavidina-agarose e misture para capturar as proteínas biotiniladas.

Centrifugue para pellet as contas e descarte o sobrenadante.

Adicione um tampão de carregamento e aqueça para desnaturar e liberar as proteínas das contas.

Passe a proteína em um gel e transfira-a para uma membrana de blotting.

Detecte usando anticorpos primários e secundários para visualizar uma banda de proteína distinta, confirmando a internalizaçã