Avaliação da internalização de proteínas de superfície alvo usando um derivado de biotina

Trate astrócitos corticais de camundongos com um derivado de biotina clivável.

Incube a baixa temperatura para evitar a internalização de proteínas e facilitar a ligação da biotina às proteínas de superfície alvo.

Lave e adicione um meio quente e, em seguida, incube para induzir a internalização das proteínas biotiniladas.

Lave e trate com um agente redutor impermeável à membrana para clivar a biotina não internalizada.

Adicione um reagente de têmpera para interromper a reação e lave.

Colha as células e centrifugue. Remova o sobrenadante.

Adicione um tampão de lise para lisar as células, liberando as proteínas biotiniladas não biotiniladas e internalizadas.

Centrifugue para pellet os restos da célula.

Colete o sobrenadante contendo proteínas, adicione esferas de estreptavidina-agarose e misture para capturar as proteínas biotiniladas.

Centrifugue para pellet as contas e descarte o sobrenadante.

Adicione um tampão de carregamento e aqueça para desnaturar e liberar as proteínas das contas.

Passe a proteína em um gel e transfira-a para uma membrana de blotting.

Detecte usando anticorpos primários e secundários para visualizar uma banda de proteína distinta, confirmando a internalização bem-sucedida da proteína.

Primeiro, remova as culturas de astrócitos da incubadora e aspire o meio. Em seguida, lave as células três vezes com 4 mililitros de CM-PBS gelado e coloque os pratos em gelo picado. Aspire o CM-PBS e, em seguida, pipete 3 mililitros de tampão de biotina em cada prato. Incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe-os no gelo por 30 minutos.

Em seguida, aspire o tampão de biotina e substitua-o por 5 mililitros de meio quente. Incube uma placa de cultura a 37 graus Celsius por 15 minutos e uma segunda placa na mesma temperatura por 30 minutos. Deixe outro prato a 4 graus Celsius como a amostra de zero minuto.

No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com 4 mililitros de CM-PBS resfriado. Em seguida, aspirar o CM-PBS e, em seguida, pipetar 6 mililitros de tampão redutor sobre as células e deixar a amostra no gelo durante 15 minutos.

Em seguida, substitua o meio por 6 mililitros de tampão redutor fresco e coloque a amostra no gelo por mais 15 minutos.

Esta etapa é crítica, pois a glutationa contida no tampão redutor cliva as porções de biotina remanescentes na superfície celular. Isso garante que apenas as proteínas internalizadas sejam tendenciosas e rotuladas.

Em seguida, remova a solução redutora e substitua-a por 6 mililitros de tampão de têmpera. Deixe a amostra no gelo por mais 15 minutos e repita a etapa de têmpera mais uma vez. Em seguida, descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes com 4 mililitros de PBS resfriado.

Aspire o CM-PBS e, em seguida, raspe as células em 1 mililitro de PBS resfriado usando um elevador de células e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga. Pulverizar as células por centrifugação a 100 g durante três minutos. Após três minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 microlitros de tampão de lise.

Deixe a amostra no gelo por 30 minutos e vortex a cada cinco minutos. Centrifugue o lisado a 14.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius para pellet o detergente e os materiais solúveis. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.

Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 microlitros da pasta de estreptavidina agarose ao lisado e incube-o a 4 graus Celsius por três horas em um shaker. Após três horas, pulverizar as esferas de agarose estreptavidina por centrifugação a 1.500 g por 30 segundos a 4 graus Celsius. Ressuspenda as contas em 1 mililitro de tampão de lavagem e balance-as por três minutos a 4 graus Celsius. Retire as contas e descarte o sobrenadante.

Repita esse processo mais quatro vezes para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas. Em seguida, pelete as esferas por centrifugação a 1.500 g por 30 segundos a 4 graus Celsius. Descarte o tampão de lavagem sobrejacente e adicione 50 microlitros de tampão de carregamento 1x.

Libere biotina e estreptavidina das contas desnaturando a 95 graus Celsius. Esta fração deve conter apenas proteínas da superfície celular internalizada. Em seguida, separe a entrada, a superfície celular e as frações não ligadas por SDS-PAGE e analise por Western blotting.