Um método computacional para quantificar a atividade Circadian voar

Na maioria dos animais, os relógios circadianos orquestram processos comportamentais e moleculares e os sincronizam com o ciclo diário de luz e escuridão. Nas moscas-das-frutas, o relógio é normalmente estudado usando registros locomotores. Aqui está um exemplo de locomoção média do tipo selvagem medida em ciclo de luz de 12 horas, ciclo escuro de 12 horas, o ciclo claro-escuro mostrado com barra amarelo-preta no topo.

Um registro típico de mosca mostra um padrão biomodal complexo com dois picos de atividade, um pico matinal que acontece ao amanhecer e um pico noturno que acontece ao anoitecer. Esses dois picos juntos formam uma forma de onda muito diferente das oscilações senoidais observadas nos genes do relógio, sugerindo que os mecanismos, além do relógio, têm um efeito profundo na produção do padrão observado nos dados comportamentais. Aqui apresentamos o primeiro método que descreve matematicamente os padrões temporais na atividade da mosca.

Ajustamos os dados de atividade com uma forma de onda modelo que imita a locomoção da mosca. Nosso modelo consiste em quatro termos exponenciais, dois termos do pico da manhã e dois termos do pico da noite. Juntamente com o período circadiano, nosso modelo possui nove parâmetros independentes.

Os parâmetros B definem a taxa de aumento da manhã, decaimento matinal, aumento da noite e decaimento noturno. TM e TE definem as larguras dos picos da manhã e da noite, e HM e HE definem as alturas dos picos. Juntos, esses parâmetros descrevem totalmente o tamanho e a forma dos picos da manhã e da noite no padrão de atividade.

Nosso método pode ser aplicado para elucidar os mecanismos e substratos subjacentes ao padrão de atividade bimodal comumente observado nas leituras locomotoras de moscas. Para o experimento de locomoção, prepare tubos individuais com comida em uma extremidade e algodão na outra. Para isso, primeiro, coloque de cinco a seis gramas de comida para moscas em um copo de 50 mililitros.

Corte os alimentos em pedaços pequenos, para que seja mais fácil derretê-los no microondas. O monitor de atividade único acomoda 32 tubos individuais. Portanto, pegue 32 tubos e conecte-os usando um elástico.

Derreta os alimentos no copo no micro-ondas. Aqueça os alimentos por aproximadamente 10 a 15 segundos. Pare o micro-ondas a cada cinco segundos e agite um pouco o copo com os alimentos para garantir o derretimento igual dos alimentos.

Certifique-se de que todos os alimentos estejam derretidos e que não haja pedaços sólidos de comida no copo. Enquanto os alimentos ainda estiverem líquidos, insira os tubos no copo com os alimentos. Mova os tubos para cima e para baixo um pouco, para que fiquem igualmente cheios.

Deixe os alimentos esfriarem e solidificar por aproximadamente uma hora. Depois que os alimentos estiverem sólidos, remova os tubos do béquer usando movimentos rotacionais para que os alimentos não grudem no fundo do béquer. Em seguida, remova o elástico.

Sele a ponta com alimentos usando cera. Para isso, primeiro, limpe cuidadosamente o tubo com uma toalha de papel. Em seguida, pressione o tubo contra a cera.

Verifique visualmente a qualidade da vedação e, se necessário, repita a vedação novamente. Usando esta técnica, sele todos os tubos para o experimento. A outra extremidade dos tubos fecha com o algodão.

O algodão deixará o ar passar enquanto mantém as moscas presas dentro dos tubos. Também é fácil de remover e colocar de volta, o que será útil quando carregarmos os tubos com as moscas para o experimento. Agora, depois que os tubos estiverem prontos, carregue-os com moscas para o experimento.

Para isso, descarregue moscas na plataforma com CO2. Em seguida, usando a escova, coloque cuidadosamente uma única mosca em cada tubo individual. Coloque o tubo com a mosca no monitor.

Na mesma ordem do monitor, a locomoção da mosca será registrada na saída file pelo sistema do monitor. Conecte o monitor ao computador e coloque-o em uma incubadora que mantenha temperatura e umidade constantes. Com base no experimento, defina as condições adequadas de claro/escuro.

Para experimentos claros / escuros, mantenha as moscas no ciclo claro-escuro durante todo o experimento. Não use o primeiro dia de medições na análise. Para experimentos de escuridão constante, primeiro, mantenha as moscas por dois dias em condições de luz / escuridão para arrastamento e sincronização dos relógios e, em seguida, mude para escuridão constante.

Não use medições do primeiro dia de escuridão constante na análise. Antes de passar para a próxima seção, recomendamos a leitura do protocolo. O sistema do monitor produzirá um único arquivo que contém a atividade de todas as moscas no monitor.

As últimas 32 colunas do arquivo de saída contêm a atividade de moscas individuais. Nosso programa funciona com atividades de mosca única. Portanto, divida o arquivo de saída em vários arquivos de atividade de voo único.

Cada arquivo deve ser um arquivo TXT de coluna única. Agora, depois de prepararmos os arquivos de atividade, podemos executar nossa análise. Execute a função ModelFitPS3 na janela de comando do MATLAB com os seguintes parâmetros de entrada.

Taxa de amostragem, coloque o intervalo de tempo da amostra de dados em segundos. Por exemplo, nossos dados foram obtidos com taxa de amostragem de 20 segundos. Portanto, colocamos 20 aqui.

Como intervalo de bin, coloque o intervalo de tempo em minutos, no qual os dados serão binned para melhor visualização. Recomendamos binning para 20 ou 30 minutos, mas, por enquanto, vou colocar 10 aqui, apenas para mostrar mais tarde como ele pode ser facilmente alterado. Para tendência, coloque um se os dados mostrarem tendência de linha de base e zero caso contrário.

Nossos dados não têm nenhuma tendência de linha de base. Portanto, coloquei zero aqui. Pressione Enter para executar a função.

Na janela pop-up, selecione o arquivo de atividade de voo único e pressione Abrir. O programa calculará e plotará o espectro de potência dos dados. Nessa janela, determine o período primário nos dados.

Para isso, clique com o botão esquerdo do mouse no pico no período circadiano ou com o botão direito do mouse no pico no segundo harmônico, replicado aproximadamente no período circadiano dividido por dois. No nosso caso, o pico no segundo harmônico é muito maior e mais nítido do que o pico no período circadiano. Portanto, usamos a segunda opção.

Em seguida, o programa plotará os dados compartimentados para o intervalo de compartimento selecionado. Como você pode ver, no intervalo de 10 minutos, o pico da manhã e da noite não é muito bem visualizado. Portanto, queremos alterar esse valor.

Para fazer isso, basta clicar com o botão direito do mouse em qualquer lugar do gráfico. Na nova caixa de diálogo, digite o novo valor para o intervalo de compartimento. Recomendamos compartimentalizar para um intervalo de tempo de 20 minutos.

Portanto, colocamos 20 aqui. Pressione OK. O programa redesenha imediatamente os dados com o novo valor do intervalo de compartimento. Para aceitar esse valor, basta clicar com o botão esquerdo do mouse em qualquer lugar do gráfico.

O programa agora redesenhará os dados e mostrará apenas cinco dias de medição. Nesta janela, selecione o primeiro pico matinal que será usado na análise. Às vezes é necessário pular um ou dois dias, o que leva para a mosca se adaptar ao ciclo claro-escuro.

Para selecionar o pico da manhã, basta clicar no pico preferido. O programa redesenhará os dados e agora mostrará apenas três dias de medições a partir do pico matinal selecionado. As linhas verticais azul e vermelha mostram o primeiro pico da noite e o segundo pico da manhã com base no período selecionado na primeira janela.

Nesta janela, selecione o ponto que o tubo usou para o ajuste preliminar dos dados com a função de modelo. Para isso, clique nos seguintes pontos nesta ordem específica. Primeiro, clique no topo do primeiro pico da manhã.

O clique é indicado com a estrela vermelha na parte inferior, mostrando a localização do clique. Em seguida, clique no final do pico da manhã, depois no início do pico da noite, depois no topo do pico da noite, depois no final do pico da noite e por último no topo do pico da manhã do dia seguinte. O programa irá plotar o espectro de potência novamente, uma vez que os parâmetros finais são obtidos a partir do ajuste espectral.

O espectro agora é plotado como frequência no eixo x e o pico circadiano está localizado no lado esquerdo do gráfico. O período determinado na primeira etapa é mostrado com uma linha vertical vermelha. Para selecionar os pontos de ajuste, primeiro, determine aproximadamente o período primário.

Para isso, clique com o botão esquerdo do mouse no pico no período circadiano ou clique com o botão direito do mouse no pico no segundo harmônico. Usaremos novamente a segunda opção. Depois disso, um controle deslizante aparecerá na parte inferior para selecionar os pontos para o ajuste espectral.

Os pontos serão mostrados com círculos vermelhos e aparecerão após mover o controle deslizante. Mova o controle deslizante para a esquerda e para a direita e coloque os pontos o mais próximo possível dos topos dos picos espectrais. Depois que a melhor imagem for obtida, pressione o botão Aceitar e o programa ajustará os pontos selecionados com a expressão analítica para o espectro de potência do modelo.

Após o ajuste, o programa produzirá mais dois gráficos. O primeiro é um espectro de potência do modelo construído com os parâmetros extraídos. Em segundo lugar, são os dados ajustados ao modelo.

Os dados são mostrados com uma linha preta e o modelo é mostrado com uma linha vermelha. Pode-se ver que a função se assemelha muito aos dados, especialmente os últimos três dias de atividade. Os parâmetros extraídos são salvos no arquivo TXT de parâmetros de ajuste do modelo.

Após o nome do arquivo, os parâmetros são salvos na seguinte ordem, primeiro b do decaimento matinal, depois b do nascer da manhã, b do nascer da noite, b do decaimento noturno, período circadiano, depois largura do pico da manhã dividida pelo período circadiano, largura do pico da noite dividida pelo período circadiano, altura do pico da manhã, altura do pico da noite e o erro de ajuste do ajuste espectral. Além do arquivo de parâmetros de ajuste do modelo, o programa também produzirá mais dois arquivos. Primeiro, os dados se ajustam à função do modelo e, segundo, é um ajuste espectral.

Execute essa análise com outros arquivos de atividade. Todos os parâmetros extraídos são salvos no arquivo TXT de parâmetros de ajuste do modelo e podem ser usados para conectar a saída comportamental aos mecanismos subjacentes que regulam o comportamento diário da mosca controlado pelo padrão de atividade do modelo.