Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

O objetivo geral deste procedimento é determinar o comprimento dos telômeros em células eucarióticas usando uma versão modificada de um procedimento de análise de fragmentos de restrição de telômeros, descrito pelos médicos Jerry W. Shay, Woodring Wright e colegas. Ao fornecer dados sobre o comprimento dos telômeros, o procedimento pode responder a perguntas sobre biologia celular, medicina comportamental, epidemiologia e doenças infecciosas, sobre os efeitos da idade, estresse, tratamentos medicamentosos e infecções. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma medição direta em quilobases do comprimento médio dos telômeros em uma variedade de células.

As amostras de DNA genômico a serem analisadas foram extraídas das células usando um kit comercial de extração de DNA, conforme descrito no protocolo de texto. Realizar a digestão do DNA genômico em um volume final de 20 a 40 microlitros. Combinar o seguinte em cada tubo de microcentrífuga: três microgramas de ADN genómico; 10x tampão de digestão de DNA; um microlitro de enzima de restrição Rsa1; um microlitro de enzima de restrição Hinf1; e água estéril e deionizada até o volume final.

Centrifugue brevemente para garantir que todos os componentes estejam no fundo do tubo. Incube as digestões a 37 graus Celsius, por pelo menos 16 horas. Comece este procedimento preparando a solução de agarose a 0,6% conforme descrito no protocolo de texto.

Prepare o sistema de eletroforese em gel para fundição em gel. Prenda os portões finais à bandeja de fundição em gel. Assim que a solução de gel de agarose esfriar a 50 graus Celsius, despeje-a na bandeja de fundição de gel, coloque um cone no gel e deixe o gel endurecer por 45 minutos descoberto em temperatura ambiente.

Remova as portas finais da bandeja de fundição e remova o pente do gel. Encha o sistema de eletroforese em gel, com tampão de eletroforese até a linha de enchimento, garantindo que o gel esteja completamente submerso no tampão. Carregue os poços do gel com as amostras de DNA, deixando um poço em branco entre as amostras.

Adicione 10 microlitros de uma escada de DNA nos poços nas extremidades opostas do gel. Execute a eletroforese em gel a 150 volts por 30 minutos, para mover rapidamente o DNA para o gel. Após 30 minutos, ajuste a tensão para 57 volts e funcione por 18 a 24 horas.

Depois que o gel tiver funcionado por 18 a 24 horas, desligue a fonte de eletrotroforese e remova a bandeja de fundição de gel com o gel do tampão de eletrofose. Corte o canto superior direito do gel para servir de referência para a orientação do gel. Corte um pedaço de papel de filtro em um tamanho ligeiramente maior que o gel.

Coloque o papel de filtro em cima do gel em uma bandeja de fundição e deixe o papel absorver o excesso de solução no gel. Remova cuidadosamente as bolhas de ar entre o papel de filtro e o gel, usando uma pipeta como rolo para espremer as bolhas pelas laterais. Remova o gel da bandeja de fundição virando o gel e o papel de filtro para que o papel fique embaixo do gel.

Transfira o gel com o papel de filtro para um secador de gel e cubra o gel com filme plástico. Remova todas as bolhas de ar entre o filme plástico e o gel usando uma pipeta como rolo. Seque o gel a 50 graus Celsius por duas horas.

Depois que o gel secar, remova o filme plástico e transfira o gel e o papel de filtro para um prato de vidro contendo 250 mililitros de água deionizada. Remova cuidadosamente o papel de filtro e incube o gel em temperatura ambiente por 15 minutos. Coloque o gel em cima de uma malha de náilon de 12 por 12 polegadas.

Enrole a malha de náilon e o gel juntos, certificando-se de que o gel não esteja em contato consigo mesmo. Coloque a malha e o gel em um tubo de hibridização. Combine 100 mililitros de 5x SSC e 12 microlitros de coloração de ácido nucleico fluorescente verde e coloque no tubo de hibridização.

Incube por 30 minutos a 42 graus Celsius em um forno de hibridização com rotação. Proteja a solução da luz. Após 30 minutos, remova a malha de náilon e o gel do tubo de hibridização.

Abra e coloque em um prato de vidro contendo 250 mililitros de água deionizada. Remova suavemente a malha de nylon. Fotografe o gel usando um gerador de imagens de fósforo com as configurações indicadas.

Prepare a sonda de telômero radioativo seguindo os regulamentos da instalação para lidar com radioatividade. No tubo de microcentrífuga, combine o seguinte: dois microlitros de sonda de telômero; 2,5 microlitros de tampão de reação de polinucleotídeo quinase 10x; três microlitros de ATP marcado no grupo fosfato gama com P32; quatro microlitros de polinucleotídeo quinase T4; e água deionizada, estéril e livre de DNase até um volume final de 20 microlitros. Centrifugue brevemente o tubo.

Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora. Centrifugue o tubo brevemente e incube a 65 graus Celsius por 20 minutos para interromper a reação. Carregar a solução de sonda radioactiva numa coluna de cromatografia G25 preparada e centrifugar durante dois minutos a 700 vezes g.

Guarde o filtrado, que contém a sonda de telômero radioativo. Coloque o gel em um prato de vidro contendo 250 mililitros de solução desnaturante e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova a solução desnaturante e substitua por 250 mililitros de água desionizada estéril.

Incube por 10 minutos em um agitador orbital em temperatura ambiente. Remova a água deionizada. Substitua por 250 mililitros de solução de neutralização e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Enrole o gel em uma malha de náilon e coloque no tubo de hibridização. Adicione 20 mililitros da solução de hibridização e incube em um forno de hibridização a 42 graus Celsius por 10 minutos com rotação. Após 10 minutos, remova a solução de hibridização e substitua por 20 mililitros de solução de hibridização nova.

Adicione toda a sonda de telômero e incube em um forno de hibridização a 42 graus Celsius com rotação durante a noite. Quando a hibridização com a sonda de telômero estiver completa, remova o gel e a malha do tubo de hibridização e coloque em um prato de vidro, contendo 250 mililitros de 2x SSC. Desenrole e remova a malha de náilon do prato.

Coloque o prato de vidro em um agitador orbital e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova o SSC 2x, substitua por 250 mililitros de SSC 0.1x, mais solução de SDS 0.1% e incube por 15 minutos no agitador orbital em temperatura ambiente. Remova a solução SSC 0.1x mais 0.1% SDS.

Substitua por 250 mililitros de 2x SSC e incube por mais 15 minutos no agitador orbital. Remova o gel do 2x SSC e embrulhe o gel em filme plástico. Remova todas as bolhas e bolsas de ar entre o gel e o filme plástico.

Coloque o gel em um de exposição com uma tela de fósforo e exponha a tela de fósforo ao gel durante a noite. No dia seguinte, use um gerador de imagens de fósforo para obter imagens da tela de fósforo exposta. As imagens de fósforo são posteriormente usadas para quantificação do comprimento dos telômeros, conforme descrito no protocolo de texto.

Três concentrações de DNA isoladas de uma linhagem celular de fibroblastos de prepúcio humano imortalizada e células mononucleares do sangue periférico humano foram analisadas quanto ao comprimento dos telômeros. Esta imagem de fósforo do gel de agerose seco corado com coloração de ácido nucleico fluorescente verde mostra a localização das bandas da escada de DNA nas raias um e oito. A distância medida do topo do gel a cada padrão de peso molecular é indicada por setas azuis.

Após a hibridização com uma sonda de telômeros, as bandas dos telômeros aparecem como manchas em cada pista. Grades de 150 caixas foram calculadas para cada pista mais uma pista de fundo. As áreas de análise selecionadas para cada conjunto de amostras são mostradas.

Faixas de fundo separadas marcadas como B foram selecionadas para cada conjunto de amostras, para garantir que as intensidades de fundo fossem semelhantes para cada conjunto de amostras. Os cálculos do comprimento médio dos telômeros revelaram um comprimento médio dos telômeros mais alto na linhagem celular imortalizada do que nas células mononucleares do sangue periférico humano. Esses resultados também demonstram que a quantidade de DNA genômico analisada em cada pista é fundamental para obter um sinal detectável após a hibridização.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 12 horas distribuídas por 2 dias e meio, com duas incubações noturnas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar pelo menos três microgramas de DNA para cada amostra e medir cada amostra em duplicata. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de envelhecimento explorassem mecanismos responsáveis pela manutenção do comprimento dos telômeros em diferentes espécies animais, incluindo humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar diretamente o comprimento médio dos próprios telômeros. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar jalecos e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.