Name: Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência In Situ Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a técnica FISH com sondas PNA para visualizar e quantificar telômeros em Caenorhabditis elegans. Este método conciso permite análise em menos de 24 horas, auxiliando pesquisas sobre envelhecimento celular e câncer.

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Cepas de vermes mutantes foram gentilmente cedidas pelo Caenorhabditis Genetics Center. Esta pesquisa foi apoiada por uma doação do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria de Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da Coreia (número de concessão: HI14C1277).

1. As sondas de marcação com digoxigenina-dUTP por PCR <ol><li> Realizar etiquetagem 10x PCR com mistura de dNTP contendo digoxigenina-dUTP como previamente descrito 13. </li><li> Purificar produto de PCR com a purificação spin-coluna de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Se a sonda é mais curto do que 200 pb, remover livre digoxigenina-dUTP por cromatografia em coluna de spin-a partir da mistura reaccional em vez de purificação de spin-coluna. </li></ol></li></ol> 2. Preparar Slides polilisina revestido Nota: O procedimento completo demora cerca de 2 horas. A maior parte dos passos são realizados à temperatura ambiente excepto para o passo de secagem. <ol><li> Limpeza das lâminas <ol><li> Colocar as lâminas em um recipiente plástico e enxaguar as lâminas brevemente com água destilada (DW). Remover a água e encher o recipiente com DW contendo 1% de limpa-vidros. </li><li> Agita-se as lâminas durante 15 minutos a 50 rpm à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas com DW 3vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as lâminas com etanol a 70% durante 15 min com agitação. Descartar 70% de etanol e colocar as lâminas sobre um bloco seco de 65 ° C e secar ao ar durante 15 min. </li></ol></li><li> polilisina revestimento de lâminas de vidro multi-poços Nota: revestimento polilisina de vidro corrediça é um passo importante, uma vez que prevê a adesão da amostra durante todo o processo de coloração. Mal lâmina revestida irá resultar na perda de amostra. <ol><li> Dilui-se a solução stock de polilisina a 0,01% (w / v) em água destilada. Adicionar 20 ul da diluído a 0,01% (w / v) de polilisina para os poços de uma lâmina de vidro limpa. </li><li> Incubar a lâmina de vidro durante 5 min à TA. </li><li> Colocar as lâminas em um bloco seco a 65 ° C e ar seco durante 1 h. </li><li> Armazenar os slides polilisina na caixa livre da poeira. </li></ol></li></ol> 3. Fixação de Worms na lâmina de vidro (Figura 1) <ol><li> Preparando embriões para FISH Nota: vermes Colheita antes de tudo tele comida bacteriana é consumida por assistindo os meios de crescimento sob o microscópio. A fome reduz a produção de ovos de vermes adultos e aumenta a eclosão dos ovos. Métodos pormenorizados são descritos em 14,15. <ol><li> Cresça os vermes em 50 mM de placa de Petri de acordo com métodos padrão 14. </li><li> Depois de toda a comida bacteriana é consumido, cortar o ágar no trimestre com uma espátula. Esterilizar a espátula antes de cortar para evitar a contaminação. </li><li> Coloque todo o pedaço de agar na 100 milímetros meios de crescimento de nematóides (NGM) placa. Vire a peça agar de cabeça para baixo para os vermes para alcançar a comida bacteriana fresca. </li><li> Após 48 a 72 horas, recolher os vermes com tampão M9. Adicionar 3 - 5 ml de tampão M9 na placa NGM. Pipeta tampão M9 na superfície de NGM para lavar os vermes. </li><li> Recolhe-se o líquido com vermes e adicionar a um tubo de 15 ml. Nota: Se houver resíduos agar após a colheita, centrifugar os vermes em uma solução de sacarose 30%. Enquanto os detritos são sedimentadas, vermes flutuar sobrea superfície. </li><li> Adicionar tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 xg durante 3 min e remover a maior parte do tampão M9. Repita este passo mais 2 vezes. Nota: Se os vermes ainda estão flutuando após a centrifugação, defina o nível de freio da centrífuga para o valor = 1. </li><li> Aspirar tampão M9. Adicionar solução de branqueamento para os vermes. Por 0,5 ml de vermes, adicionar 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 mL de 5 M KOH. </li><li> Incubar os vermes com agitação à TA durante 3 min a 50 rpm. vermes vortex durante 15 segundos para cortar mecanicamente os vermes e expor os ovos. </li><li> Observe o tubo sob um microscópio de dissecção durante o clareamento. Certifique-se de que os vermes são cortadas ao meio e os ovos são liberados. Quando a maior parte do corpo adulto é dissolvido, adicione tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar a maior parte da M9 e adicionar tampão M9 fresco para fazer aumentar o volume para 15 ml. etapa de lavagem Repita 3 vezes. Nota:Evitar o uso de quantidade excessiva de vermes, em que dificultam o processo de branqueamento. Manter o tempo de reacção total a menos de 8 minutos até a lavagem. Over-branqueada ovos produzem forte autofluorescência. </li><li> Adicionar solução salina tamponada com fosfato de polissorbato-20 (PBST) até 200 uL e 200 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) para tornar a 2% de PFA. Atenção: Desde PFA é cancerígeno, usar vestuário de protecção, luvas e proteção ocular antes de utilizar PFA. </li><li> Adicionar 40 ul de os ovos em 2% de PFA para o poço de polilisina revestida slides. </li><li> Colocar as lâminas numa câmara húmida e incubar durante 15 min à TA. Feche a câmara úmida logo após os slides são colocados dentro. Nota: Os ovos para liquidar o fundo de slides enquanto está a ser corrigido. </li></ol></li><li> Preparando gônadas dissecados para peixes <ol><li> Colheita vermes adultos crescidos em 50 mm placa NGM pipetando 1 ml de tampão M9. vermes colheita antes de alimentar bacteriana está esgotada. </li><li> Lave os vermes a partir de qualquer wit bactériash tampão M9, 2 vezes. Nota: as bactérias residuais podem interferir com as gônadas dissecados de degola para lâminas de polilisina revestido. </li><li> Agregar as minhocas por centrifugação a 300 x g. Remover M9 e transferir os vermes à placa NGM vazia por micropipeta. </li><li> Adicionar 30 mL de tampão M9 contendo levamisole 2 mM em um poço de polilisina tratada slide. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão M9 para um tubo de 1 ml. Utilize este tampão para transferir os vermes com uma pipeta boca. </li><li> Encher a ponta da pipeta de boca com tampão M9 pela colocação de um capilar no tubo 1 ml contendo o tampão M9. </li><li> Sob microscópio de dissecação, coloque a ponta da pipeta na boca apenas na frente da cabeça do verme adulto e arraste pipeta de boca de modo que a cabeça de vermes entra na pipeta de boca. Uma vez que a cabeça de vermes entra a ponta, todo o corpo de verme serão atraídos para a ponta. </li><li> Transfira os vermes para o slide polilisina revestido usando pipeta boca. </li><li> Usando uma navalha, corte def a cabeça ou a ponta da cauda de vermes no slide. Quando o worm é cortado, as gônadas irá aparecer. Gônadas vai ficar com os slides. <ol><li> Preparar pelo menos 30 vermes em um poço. Mais poços pode ser usado por mais 30 vermes. </li></ol></li><li> Coloque a lâmina na câmara húmida e aspirar o tampão de M9 com pipeta de boca. </li><li> Fixar a amostra por adição de 20 ul de 2% de PFA à TA durante 15 minutos em câmara húmida. </li></ol></li></ol> 4. Fixação e permeabilização <ol><li> Coloque um bloco de alumínio em gelo seco e armazená-lo em um congelador (-80 ° C). metanol loja e acetona em -20 ° C. </li><li> Após PFA passo de fixação 3.1.15 ou 3.2.11, remova o fixador usando micropipeta deixando ~ 5 mL do fixador. </li><li> Coloque outro slide polilisina revestido na lâmina de amostra. Remover o fixador com toalha de papel, se a solução for excessiva. Não mova os slides uma vez que eles estão presos juntos. </li><li> Congelar as lâminassobre o bloco de alumínio de pelo menos 15 min. Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias. </li><li> Enquanto os slides estão sendo congelados, coloque os frascos contendo metanol frio e acetona em gelo. </li><li> Tome os slides fora e torcê-los a congelar-rachar a amostra. Descartar a corrediça superior. mergulhar imediatamente o slide para o metanol gelado durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para acetona arrefecida em gelo durante 5 min. </li><li> Lavar as lâminas 3 vezes com PBST, durante 5 min para remover fixador residual. Avance para o próximo passo ou armazenar as lâminas em etanol a 100% a 4 ° C. Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias. </li></ol> 5. Hibridação de células fixadas <ol><li> Adicionar 20 ul de solução de RNase (PBST contendo 10 ug / ml de RNase A). Incubar a lâmina na câmara húmida a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Lava-se a corrediça duas vezes em solução salina e 2x com citrato de sódio polissorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada. </li><li> Adicionar 20ul de solução de hibridação e o colocar em câmara húmida a 37 ° C incubadora. Depois de 1 h, remover a solução de hibridação por pipetagem. </li><li> Antes de remover solução de hibridização, preparar a sonda. Se a sonda é DNA de cadeia dupla, desnaturar as sondas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min num bloco seco. Após o aquecimento, esfriar a sonda brevemente gelo. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de hibridação contendo sonda com a amostra. Para sonda de PNA, a concentração de uso a uma razão de 1: 2000 e de uma sonda marcada com Dig, concentração de uso a uma razão de 1: 200. Cobrir a amostra com tampa de vidro. </li><li> Coloque uma toalha de papel embebido com água sobre o bloco de aquecimento (80 ° C). Coloque uma tampa de caixa de plástico no bloco de aquecimento para preservar a umidade e temperatura. </li><li> Depois de a temperatura do bloco de aquecimento se estabilizou (a 80 ° C), colocar a lâmina de amostra sobre a toalha de papel e aquecida cobrir as amostras com a tampa da caixa de plástico. Desnaturar a amostra durante 3 minutos. </li><li> IncUbate as lâminas em câmara úmida durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 6. lavagens e Imunofluorescência <ol><li> Aquecer a solução de lavagem de hibridação (SSC 2x, 50% de formamida) a 37 ° C. </li><li> Lava-se a amostra em duas vezes o PBST à TA durante 5 min. Retire a tampa de vidro. </li><li> Lava-se a amostra na solução de lavagem de hibridação a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lave a lâmina de amostra em PBST 3 vezes à temperatura ambiente. Nota: Execute todos os passos subsequentes na câmara húmida à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de bloqueio e incubar durante 1 h à TA na câmara húmida. </li><li> Remoção da solução de bloqueio e adicionar solução de anticorpo conjugado com FITC anti-digoxigenina (1: 200) durante 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 7. Montagem e Observação <ol><li> Lava-se a lâmina de amostra com PBST 2 vezes durante 15 minutos cada. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de montagem com DAPI. Coloque a tampa de vidro e pressione suavemente. Remova qualquer excesso de soluçãocom uma toalha de papel. </li><li> Para evitar a evaporação da solução de montagem, selar as bordas da tampa de vidro com unha polonês. </li><li> Observar ao microscópio confocal. Excluir embriões com elevado ruído de fundo. Concentre-se em um campo com 4 - 20 núcleos. </li><li> Tome imagens de acordo com as instruções do fabricante com lente objetiva de 100X. Nota: Excite amostra com 405 a laser nm para DAPI, com 555 a laser nm para Cy3, com 488 a laser nm para FITC. </li></ol> 8. Quantificação dos Telómero sinal Nota: A quantificação foi realizada tal como anteriormente descrito 16. Todas as imagens que estão a ser comparadas deve ser tomado com mesma configuração, incluindo o tempo de exposição e uma fonte de luz. <ol><li> Exportar a imagem em formato .tif. </li><li> Baixar e instalar o software de análise de imagem. </li><li> Executar o software de análise de imagem e clique no botão Concordo. </li><li> Clique no botão aberto. Abra as imagens com os peixes dos telômeros, clicando duas vezes no arquivo de imagem. </li><li> Clique[Editar] - [região de processamento seleção], seleccione uma região de interesse por clique com o botão esquerdo e arrastando. Excluir toda a coloração não específica. </li><li> Clique [medida] - [manchar densidades ópticas], selecione o canal com o sinal dos telômeros e digite o nome do arquivo para salvar os resultados no arquivo .txt. Nota: A coluna de resultados estão na seguinte ordem: A fluorescência de ponto, a intensidade da mancha e a área da mancha de fundo. </li><li> Copiar os valores e subtrair intensidade da mancha de fundo de fluorescência da mancha. Os valores podem agora ser analisados ​​estatisticamente. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A principal vantagem do nosso protocolo é a simplicidade do processo sem danos visíveis para a morfologia da estrutura celular. Vários passos foram otimizados para C. elegans FISH neste protocolo. Os passos críticos para os peixes de sucesso incluem a rotulagem de sondas, a fixação de embriões e penetração. método de marcação com digoxigenina-dUTP fornece um método de rotulagem de fácil utilização por PCR ou por nick-translation. Para rotular sequência alvo por muito tempo, é o preferido nick-translation. Neste...

Telômeros protege as extremidades cromossômicas de fusão e degradação aberrante. dos telómeros de mamífero é composto de repetições rico em G hexaméricas, TTAGGG, e complexos shelterin. A sequência do telómero repetição da nemátodo é semelhante aos dos mamíferos (TTAGGC). A maior parte dos eucariotas utilizam telomerase para adicionar repetições telómeros para as suas extremidades cromossómicas. No entanto, de 10 - 15% de células de cancro utilizam mecanismo independente da telomerase, conhecido como Alongamento Alternativa dos telómeros (ALT) 3. Anteriormente, relatou que repete a telómeros e suas sequências associados, nomeados como tAlt, foram amplificados nos telômeros de linhas mutantes de telomerase que sobreviveram a esterilidade crítica 2. Comprimento dos telómeros foi medida por PCR quantitativo, ou por transferência de Southern, o que proporciona o comprimento médio do total de telómeros 4,5,6,7. Contagem lida da repetição dos telômeros em dados de sequenciamento do genoma inteiro é também um indicador do total conteúdo dos telômeros 8. embora Single telômero Comprimento Análise (STELA) poderia fornecer o comprimento de uma única telômeros, ele não pode fornecer informação espacial dos telômeros 9. Enquanto POT-1 :: proteína repórter mCherry fornece a informação espacial dos telômeros in vivo, não pode representar comprimentos de telômeros de cadeia dupla, como POT-1 é um single-filamento de proteína 10 de ligação dos telômeros. Embora os métodos acima mencionados fornecer as informações média de seqüências repetitivas, hibridização fluorescente in situ (FISH) permite observar a quantidade e padrão espacial das seqüências individuais de interesse em uma escala cromossômica. Em vez da purificação do ADN, os tecidos ou as células são fixadas para preservar a informação espacial nativa em peixes. Assim, o peixe é uma ferramenta quantitativa e qualitativa para a observação de sequências de repetição individuais, como repete a telómeros. Este protocolo fornece um método eficiente para a detecção simultânea de ambos telomeros e outras repete com base em melhorias de métodos anteriormente descritos 11,12. C. elegans larvas ou adultos são organismo multicelular com células altamente diferenciadas. A heterogeneidade das células impede-se na análise quantitativa de um grande número de pontos a telómeros. Para maximizar o número de células analisadas, os embriões são isolados e espalhe sobre as lâminas revestidas com polilisina para os peixes. Além disso, este protocolo pode também ser combinada com a imunofluorescência. Como uma prova de que o protocolo funciona, mostram que é possível observar e quantificar duas sequências repetitivas diferentes. sonda de DNA contra TALT1 foi gerado com simples PCR incorporando digoxigenina-dUTP. Em seguida, esta sonda TALT1 e sonda PNA telômero marcados com fluorescência foram hibridizadas simultaneamente. Subsequentemente, digoxigenina foi detectada por métodos de imunofluorescência canónicas. Apresentamos aqui as imagens representativas onde TALT1 colocalized com o telômero no TRT-1 </em&gt; sobreviventes.

<table><tbody><tr><td>Sonda PNA</td><td>PANAGENE</td><td>pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Fluoresceína, fragmentos de Fab</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>uso 1:200 diluído em PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenina-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>preparar paraformaldeído a 4% aquecendo em DW com poucas gotas de NaOH. adicione 0,1 volume de 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr>Solução <td></td><td></td> de<td>hibridização</td><td>3x SSC, 50% formamida, 10% (p/v) sulfato de dextrano, 50 &#956; g/ml de heparina, 100 &#956; g/ml de tRNA de levedura, 100 &#956; g / ml de esperma de salmão sonicado DNA</td></tr><tr><td>Solução de lavagem</td><td></td><td></td> de hibridização <td>2x SSC, 50% de formamida</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>metanol tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>faça 10 mg / ml para solução estoque</td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de dextranoSIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>Para 1 L DW: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>Polissorbato 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>O nome comercial é Tween-20</td></tr><tr><td>Solução de poli-L-lisina (0,1% p/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>prepare uma solução fresca a 0,01% p/v antes de usar</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H2O a 1 L</td></tr><tr><td>Solução de</td><td></td><td></td> branqueamento <td>hipoclorito de sódio a 20%, 0,5 M KOH</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de anticorpo <td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azida de sódio (tóxico)</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de bloqueio <td>Tampão de anticorpo com 5% de albumina de soro bovino (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Para fazer 1 L, 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sódio, H2O a 1 L, ajustar o pH para 7,0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigenina-dUTP misturar</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>Colunas de purificação PCR Cosmo</td><td>genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de vidros / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro com vários poços</td><td>MP biomedicals</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr>Meios <td></td><td></td> de<td>crescimento de nematóides</td><td>Para fazer 1 L, 3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, H2O a 974 ml. Autoclave e resfrie o frasco. Adicionar 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml de 4 mg/ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4, 25 ml de 1 M KPO4.</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de penas de navalha</td><td></td><td>nº 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Microsope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X foi usado como lente objetiva.</td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> úmida <td>Caixa de plástico cheia de papel toalha embebida em</td></tr><tr><td>DW Image Analysis Software</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

observação e quantificação de telomere e sequências repetitivas utilizando fluorescência<em&gt; in situ</em&gt; fluorescente (fish) com pna sondas em<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telômero é uma estrutura ribonucleoproteica que protege as extremidades cromossômicas da fusão e degradação aberrantes. O comprimento dos telômeros é mantido pela telomerase ou por uma via alternativa, conhecida como alongamento alternativo dos telômeros (ALT)1. Recentemente, C. elegans emergiu como um organismo modelo multicelular para o estudo dos telômeros e ALT2. A visualização de sequências repetitivas no genoma é fundamental para entender a biologia dos telômeros. Embora o comprimento dos telômeros possa ser medido por ensaio de fragmento de restrição de telômeros ou PCR quantitativo, esses métodos fornecem apenas o comprimento médio dos telômeros. Pelo contrário, a hibridização in situ fluorescente (FISH) pode fornecer as informações dos telômeros individuais nas células. Aqui, fornecemos protocolos e resultados representativos do método para determinar o comprimento dos telômeros de C. elegans por hibridização in situ fluorescente. Este método fornece um procedimento in situ simples, mas poderoso, que não causa danos perceptíveis à morfologia. Usando ácido nucleico peptídico (PNA) marcado com fluorescência e sonda marcada com digoxigenina-dUTP, fomos capazes de visualizar duas sequências repetitivas diferentes: repetições de telômeros e molde de ALT (TALT) em embriões e gônadas de C. elegans.

Foi relatado anteriormente que o sobrevivente ALT pode emergir de mutante telomerase deficiente, TRT-1 (ok410), em baixa frequência, replicando localizada internamente &#39;Template da ALT&#39; (tAlt) sequências para manutenção dos telômeros 2. Usando sonda PNA, fomos capazes de visualizar os telômeros nas gônadas dissecados (Figura 2A). O sinal dos telômeros fraco foi detectado tanto no TRT-1 (ok410) e sobrevivente ALT. O sinal fuzzy foi sob...

Relatamos um procedimento conciso de hibridização in situ fluorescente (FISH) na gônada e embriões de Caenorhabditis elegans para observação e quantificação de sequências repetitivas. Observamos e quantificamos com sucesso duas sequências repetitivas diferentes, repetições de telômeros e modelo de alongamento alternativo de telômeros (TALT).

Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

O objetivo geral desta técnica de hibridização fluorescente in situ é analisar de forma concisa o número e o comprimento dos telômeros em C. elegans. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre reorigem tumoral, alongamento alternativo dos telômeros e senescência celular. A principal vantagem desta técnica é que os procedimentos são concisos e os telômeros podem ser visualizados e quantificados em menos de 24 horas.Colete os vermes adultos grávidos com um pouco de meio líquido sem debris em um tubo de 15 mililitros. Agora, lave os vermes três vezes da seguinte forma. Adicione tampão M9 para um volume total de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue o tubo a 300 G durante três minutos e descarte a solução acima do pellet de vermes. Repita então o processo. Se, após a centrifugação, os vermes estiverem flutuando, reduza a frenagem da centrífuga.Após a terceira lavagem, deixe os vermes com 5 mililitros de M9. Em seguida, adicione 6,5 mililitros de água destilada, dois mililitros de hipoclorito e um mililitro de hidróxido de potássio cinco molar. Incube os vermes nesta solução de desinfecção por três minutos com agitação a 50 RPM. Em seguida, vortexe os vermes para rompê-los e liberar seus ovos.Sob um microscópio de dissecação, procure os ovos liberados. Se ainda não foram liberados, continue a incubação por até oito minutos. Se os vermes estiverem majoritariamente dissolvidos e os ovos estiverem soltos, complete o tubo até 15 mililitros com M9 e lave os ovos três vezes, da mesma forma que os vermes foram lavados anteriormente.Para os ovos lavados, com a maior parte do M9 removido, complete o volume até 500 microlitros com PBST e, em seguida, adicione 500 microlitros de PFA 4%. Agora, carregue alíquotas de 40 microlitros de ovos em PFA 2% nas cavidades de lâminas revestidas com polilisina. Em seguida, transfira as lâminas para uma câmara umidificada e deixe incubarem por 15 minutos à temperatura ambiente.Para este protocolo, prepare um bloco de alumínio em gelo seco armazenado a 80 graus Celsius. Além disso, prepare metanol e acetona armazenados a 20 graus Celsius. Após a conclusão do passo de fixação, remova a maior parte da solução de PFA dos lâminas, deixando cerca de cinco microlitros.Em seguida, coloque uma segunda lâmina revestida com polilisina sobre cada lâmina de amostra, de modo que as duas superfícies revestidas aderem uma à outra, aprisionando os tecidos no poço. Se houver fixador em excesso, remova-o com um papel absorvente. Agora, congele as lâminas colocando-as sobre uma placa de alumínio fria por pelo menos 15 minutos.Enquanto isso, prepare banhos de metanol e acetona em gelo para as lâminas. Assim que as lâminas estiverem congeladas, gire uma delas para provocar uma fissura por congelamento na amostra. Descarte a lâmina superior e mergulhe a lâmina inferior em metanol gelado por cinco minutos.Repita isso para todas as amostras. A fissuração por congelamento permite a penetração de sondas e anticorpos através da casca dura do ovo. Se os ovos forem fissurados por congelamento com sucesso, será possível visualizá-los em ambos os lâminas.Após pelo menos cinco minutos em metanol, transfira as lâminas para acetona fria por cinco minutos. Após outros cinco minutos, mergulhe as amostras em PBST três vezes, durante cinco minutos por banho. Após as lavagens com PBST, as lâminas podem ser armazenadas em etanol a 100% a quatro graus Celsius por vários dias.Para prosseguir, adicione 20 microlitros de solução de RNase aos poços da amostra e incube-os em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave as lâminas duas vezes em SSCT 2x, com 15 minutos por lavagem. Após as duas lavagens, adicione 20 microlitros de solução de hibridização às amostras e incube-as a 37 graus Celsius por uma hora em uma câmara umidificada.Enquanto isso, prepare a sonda para uma sonda de DNA de dupla fita. Desnature-a a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie-a rapidamente em gelo. Após uma hora, aspire a solução de hibridização e adicione a solução da sonda.A partir deste passo, proteja a amostra da luz. Após adicionar a sonda, cubra as amostras com lamínulas de vidro. Em seguida, prepare uma câmara umidificada sobre um bloco de aquecimento a 80 graus Celsius.Quando o bloco térmico estabilizar novamente em 80 graus Celsius, coloque as lâminas com as amostras na câmara aquecida e deixe-as desnaturar por três minutos. Em seguida, incube todas as lâminas processadas em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação prolongada, lave as amostras em PBST à temperatura ambiente por cinco minutos.Como preparação, aqueça a solução de hibridização a 37 graus Celsius uma hora antes da lavagem. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco com solução de lavagem de hibridização e incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para remover a solução de hibridização, lave as amostras com PBST à temperatura ambiente por 15 minutos.Repita este procedimento três vezes. Após aspirar o último lavado com PBST, adicione 20 microlitros de solução bloqueadora a cada amostra e incube-as em câmaras umidificadas à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Em seguida, aspire a solução bloqueadora e substitua-a pela solução de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com FITC na diluição de um para 200.Cubra as lâminas e incube-as em temperatura ambiente por três horas no escuro. Após a coloração com anticorpo, lave as amostras duas vezes com PBST durante 15 minutos por lavagem, no escuro. Em seguida, aspire o PBST e substitua por 10 microlitros de solução de montagem contendo DAPI.Coloque um lamínula e absorva qualquer solução em excesso. Por fim, selar as bordas da lamínula com esmalte e proceder com a observação das amostras em um microscópio fluorescente. Utilizando a sonda PNA, foram observados os telômeros de animais que sobreviveram a uma mutação suficiente em telômeros.No interior das gônadas, o número de telômeros por núcleo é quantificável. O sinal de telômero co-localizou-se com um sinal de TALT1, o que reforça a ideia de que o TALT1 é responsável pela sobrevivência na ausência de telômeros. A intensidade do sinal de telômero foi comparada utilizando software.O sinal foi mais forte nos sobreviventes ALT do que nas linhagens parentais utilizadas para gerar os mutantes deficientes em telômeros. Não se esqueça de que o trabalho com paraformaldeído e formamida pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Biology

Biologia

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Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência In Situ Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal

Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência

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