Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência In Situ Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em Caenorhabditis elegans

O objetivo geral desta técnica de hibridização in situ de fluorescência é analisar de forma concisa o número e o comprimento dos telômeros em C. Elegans. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre regênese tumoral, alongamento alternativo dos telômeros e senescência celular. A principal vantagem dessa técnica é que os procedimentos são concisos e os telômeros podem ser visualizados e quantificados em menos de 24 horas.

Colete os vermes adultos grávidas com um pouco de meio líquido sem detritos em um tubo de 15 mililitros. Agora lave as minhocas três vezes da seguinte maneira. Adicione o tampão M9 para um volume total de 15 mililitros.

Em seguida, gire o tubo a 300 G por três minutos e descarte a solução acima do pellet de vermes. Em seguida, repita o processo. Se após a centrifugação os vermes estiverem flutuando, alivie o freio da centrífuga.

Após a terceira lavagem, deixe as minhocas com 5 mililitros de M9. Em seguida, adicione 6,5 mililitros de água destilada, dois mililitros de hiperclorito e um mililitro de hidróxido de potássio de cinco molares. Deixe os vermes incubarem nesta solução de branqueamento por três minutos com 50 RPM de agitação. Em seguida, vórtice os vermes para cortá-los e liberar seus ovos.

Sob um microscópio de dissecação, procure os ovos liberados. Se ainda não foram liberados, continue a incubação ou até oito minutos. Se os vermes estiverem quase todos dissolvidos e os ovos estiverem livres, encha o tubo até 15 mililitros com M9 e lave os ovos três vezes, assim como os vermes foram lavados antes.

Aos ovos lavados, com a maior parte do M9 removido, encha o volume para 500 microlitros com PBST e, em seguida, adicione 500 microlitros de 4% de PFA. Agora carregue alíquotas de 40 microlitros de ovos em 2% PFA nos poços de lâminas revestidas de polilisina. Em seguida, transfira as lâminas para uma câmara umidificada e deixe-as incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.

Para este protocolo, tenha um bloco de alumínio em gelo seco armazenado a 80 graus Celsius. Além disso, tenha metanol e acetona armazenados a 20 graus Celsius. Após a conclusão da etapa de fixação, remova a maior parte da solução de PFA das lâminas, deixando cerca de cinco microlitros.

Em seguida, coloque as segundas lâminas revestidas de polilisina sobre cada lâmina de amostra para que as duas superfícies revestidas fiquem juntas, prendendo os tecidos no poço. Se houver fixador excessivo, limpe-o com um lenço de papel. Agora congele as lâminas colocando-as no bloco de alumínio frio por pelo menos 15 minutos.

Enquanto isso, prepare banhos de metanol e acetona no gelo para as lâminas. Depois que as lâminas estiverem congeladas, gire uma para congelar a amostra. Descarte a lâmina superior e mergulhe a lâmina inferior em metanol gelado por cinco minutos.

Faça isso para todas as amostras. A fissuração por congelamento permite a penetração de sondas e anticorpos através da casca dura do ovo. Se os ovos congelarem com sucesso, você poderá ver os ovos em ambas as lâminas.

Após pelo menos cinco minutos em metanol, mova as lâminas para acetona fria por cinco minutos. Em mais cinco minutos, mergulhe as amostras em PBST três vezes por cinco minutos por banho. Após as lavagens do PBST, as lâminas podem ser armazenadas em etanol 100% a quatro graus Celsius por vários dias.

Para prosseguir, adicione 20 microlitros de solução de RNase aos poços de amostra e incube-os em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave as lâminas em 2x SSCT duas vezes por 15 minutos por lavagem. Após as duas lavagens, adicione 20 microlitros de solução de hibridização às amostras e incube-as a 37 graus Celsius por uma hora em uma câmara umidificada.

Enquanto isso, prepare a sonda para uma sonda de DNA de fita dupla. Desnature-o a 95 graus Celsius por cinco minutos e depois resfrie-o no gelo brevemente. Após uma hora, aspire a solução de hibridização e adicione a solução de sonda.

A partir deste passo à frente, proteja a amostra da luz. Depois de adicionar a sonda, cubra as amostras com lamínulas de vidro. Em seguida, faça uma câmara umidificada em um bloco de calor de 80 graus Celsius.

Quando o bloco de calor se estabilizar de volta a 80 graus Celsius, coloque as lâminas de amostra na câmara aquecida e deixe desnaturar por três minutos. Em seguida, incube todas as lâminas processadas em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação durante a noite, lave as amostras em PBST à temperatura ambiente por cinco minutos.

Na preparação, aqueça a solução de hibridização a 37 graus Celsius uma hora antes da lavagem. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de solução de lavagem de hibridização e incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para remover a solução de hibridização, lave as amostras com PBST em temperatura ambiente por 15 minutos.

Faça isso três vezes. Depois de aspirar a última lavagem de PBST, adicione 20 microlitros de solução de bloqueio a cada amostra e incube-os em câmaras umidificadas em temperatura ambiente por uma hora no escuro. Em seguida, aspire a solução de bloqueio e substitua-a por uma solução conjugada de anticorpo antidigoxigenina FITC a um a 200.

Cubra as lâminas e incube-as em temperatura ambiente por três horas no escuro. Após a coloração do anticorpo, lave as amostras duas vezes com PBST por 15 minutos por lavagem no escuro. Em seguida, aspire o PBST e substitua-o por 10 microlitros de solução de montagem contendo DAPI.

Aplique uma lamínula e absorva o excesso de solução. Por fim, sele as bordas da lamínula com esmalte e prossiga com a observação das amostras em um microscópio fluorescente. Usando a sonda PNA, os telômeros de animais que sobreviveram a uma mutação suficiente em telômeros foram observados.

Nas gônadas, o número de telômeros por núcleo é quantificável. O sinal dos telômeros co-localizado com um sinal TALT1, apoiando a noção de que TALT1 é responsável pela sobrevivência sem telômeros. A intensidade do sinal dos telômeros foi comparada usando software.

O sinal foi mais forte nos sobreviventes da ALT do que nas cepas parentais usadas para gerar os mutantes deficientes em telômeros. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e formamida pode ser extremamente perigoso, e cuidados, como o uso de luvas, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.