Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a estrutura da saliência G dos telômeros. Em células de brucey de armadilha. Nativo em hibridização em gel usa uma sonda oligo específica de sequência para hibridizar com a região de fita simples do telômero sob a condição nativa.

Esta região de fita simples é a região de saliência do telômero G e, portanto, a quantidade de sonda oligo hibridizada representa seu adaptador de comprimento. A ligação permite que a sequência final da saliência G do telômero seja determinada quando o oligo único é marcado. Este método envolve a ligação de um adaptador específico de sequência para a extremidade da estrutura de saliência do telômero G para o ensaio de extensão primária mediado por ligação.

O oligo guia é marcado como extremidade e anal ao oligo único antes de ser ligado às extremidades dos cromossomos. Após a ligadura, a extensão primária é realizada usando T quatro DNA polimerase. O comprimento da saliência G pode então ser determinado, pois o produto é n menos seis nucleotídeos mais longo do que a saliência G real, onde N representa o comprimento do oligo guia no adaptador.

Olá, sou bi Bo, professor assistente do Departamento de Ciências Biológicas, Geológicas e Ambientais da Universidade Estadual de Cleveland. Ei, eu sou Gio. Sou estudante de pós-graduação no laboratório do Dr. Lee e hoje vamos mostrar um procedimento para analisar a estrutura do geo hank.

Usamos este procedimento para estudar a estrutura e as funções dos telômeros em Trapasso enquanto trabalhamos com radioatividade. Como neste experimento, é necessário tomar as devidas precauções de segurança. O departamento institucional de saúde e segurança ambiental deve ser consultado antes de tentar fazê-lo.

Neste vídeo, alguns desses precursores estão ausentes apenas para fins de demonstração. Então vamos começar. O princípio desta parte do procedimento é que, sob condições nativas, uma sonda tell C não rotulada compreendia quatro repetições de C-C-C-T-A.

Um oligo só pode hibridizar com a região saliente G do telômero de fita simples. A intensidade da hibridização é, portanto, proporcional ao comprimento da saliência. Após a desnaturação e neutralização, a mesma sonda será capaz de hibridizar com toda a região dos telômeros.

A intensidade dessa hibridização representa a quantidade total de DNA dos telômeros e é usada como controle de carga. O nível final de saliência G pode então ser calculado dividindo o sinal de hibridização nativo por aquele obtido após a desnaturação. Este procedimento começa com uma separação de cromossomos intactos por eletroforese em gel de campo passado ou PFGE, que requer que o DNA genômico seja preparado em plugues agros para evitar o cisalhamento mecânico do DNA para realizar este primeiro ponto de fusão baixo de dissolução, ou LMP agros em tampão L para 1,6% Mantendo-o aquecido a 50 graus Celsius e, em seguida, colha 200 milhões de células T brucey por centrifugação.

Remover o supinato e ressuspender o sedimento celular com tampão L até uma concentração final de 5 milhões de células por mililitro. Incubar a suspensão celular entre 42 e 50 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione um volume de 1,6% LMP a um volume de células e misture rapidamente alíquotas de 85 microlitros da suspensão de células para cada poço de um molde de plugue descartável.

Assim que os plugues estiverem solidificados, transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de tampão L e célula 1%sarco. Adicione uma pitada de proteinase K em pó. Misture bem e incube a 50 graus Celsius por 48 horas.

Após a incubação, descarte o tampão e lave os plugues com cinco mililitros de tampão L duas vezes. Em seguida, repita a digestão da proteinase K em L tampão AVC SAR caol por mais 48 horas. Lave os plugues com tampão L novo novamente e armazene-os a quatro graus Celsius no tampão L.

Esses plugues devem ser usados dentro de duas semanas. Prepare o gel agros com os tampões de DNA conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, execute o gel em uma unidade chef DR dois.

Após PFGE, o gel é corado des mancha fotografado e seco. Quando o gel estiver seco, coloque-o em um saco de hibridização e adicione 20 mililitros de tampão de pré-hibridização. Remova o máximo de ar possível do saco e feche o saco.

Incube a bolsa de hibridização em banho-maria a 50 graus Celsius com um balanço suave por pelo menos uma hora enquanto pré-hibridiza o rótulo do gel. As sondas oligo incubam a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 90 microlitros de tampão TNES à mistura de reação.

Para purificar a sonda rotulada, carregue a sonda em cima de uma coluna G 25 pré-fabricada. Lave-o com 700 microlitros de tampão TNAS e elua a sonda em 600 microlitros. Após a pré-hibridização em gel, ferva a sonda marcada por cinco minutos e adicione-a a 25 mililitros de tampão de pré-hibridização fresco.

Para fazer o buffer de hibridização, remova o buffer de pré-hibridização do filtro de mangas. Esterilize a mistura de hibridização com um filtro de seringa de 0,22 micrômetro e adicione-a diretamente na bolsa de hibridização. Feche o saco e coloque-o em um recipiente raso com água morna.

Coloque todo o recipiente no banho-maria a 50 graus Celsius e incube-o durante a noite com um balanço suave. No dia seguinte, corte uma pequena abertura no saco de hibridização em um tubo cônico de 50 mililitros. Despeje o máximo possível da mistura de hibridização.

Mantenha a sonda congelada a menos 20 graus Celsius. Remova o gel da bolsa de hibridização e coloque-o em um recipiente, lave e seque o gel conforme descrito no protocolo escrito. Depois de seco, embrulhe o gel com filme plástico e exponha-o a um gerador de imagens de fosfato por aproximadamente três dias.

Após três dias, escaneie o gerador de imagens de fosfato para realizar a hibridização após a desnaturação. Comece incubando o gel em tampão desnaturante à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave o gel e o tampão de neutralização por 30 minutos.

Em seguida, enxágue o gel em água destilada por três minutos. Pré-hibridizar o gel a 55 graus Celsius por uma hora. Repita a hibridização usando a mesma sonda contendo a mistura de hibridização de antes, mas a 55 graus Celsius durante a noite após a hibridização.

Lave e seque o gel como antes. Em seguida, enrole o gel e exponha-o a um gerador de imagens de fosfato por aproximadamente duas horas. Digitalize o gerador de imagens de fosfo: Finalmente, normalize o sinal de hibridização obtido antes da desnaturação com o obtido após a desnaturação.

Nesta parte do procedimento, o T o mero nucleotídeo terminal é determinado por ligação do adaptador. O oligo único é marcado com anil final para os oligos guia e ligado à extremidade do telômero. Somente quando o adaptador guia exclusivo tiver uma saliência de três primos compatível com a sequência de telômeros do terminal, o adaptador será ligado.

Para T brucey. Os telômeros podem terminar em um dos seis nucleotídeos diferentes do TT, um GGG se repete. Portanto, seis oligos guia diferentes são usados para iniciar esse processo.

Trate o oligo único com quinase misturando seis microlitros de 10 mol por microlitro de oligo único com três microlitros de 10 vezes o tampão PNK, cinco microlitros de gama P 32 A TP 14 microlitros de água bidestilada e dois microlitros de T quatro PNK. Incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, use o kit de remoção rápida de nucleotídeos do caiaque para remover o TP A quente não incorporado e elutar.

A extremidade rotulou oligo com 60 microlitros de tampão de eluição. Para obter uma concentração final de cerca de um P mol por microlitro para criar o adaptador, ajoelhe-se o oligo exclusivo ao oligo guia. Adicione 10 microlitros de oligo exclusivo purificado a dois microlitros de cada oligo guia e um microlitro de um tampão ajoelhado.

Coloque os tubos em um bloco de calor de 85 graus Celsius e desligue o bloco de calor. Deixe os tubos e o bloco de calor esfriarem até a temperatura RI por algumas horas. Em seguida, ligue os adaptadores ao DNA genômico total.

Incube a mistura a 16 graus Celsius em uma máquina de PCR durante a noite. Após uma incubação noturna, execute uma digestão de endonuclease de restrição conforme descrito no protocolo escrito. Adicione três microlitros de 10 vezes o corante laranja G a cada amostra.

Carregue as amostras de DNA em um gel 0,7% agros de 20 por 20 centímetros. Execute o gel a 30 volts por 30 minutos. Em seguida, continue com uma tensão mais alta, mantendo a tensão inferior a 120 volts para um total de 1000 volts em uma hora.

Depois que o gel escorrer, escaneie o gel de coloração de brometo de AUM com o scanner de tufão. Por fim, seque o gel agros e exponha o gel seco ao gerador de imagens de fosfato durante a noite. Na extensão do primer mediada por ligação, o oligo guia é marcado com a extremidade e anil para o oligo único antes de ser ligado apenas às extremidades do cromossomo.

O adaptador de guia exclusivo com uma saliência de três primos compatível com a saliência G será ligado. Após a remoção dos pares de oligo não ligados, a extensão primária pode ser realizada com T quatro DNA polimerase, que não possui deslocamento da fita e atividade de endonuclease de cinco primos a três primos. O comprimento final do oligo guia estendido reflete, portanto, o comprimento da saliência G.

Para iniciar a quinase de extensão do primer mediada por ligação, trate o oligo único e o oligo guia incube ambas as misturas a 37 graus Celsius por 60 minutos. Aneel o oligo guia e o oligo único combinando 10 microlitros do oligo fosforilado, único e 10 microlitros do oligo guia marcado na extremidade em um tubo einor de 1,5 mililitro, Anil os oligos e ligue o guia Anil. Oligoadaptador exclusivo para as extremidades dos telômeros, conforme descrito anteriormente, precipita o DNA e realiza a extensão primária conforme descrito no protocolo escrito.

Prepare um gel TPE de 10% de acrilamida, uréia de sete molares uma vez para executar os produtos de extensão. Carregue quatro microlitros de cada amostra pré-fervida com corante adicionado no gel. Execute o gel a 800 volts em uma TBE de uma vez até que o corante azul atinja o fundo do gel.

Em seguida, retire o gel da placa de vidro. Defina o secador de gel para manter a 65 graus Celsius por 30 minutos e seque o gel continue secando por mais 30 minutos depois que o secador de gel voltar à temperatura ambiente, finalmente exposto ao gerador de imagens de fosfato por duas horas. Cromossomos tbrc intactos separados por PFGE são mostrados.

As células T brucey normalmente contêm aproximadamente 100 cópias de mini cromossomos, todos com tamanho semelhante que migram para a mesma posição no gel. Devido a este fato, após a hibridização com a sonda TC oligo, o sinal de saliência do telômero G é mais proeminente nos minicromossomos. Após a desnaturação e neutralização, a hibridização com a sonda de oligo TLC revela sinais de telômeros em todas as extremidades dos cromossomos.

A hibridização com a sonda oligo TLG normalmente não produz nenhum sinal de hibridização porque as células T brucey não possuem estruturas salientes do telômero C. Após a desnaturação e neutralização, a hibridização com a sonda Tel G oligo também revela sinais de telômeros em todas as extremidades dos cromossomos. Carregar quantidades iguais de DNA em cada pista é essencial para determinar o nucleotídeo terminal do telômero pelo ensaio de ligação do adaptador e isso é mostrado pela coloração de brometo de dium do gel neste protocolo, os adaptadores de oligo e oligo guia rotulados com extremidade são ligados apenas às extremidades do cromossomo com a sequência de saliência do telômero g é compatível com um oligo guia.

Como o oligo exclusivo é rotulado como extremidade, o produto de ligação será radioativo e fornecerá um sinal forte. A pista um dá um sinal forte indicando que uma grande quantidade de adaptador TG um exclusivo foi ligado à extremidade do telômero. TG um tem uma sequência final de C-C-C-T-A, portanto, o telômero g se projeta ligado a este adaptador e é TT A GGG.

Nenhuma quantidade significativa de produto de ligação é observada usando outros oligos guia, indicando que os telômeros terminados em TT A GGG são predominantes nas células T brucey. Carregar o oligo guia rotulado na extremidade serve como um controle negativo e um marcador de tamanho sem ligação. O oligo guia marcado na extremidade tem 22 nucleotídeos de comprimento.

A banda em cerca de 44 nucleotídeos é provavelmente o adaptador resíduo não desnaturado após a ligação à extremidade do cromossomo. O tamanho do produto estendido reflete o comprimento da estrutura saliente G. A maioria das saliências do telômero G de T brucey termina em TT A GGG.

No entanto, essas saliências G parecem ser muito curtas, com cerca de 10 nucleotídeos. Como os produtos estendidos do oligo guia TG ligado um não são muito mais longos do que o próprio oligo guia, embora apenas uma pequena quantidade do adaptador TG quatro tenha sido ligado às extremidades dos telômeros, os produtos estendidos do TG quatro ligado são muito mais longos, com o produto mais longo sendo cerca de 55 nucleotídeos. Portanto, dois tipos de estruturas de saliência dos telômeros G foram observados nas células tbrc.

Se a ligação realmente resultar da estrutura saliente do telômero G, tratar o DNA genômico com XO one ou XOT, que são três nucleases específicas primárias, deve resultar na perda dos produtos de ligação. Ambos os tipos de estruturas salientes G são sensíveis a esse tratamento. Acabamos de mostrar como analisar a estrutura do telômero giang em trapasso bru.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de carregar a mesma quantidade de amostras em cada pista. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.