Name: Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda a usar pinças magnéticas de molécula única para analisar interações entre proteínas TRF1/TRF2 e DNA telomérico humano. Este protocolo detalha expressão, purificação e ensaios mecânicos para estudar distorções no DNA.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estudando as interações TRF1/2 com DNA telomérico usando ensaio de molécula única

<table><tbody><tr><td>Anti-Digoxigenina</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>câmera CMOS&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Solução de extração de DNA</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&nbsp; contas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Contas de estreptavidina</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne</td><td>Contas Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Contas de estreptavidina</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Tianjin No.6 Fábrica de Reagentes Químicos</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Beijing Hwrkchemical Co. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin No.6 Fábrica de Reagentes Químicos</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3&prime;-5&prime; exo-)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Software de programação gráfica&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoDrop Thermo Fisher</td><td>Espectrofotômetro</td>Científico <td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Beads 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>ABclonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td> <td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>SERVA Electroforese GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo protease</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td> <td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando interações proteína-dna telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

A Figura 1A ilustra os domínios e estruturas esquemáticos de TRF1 e TRF2, consistindo de 439 e 542 aminoácidos, respectivamente, que podem ser expressos em células procarióticas. A preparação do TRF1 foi descrita anteriormente na literatura41. Aqui, fornecemos uma descrição abrangente e resultados representativos da preparação do TRF2. A Figura 1B mostra o mapa de plasmídeo usado para expressar TRF2 em E. coli. Avaliamos a expressão de TRF2 antes e após a indução em E. coli, conforme ilustrado na Figura 1B. Os processos de purificação e clivagem de tags também foram analisados usando SDS-PAGE (Figura 1C). Seguindo este protocolo, ambas as proteínas de ligação telomérica, TRF1 e TRF2, foram expressas com sucesso em E. coli.
O DNA telomérico, na forma de fragmentos de restrição terminal (TRFs), é gerado a partir de genomas humanos usando uma combinação de quatro enzimas de restrição. Seguindo o fluxograma mostrado na Figura 2A, extraímos genomas de células humanas. As enzimas digerem seletivamente o DNA genômico, deixando o DNA telomérico de comprimento total intacto, fornecendo material para ensaios de molécula única. Testamos extensivamente a preparação de DNA TRF usando várias linhagens de células humanas. A integridade do DNA genômico foi examinada usando eletroforese em gel de agarose, conforme mostrado na Figura 2B. Os TRFs foram posteriormente analisados por Southern blotting, empregando-se oligonucleotídeos marcados com fluorescência complementares à sequência de repetições teloméricas TTAGGG (Figura 2C), seguindo um método descrito em outro momento41,56. Em média, o comprimento dos TRFs humanos é de cerca de alguns quilobases.
Os ensaios de molécula única são realizados em uma célula de fluxo montada conforme descrito na Figura 3A. Um revestimento de nitrocelulose cobre a superfície do vidro carregada negativamente, fornecendo uma matriz hidrofílica para adsorção de anticorpos. A passivação de BSA bloqueia áreas da matriz de nitrocelulose não ligadas por anticorpos anti-digoxigenina. Os grânulos de poliestireno, que não contêm nanopartículas de ferro, servem como grânulos de referência. As amarras TRF são formadas por meio de interações de afinidade entre o anticorpo digoxigenina na matriz de nitrocelulose e a biotina-estreptavidina na superfície do grânulo magnético ( Figura 3B ). TRF1 ou TRF2 são introduzidos na célula de fluxo, ligando-se às amarras do DNA TRF por difusão livre. Pinças magnéticas são usadas para modular o campo magnético, gerando forças nas esferas magnéticas para esticar e relaxar as amarras TRF, permitindo assim a sondagem das interações proteína-DNA.
Um ensaio mecânico de molécula única é projetado desenvolvendo um script para controlar os movimentos dos motores das pinças magnéticas. Um fluxograma fornece uma abordagem estruturada para criar este script no MatLab para um ensaio de molécula única usando pinças magnéticas (Figura 4A). Os ímãs se movem ao longo do eixo z dentro de uma faixa de 0-25 mm. As forças são calculadas com base nas posições dos ímãs, de acordo com a configuração do ímã, usando equações descritas na literatura54. Para uma taxa de carga de força específica, as posições do ímã e as velocidades de movimento são projetadas e programadas no MatLab para atingir o perfil de manipulação de força desejado, conforme demonstrado no exemplo de ensaio de rampa de força (Figura 4B-D).
Usando TRF1 como exemplo, investigamos as interações DNA-proteína telomérica com pinças magnéticas de molécula única. A configuração experimental pode ser configurada como um ensaio de rampa de força, conforme mostrado na Figura 5A, onde as curvas de força-extensão exibem características em zigue-zague durante o alongamento devido à quebra das interações proteína-DNA e traços suaves durante o relaxamento, refletindo a fibra de DNA sem alças mediadas por proteínas. A configuração também pode ser configurada como um ensaio de salto de força, conforme mostrado na Figura 5B, C, permitindo-nos medir as mudanças na extensão e as durações das interações proteína-DNA sob forças específicas. A cinética de dissociação dos complexos DNA-proteína teloméricos pode ser derivada dessas medições (Figura 5D). Além disso, a formação de alças nos complexos DNA-proteína pode ser revelada por mudanças na extensão ( Figura 5E ). Além disso, a concentração de proteína pode ser titulada dentro dessa configuração experimental de DNA telomérico. Além disso, a heterogeneidade de comprimento do DNA telomérico de células humanas nos permite investigar o mecanismo de formação de alças em telômeros de vários comprimentos (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> Figura 1: A expressão e purificação de TRF1/2. (A) A arquitetura de domínio de TRF1 e TRF2. (B) O mapa de plasmídeo de pET28a-SUMO-TRF2 para expressar TRF2 em E. coli. (C) Análise SDS-PAGE das amostras obtidas em vários estágios de expressão e purificação. Pista 1: Não induzida pelo IPTG. Pista 2: precipitado induzido por IPTG obtido por lise celular. Pista 3: sobrenadante induzido por IPTG obtido após lise celular. Pista 4: Fluxo através da coluna Ni. Pista 5: Lave com tampão de baixo imidazol para remover as proteínas de impurezas. Pista 6: Eluição de 6xHis-SUMO-TRF2 com tampão contendo 300 mM de imidazol. Pista 7: Digestão de etiquetas SUMO pela enzima protease SUMO. Pista 8: Repurificação com coluna de Ni e eluição de TRF2 (6xHis e SUMO tags removidos) com tampão contendo 20 mM de imidazol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> Figura 2: Preparação de fragmentos de restrição terminal (TRF). (A) Fluxograma para a preparação de TRFs de células humanas. (B) Exame da integridade do DNA genômico usando um gel de agarose a 1% para 5 linhagens de células humanas. (C) Análise TRF realizada por Southern blotting para 5 linhagens de células humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> Figura 3: Preparação de ensaios mecânicos de molécula única. (A) Fluxograma que descreve a preparação de uma célula de fluxo para ensaios mecânicos de molécula única. (B) Representação esquemática de ensaios mecânicos de molécula única usando pinças magnéticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> Figura 4: Projeto de um ensaio mecânico de molécula única. (A) Fluxograma para gerar um script para executar um ensaio de rampa de força. (B) O perfil de movimento dos ímãs ao longo do eixo z. (C) O perfil de força correspondente ao movimento do ímã. (D) A correlação entre as posições dos ímãs e as forças resultantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> Figura 5: Interações DNA-proteína telomérica sondadas por pinças magnéticas de molécula única. (A) As interações TRF1-telômero foram sondadas em ensaios de rampa de força (N = 10) em um tampão contendo 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA e 100 mM NaCl a 23 ° C. A concentração de TRF1 foi de 10 nM, com uma taxa de carga de força de ±1 pN/s. (B) A corda TRF foi esticada e relaxada em ensaios de salto de força. O protocolo de força aplicada foi Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN e Fmax = 20 pN. As condições de tampão e temperatura foram as mesmas de (A). Taxa de quadros = 200 Hz. (C) As interações TRF1-telômeros foram sondadas em ensaios de salto de força com uma concentração de TRF1 de 10 nM. (D) Cinética de dissociação de complexos TRF1-telômeros. O logaritmo da taxa de dissociação nas forças testadas (Média ± DP, n = 206) segue o modelo de Kramer-Bell-Evans (curva vermelha e equação da legenda). A inserção mostra o tempo médio de dissociação (&lt;τ&gt;) em Ftest. (E) Distribuição das mudanças na extensão (ΔL) após eventos de ruptura dos complexos TRF1-telômeros. As curvas pretas e vermelhas representam acessórios gaussianos. Essa figura foi modificada com permissão de Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> Figura 6: O número e os tamanhos das alças de DNA formadas por TRF1 em um telômero. (A) Dependência do comprimento dos telômeros dos tamanhos das alças de DNA (ΔL) em [TRF1] = 20 nM. As curvas representam acessórios gaussianos. (B) Dependência do comprimento dos telômeros de ΔL em [TRF1] = 40 nM. (C) Correlação entre ΔL e o número de eventos de ruptura por telômero, N. A correlação de ordem zero é r = -0,20, com p &lt; 0,001 (tamanho da amostra = 1496). (D) Um desenho animado ilustrando um possível mecanismo que explica a correlação negativa entre ΔL e N, sugerindo que TRF1 pode compactar um único telômero com domínios de loop primário em uma topologia de alta ordem. Essa figura foi modificada com permissão de Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Código MatLab para geração de scripts.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Script para assay.txt de força constante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Script para rampa de força assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Receitas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

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JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Aprenda a usar pinças magnéticas de molécula única para analisar interações entre proteínas TRF1/TRF2 e DNA telomérico humano. Este protocolo detalha expressão, purificação e ensaios mecânicos para estudar distorções no DNA.

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

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