Name: Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprenda a fabricar biosensores microfluídicos eletroquímicos usando tecnologia de película seca fotossensível para diagnósticos rápidos de doenças e quantificação de fármacos. Este método versátil utiliza leitura eletroquímica com técnica de fluxo interrompido.

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Os autores gostaria de agradecer o alemão Research Foundation (DFG) para financiamento parcialmente este trabalho sob Grant números UR 70/10-01 e UR 70/12-01.

1. fabricação da tecnologia de DFR Microfluidic Biosensor usando <ol><li>bolachas de preparação da PI.
	Substrato de corte um PI <ol><li>em 6 - em rodada bolachas. Colocar a bolacha de PI em um forno a 120 ° C por cerca de 1h para assar uma desidratação.</li>
	</ol></li> <li>Primeiro passo de fotolitos para o processo de decolagem.
	<ol><li>Programar a rotação-aplicador para um tempo de 30-s giro a 3.000 rpm, com uma aceleração de 2.000 rpm/s. lugar a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 2 mL de uma resist, permitindo que o processo de decolagem e iniciar o programa de centrifugação-aplicador. Retire a bolacha o spin-revestidor e macio-asse a bolacha de PI sobre uma chapa quente durante 2 minutos a 100 ° C.</li>
		<li>Ajustar a máscara desejada para padronização dos eléctrodos sobre a bolacha de PI a olho nu e expô-lo à luz de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Lugar a hóstia em uma tigela cheia de um desenvolvedor de correspondência de resistir em um agitador orbital e deixá-lo agite ligeiramente durante 1 min.</li>
		<li>Após a resistir em excesso é removido, usar um chuveiro para enxaguar o wafer de PI com água deionizada (DI-água) num banco molhado e seque-o depois com ar comprimido.</li>
	</ol></li> <li>Deposição de platina para a formação dos eléctrodos.
	<ol><li>Use um processo de deposição de vapor físico padrão para depósito de 200 nm de platina para a bolacha 19.</li>
		<li>Coloque a bolacha em uma tigela. Adicionar o removedor correspondente para a tigela e retire o resistir de decolagem agitando ligeiramente a bolacha em um agitador orbital até todos platina em excesso é removida. Lave e seque a bolacha de PI, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Segunda etapa de fotolitografia: formando a camada de isolamento.
	<ol><li>Colocar a bolacha de PI em um forno pré-aquecido a 120 ° C por 5 min desidratar lo</li>
		<li>Programa a primeira etapa de um giro-aplicador para 5 s de girando tempo a 500 rpm. Programa da segunda etapa por 30 s a 4.000 rpm, com uma aceleração de 700 rpm/s.</li>
		<li>Coloque a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 4 mL de um apropriado com base em epóxi fotorresiste antes de iniciar o programa de centrifugação-revestidor.</li>
		<li>Soft-asse a bolacha revestida por 3 min a 95 ° C, em uma chapa quente.</li>
		<li>Ajustar a máscara para a camada de isolamento sobre a bolacha usando as marcas de alinhamento respectivo e uma lente ocular. Expor o wafer de luz de 2 UV 100 mJ/cm (365 nm).</li>
		<li>Para um Asse pós-exposição, coloque a bolacha em um prato quente pré-aquecido por 2 min em 95 ° C.</li>
		<li>Coloque a bolacha numa tigela e desenvolver a resistir com um desenvolvedor apropriado (por exemplo, 1-metoxi-2-propil-acetat por 2 min, no caso do SU-8) em um agitador orbital.</li>
		<li>Enxaguar a bolacha PI primeiro com isopropanol e depois enxaguar e secá-lo, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Hard-Asse o fotorresiste em um forno para 3h a 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Assistido por plasma limpeza dos eletrodos.
	<ol><li>Para remover os resíduos de fotorresiste, use o plasma de oxigênio com uma unidade de plasma padrão. Iniciar o programa de limpeza, usando energia de baixa frequência de 200 W com fluxo 100% O 2, uma taxa de 250 sccm e um tempo total de 3 min.</li>
		<li>Coloque a bolacha de PI para a câmara de plasma, corrigir a bolacha na placa aterrada usando tampas de vidro e iniciar o processo de plasma.</li>
	</ol></li> <li>Prata e deposição de cloreto de prata: criando o eléctrodo de referência em-microplaqueta.
	Almofadas de <ol><li>Passivate o contato de platina de wafer com fita adesiva sensíveis ao UV. Corte a folha 5 mm de largura e 11 cm de comprimento de listras e anexá-los para o wafer, protegendo as partes a não ser depositado com prata.</li>
		<li>Para a deposição de prata, colocou um banho sônico (35 kHz) uma hotte e introduza um recipiente de solução eletrolítica de prata (Ag, pH 12,5 100 g/L) para o banho. Definir o sonic banho à temperatura ambiente e o poder de 10%. 
		Atenção: Soluções de eletrólitos prata são altamente tóxicas e devem ser manuseadas com extremo cuidado. A fumaça nunca deve ser inalada.</li>
		<li>Ligar o contato em massa dos eléctrodos de referência a uma fonte de corrente constante. Conecte o eletrodo contador, um fio de prata que está imersa na solução de Prata eletrolítica, a fonte de corrente usando cabos de conexão padrão.</li>
		<li>Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de-4.5 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de prata de aproximadamente 0,3 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar durante 10 min. Enxágue a bolacha com DI-água</li>
		<li>Para a cloração do eletrodo de referência, introduza um recipiente de solução 0,1 M de cloreto de potássio (KCl) banho de sonic. Ligar o contacto em massa de wafer e um eletrodo de platina que está imersa na solução de KCl com fonte de corrente constante.</li>
		<li>Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de +0.6 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de aproximadamente 0,075 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar 7,5 min.</li>
		<li>Enxagúe e seque o PI da bolacha, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Remova a fita de UV-sensíveis após um UV (365 nm) exposição de 300 mJ/cm 2 e enxagúe e seque a bolacha de PI, novamente como descrito no passo 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Terceira etapa de fotolitografia: DFRs usando para criar os canais microfluídicos.
	<ol><li>Corta as camadas DFR necessárias para um tamanho semelhante do wafer (20 x 20 cm 2). Corrigir a máscara desejada para a unidade de exposição e alinhar a camada DFR para a máscara usando a olho nu. Iluminar a resistir com 250 luz de mJ/cm 2 UV (365 nm).</li>
		<li>Remover a película protectora do fotorresiste e desenvolver a resistir por mais ou menos 2 min (dependendo das estruturas) em uma solução de carbonato de sódio (Na 2 CO 3) 1% usando um padrão banho sônico (35 kHz) pré-aquecido a 42 ° C e um poder sônico de 100%. Para parar a reação imediatamente, agite a resistir por 1 min em um banho de HCl 1% em um agitador orbital. Enxaguar e secar cada camada DFR, conforme descrito na etapa 1.2.3. 
		Nota: No total, quatro camadas DFR precisam ser processadas como mencionado na etapa 1.7: um canal camada, camada de cobertura de uma e duas camadas de traseiro (impedindo o biosensor de dobra no final).</li>
	</ol></li> <li>Camadas de laminação da DFR no substrato PI.
	<ol><li>Coloque a bolacha de PI em uma folha de aéreos de transparência e fixe-a com fita adesiva padrão. Ajustar a camada DFR canal sobre a bolacha PI sob um microscópio, usando as estruturas do respectivo alinhamento.</li>
		<li>Para a laminação, use um padrão quente rolo laminador e pré-aqueça o rolo superior a 100 ° C e o rolo inferior a 60 ° C. ajustar a pressão de 3 bar, com uma velocidade de 0,3 m/min. lugar a bolacha com a camada DFR fixa no meio do laminador e iniciá-lo; o DFR é empurrado através do Laminador. Repita a etapa após a bolacha de giro de 180°.</li>
		<li>Para evitar a dobra do biosensor, laminar as duas camadas de traseiro desenvolvidos sobre a bolacha seguindo passos 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Empregando uma barreira hidrofóbica parando e selando o chip.
	<ol><li>Remover a camada protetora do lado da frente do canal DFR leigosEr, colocando fita adesiva padrão em uma extremidade da DFR e puxando para cima. Use um dispensador de mão com 0,004-em tubos para dispensar pequenas gotículas de politetrafluoroetileno dissolvido em poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídicos, estratificação da camada de cobertura DFR para a camada de canal, conforme descrito na etapa 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Rígido de cozer o biosensor microfluidic.
	<ol><li>Remover tudo protetora folhas na capa e parte traseira camadas DFR. Corte os biossensores em tiras usando um simples par de tesouras. Curar as fichas em um forno a 160 ° C por 3 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Procedimento de imobilização do ensaio no chip <ol><li>adsorção de avidina na área do canal de imobilização.
	<ol><li>Preparar uma solução de avidina 100 µ g/mL em 10 mM fosfato salino (PBS) a um pH de 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 µ l da solução para a entrada do biosensor avidina. 
		Nota: O canal é preenchido por forças capilares até que o líquido atinge a barreira hidrofóbica parar.</li>
		<li>Para garantir que o fluídico continua parando na barreira durante o tempo de incubação inteira, dispensar 2 µ l de DI-água na saída do chip. Incubar o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado.</li>
		<li>Remover os reagentes em excesso através da entrada do chip pela aplicação de um vácuo. Lavar o canal com 50 µ l de tampão de lavagem (PBS com 0,05% Tween 20), dispensado na tomada enquanto o vácuo está sendo aplicado. Secar o canal por 30 s, enquanto que o vácuo está sendo aplicado.</li>
	</ol></li> <li>Bloqueando a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica.
	<ol><li>Preparar uma solução de albumina de soro bovino (BSA) de 1% em PBS de 10mm a um pH de 7.4.</li>
		<li>Pipeta 2 µ l da solução de BSA de 1% sobre a entrada e 2 µ l de DI-água na saída do canal. Incube o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Oligos incubação do DNA marcados com biotina e 6-fam
	<ol><li>Preparar diferentes concentrações (0,001-5 µM) da solução de DNA em 10mm PBS a um pH de 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 µ l de uma concentração da solução de DNA na entrada e 2 µ l de DI-água na saída. Incubar o chip a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado.</li>
		<li>Repita o passo para as outras concentrações de DNA usando fichas adicionais biosensor 2.3.2.</li>
		<li>Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Imobilização de GOx-etiquetado anticorpos de 6-FAM.
	<ol><li>Formular uma concentração de 5 µ g/mL de anticorpos 6-FAM em 10mm PBS a um pH de 7.4.</li>
		<li>Introduzir 2 µ l da solução de anticorpo para a entrada e 2 µ l de DI-água para a saída do canal. Incube os anticorpos etiquetados a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Amperométrico sinal deteção usando a técnica de Stop-fluxo <ol><li>preparação da solução de substrato para a deteção de eletroquímica.
	<ol><li>Formular uma solução de glicose 40mm em PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.</li>
		<li>Para o tratamento preliminar, preparar uma solução de PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.</li>
	</ol></li> <li>Tratamento preliminar dos eléctrodos trabalho.
	<ol><li>Utilize o suporte de microplaqueta feitos sob medida para permitir a fácil colocação de chip e uma conexão elétrica e fluídico.</li>
		<li>Conectar eletricamente o biosensor para a potentiostat. Garantir o contato fluídico do canal microfluidic numa bomba e o reservatório de reagente, usando o adaptador feitos sob medida e tubos. Iniciar o laptop que está conectado para o potentiostat e iniciar o controlador de bomba de seringa, controlando o fluxo fluídico através do chip.</li>
		<li>Ligue a bomba de seringa manualmente, com PBS 0,1 M, com um caudal de 20 µ l/min. Para o eletrodo de trabalho contra o eletrodo de referência em-microplaqueta, aplicar tensão alternada de 0,8 e-0.05 V para 5 s cada 30 ciclos. Em seguida, oxidar o eletrodo de trabalho aplicando uma tensão de 0,8 V por 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Leitura do ensaio, usando a técnica de stop-fluxo.
	<ol><li>Para iniciar a leitura do sinal de ensaio, aguarde até que o sinal medido atual estabiliza. Parar a bomba de seringa e alternar o reagente de PBS 0,1 M, para a solução de glicose 40mm e iniciar o software para o controlador de bomba de seringa; Ele irá parar automaticamente o fluxo de 1, 2 ou 5 minutos e então irá reiniciar o fluxo novamente. Observar o pico de corrente resultante. 
		Nota: Para a análise dos dados, o pico de corrente ou a carga de pico pode ser considerada, conforme descrito no modelo de uma leitura de sinal eletroquímico ( Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo aqui apresentado para a fabricação de um biossensor electroquímico microfluidic permite o desenvolvimento de uma plataforma de baixo custo, compacto e fácil de usar para a detecção de biomoléculas. Dependendo o ensaio usado mais tarde no biosensor, vários biomarcadores diferentes podem ser detectados. Isto torna a plataforma muito versátil e fornece acesso aos vários domínios de aplicativos, de testes de diagnóstico padrão (por exemplo, determinar a presença de doenças específicas no consultório do m...

Nas últimas duas décadas, aplicações diagnósticas tornaram-se fundamental para estudos aprofundados sobre o desenvolvimento da saúde pública global. Tradicionalmente, ferramentas de diagnóstico de laboratório são utilizadas para a detecção de doenças. Mesmo que eles ainda desempenham um papel chave no diagnóstico de doenças, teste point-of-care (bolso) executada perto do paciente ou pelo próprio paciente tornou-se mais e mais comuns nos últimos anos. Especialmente em tais casos que requerem tratamento imediato, tais como infarto agudo do miocárdio ou monitoramento de diabetes, a confirmação rápida de uma constatação clínica é essencial. Portanto, há uma necessidade crescente de dispositivos de bolso que pode ser operado por não-especialistas e que são simultaneamente capaz de realizar testes diagnósticos precisos em vitro em um curto espaço de tempo,1,2,3,4 .
Melhorias notáveis já foram alcançadas no domínio do bolso. No entanto, ainda existem muitos desafios a superar,5,6,7,8. Para uma plataforma de bolso para ser lançado com sucesso no mercado e ser competitivo com o diagnóstico de laboratório, o dispositivo estritamente deve cumprir os seguintes requisitos: (i) fornecer resultados de testes precisos e quantitativos que são consistentes com o laboratório conclusões; (ii) ter curto amostra para o resultado vezes, permitindo o tratamento imediato do paciente; (iii) apresentam descomplicado e fácil manuseio, mesmo quando operado por pessoas inexperientes e requer a intervenção do usuário minimizado; e (iv) são compostos por uma unidade de sensor de baixo custo projetada para aplicações de uso único. Além disso, livre de equipamentos diagnósticos são favoráveis, principalmente em ambientes de poucos recursos,3,4,6.
Devido a estas exigências severas, apenas dois sistemas de bolso, baseados na deteção de eletroquímica (por exemplo, sangue teste tiras de glicose) e em imunoensaios de fluxo lateral (por exemplo, testes de gravidez) tem sido lançados com sucesso ao mercado tão até agora. No entanto, ambos os sistemas sofrem desvantagens como mau desempenho (ou seja, sangue glicose monitoramento tem resultados imprecisos e ensaios de fluxo lateral apenas fornecem resultados qualitativos (positivo ou negativo) medição)4, 6. Estas desvantagens dos sistemas convencionais de bolso têm levado a uma crescente demanda em explorar novas tecnologias que oferecem deteção rápida, baixo custo e quantitativa no ponto de cuidado4,5.
Para enfrentar estes desafios frente para dispositivos de bolso, DFR tecnologia tem sido recentemente empregada para a fabricação de biosensores descartável e de baixo custo9,10,11,12, 13 , 14. em comparação com materiais litográficas moles e líquidos, tais como PDMS ou SU-8, DFRs apresentam muitos benefícios: (i) estão disponíveis em uma variedade de composições e espessuras (a partir de alguns mícrons a vários milímetros); (ii) tem uma área de superfície muito áspera, o que facilita a adesão de vários materiais; (iii) uniformidade de espessura excelente recurso; (iv) oferecer fabricação barata, fácil e alta produtividade para a produção em massa; (v) são fáceis de cortar com várias ferramentas de baixo custo, como um simples par de tesouras; e (vi) permitem a criação de estruturas tridimensionais, tais como canais microfluídicos, empilhando camadas múltiplas de DFR em cima do outro.
Por outro lado, DFRs em geral têm uma resolução relativamente pobre em comparação com photoresists líquido, que é causada principalmente pela espessura do filme e pela maior distância entre a máscara e o DFR devido a película protectora, que além disso permite que a luz dispersão. Ainda, para a fabricação de biosensores microfluidic integrado, DFRs são altamente adequados para produção em massa de baixo custo.
Portanto, nós apresentamos neste trabalho a fabricação e aplicação de um biossensor microfluidic eletroquímica DFR-baseado. O protocolo detalhado descreve cada etapa de produção da plataforma de biosensor, a imobilização em-microplaqueta de um ensaio de modelo baseado em DNA e sua leitura eletroquímica, usando a técnica de stop-fluxo. Esta plataforma universal permite a detecção de vários tipos de biomoléculas, usando tecnologias de ensaio diferentes (por exemplo, genómica, cellomics e proteômica) ou formatos de ensaio (por exemplo, do competidor, sanduíche ou direta). Com base em tal uma plataforma DFR, nosso grupo anteriormente demonstrou com sucesso a quantificação rápida e sensível de vários analitos, incluindo antibióticos13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e ß-lactâmicos), troponina17e substância P18.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Usado como substrato de poliimida</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit para definir a deposição de platina</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Desenvolvedor para MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Material do eletrodo e da almofada</td></tr><tr><td>de contato Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Removedor para MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Fotorresistente para definir a área do eletrodo e como isolamento</td></tr><tr><td>acetato de 1-metoxi-2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Revelador para SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Remoção do revelador SU-8</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>Fita adesiva sensível aos raios UV para proteção de almofadas de contato</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>Para deposição de prata no eletrodo</td></tr><tr><td>de referência KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>Para cloração do eletrodo de referência de prata</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Filme seco fotorresistente</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Revelador para Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Cloreto de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>Para completar o desenvolvimento do DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>Para empregar a barreira de parada</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega</td> <td>Electronics-Tanque</td> de <td>gravação em bolhas</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Forno</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT-Spin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>coater Pr&auml; zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Placa quente</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Unidade de exposição</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td> Unidade <td>Diener-Plasma</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univex 500</td><td>Leybold-Unidade</td><td></td> <td>física de deposição de vapor</td></tr><tr><td>Agitador S4</td><td>ELMI-Agitador</td><td></td> <td>orbital</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Banho sônico</td></tr><tr><td>6221 DC e AC</td><td>Keithley-Fonte</td> <td>de</td> <td>corrente</td></tr><tr><td>HRL 350</td> <td>Ozatec-Laminator unidade</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Caneta de vácuo</td><td>EFD-Caneta</td><td></td> <td>de vácuo</td></tr></tbody></table>

película seca baseada em fotorresiste eletroquímica microfluidic biosensor plataforma: fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Nos últimos anos, o diagnóstico de biomarcador tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico de doenças humanas, especialmente para o diagnóstico point-of-care. Uma plataforma fácil de usar e de baixo custo sensor é altamente desejada para medir vários tipos de analitos (por exemplo, biomarcadores, hormônios e drogas) quantitativamente e especificamente. Por esta razão, tecnologia de película seca fotorresiste - permitindo barato, fabricação fácil e elevado-throughput - foi usada para fabricar o biosensor microfluidic aqui apresentado. Dependendo o bioensaio usado depois disso, a plataforma versátil é capaz de detectar vários tipos de biomoléculas. Para a fabricação do dispositivo, eléctrodos de platina são estruturados em uma folha de poliimida flexível (PI) na etapa de processo de sala limpa apenas. A folha PI serve como substrato para os eletrodos, que são isolados com uma fotorresiste baseada em epóxi. O canal microfluídicos é posteriormente gerado pelo desenvolvimento e laminação de folhas de fotorresiste (DFR) de película seca para a bolacha de PI. Usando uma barreira hidrofóbica parar no canal, o canal é separado em duas áreas específicas: uma seção de imobilização para o ensaio enzima-lig e uma célula eletroquímica de medição para a leitura de sinal amperométrico.
A imobilização de bioensaio em-microplaqueta é executada por adsorção das biomoléculas para a superfície do canal. Enzima glicose oxidase é usada como um transdutor para geração de sinal eletroquímico. Na presença do substrato, glicose, peróxido de hidrogênio é produzido, que é detectada ao eléctrodo de platina trabalho. A técnica de stop-fluxo é aplicada para obter amplificação de sinal junto com detecção rápida. Biomoléculas diferentes podem ser medidas quantitativamente por meio do sistema introduzido microfluídicos, dando uma indicação dos diferentes tipos de doenças, ou, em relação a drogas terapêuticas, monitoramento, facilitando uma terapia personalizada.

Projeto e fabricação da plataforma Microfluidic Biosensor:
A fabricação dos chips microfluídicos biosensor é realizada no nível do bolacha por técnicas padrão fotolitográfica, empregando várias camadas DFR. Esta estratégia de fabricação depende da laminação de camadas desenvolvidas de DFRs sobre um substrato de PI platina-modelados, formando os canais microfluídicos. Um breve resumo descrevendo as etapas de fabricação diferentes é ...

Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma plataforma versátil de biossensor eletroquímico microfluídico baseada em tecnologia de resistência fotográfica seca de baixo custo, capaz de medir diversos tipos de analitos dependendo do ensaio com enzima imobilizada posteriormente utilizado. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de testes diagnósticos rápidos, como a quantificação de diferentes medicamentos, por exemplo antibióticos, ou o diagnóstico de várias doenças, tais como o câncer. A principal vantagem desta técnica é que o biossensor aqui apresentado baseia-se principalmente em materiais de baixo custo, é de fácil utilização e altamente versátil em termos de aplicação.A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas relacionadas aos filmes secos de fotoresina são difíceis de dominar, já que o manuseio exige muito treinamento e prática. A imobilização e medição do ensaio em chip serão demonstradas por Eva Grether, uma assistente estudante do meu grupo. Para começar, corte um substrato de poliimida, ou PI, em pastilhas redondas de seis polegadas.Em seguida, coloque a pastilha de PI em uma estufa a 120 graus Celsius, por aproximadamente uma hora para uma calcinação de desidratação. Para realizar o primeiro passo de fotolitografia para o processo de liftoff, programe o spin coater para um tempo de centrifugação de 30 segundos a 3000 rpm com uma aceleração de 2000 rpm por segundo. Coloque a pastilha de PI no spin coater e fixe-a aplicando vácuo.Em seguida, inicie o programa do spin coater e distribua dois mililitros de um resist, permitindo o processo de liftoff. Retire a pastilha do spin coater e faça uma pré-secagem da pastilha de PI em uma placa aquecida por dois minutos a 100 graus Celsius. Ajuste a máscara desejada para a padronização dos eletrodos na pastilha de PI a olho nu e exponha-a a 400 milijoules por centímetro quadrado de luz UV.Em seguida, coloque a pastilha em um recipiente cheio com um revelador compatível com o resist sobre um agitador orbital e deixe agitar levemente por um minuto. Após a remoção do resist excedente, use um chuveiro para enxaguar a pastilha de PI com água desionizada em uma bancada úmida, antes de secá-la com ar comprimido. A seguir, deposite platina para a formação dos eletrodos utilizando um processo padrão de deposição física de vapor para depositar 200 nanômetros de platina sobre a pastilha.Após colocar a pastilha em um recipiente, adicione o removedor apropriado ao recipiente e remova a resistência de levantamento, agitando levemente a pastilha em um agitador orbital até que toda a platina em excesso seja removida. Após enxaguar e secar a pastilha de PI como anteriormente, realize o segundo passo de fotolitografia e limpe os eletrodos conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, passeive as pastilhas de contato de platina da pastilha com uma fita adesiva sensível à luz UV.Para tanto, corte a folha de alumínio em tiras com cinco milímetros de largura e onze centímetros de comprimento e fixe-as sobre a pastilha, protegendo as partes que não devem receber depósito de prata. Para a deposição de prata, coloque uma banho ultra-sônico em uma capela de exaustão e insira um recipiente com solução eletrolítica de prata no banho. Ajuste o banho ultra-sônico à temperatura ambiente e reduza a potência para 10%. Conecte o contato de massa dos eletrodos de referência a uma fonte de corrente constante.Em seguida, conecte o eletrodo auxiliar, um fio de prata imerso na solução eletrolítica de prata, à fonte de corrente, utilizando cabos de conexão padrão. Ajuste a fonte de corrente para corrente contínua (DC) e uma densidade de corrente de aproximadamente 4,5 miliampères por centímetro quadrado, resultando em uma taxa de deposição de prata de cerca de 0,3 mícrons por minuto. Inicie o banho ultrassônico e mantenha a fonte de corrente em funcionamento por 10 minutos.Após 10 minutos, enxágue a pastilha com água desionizada. Para realizar o terceiro passo de fotolitografia, primeiro corte as camadas de resistência fotográfica em filme seco para um tamanho semelhante ao da pastilha. Fixe a máscara desejada na unidade de exposição e alinhe a camada de DFR sobre a máscara usando o olho nu.Em seguida, ilumine a resina com 250 milijoules por centímetro quadrado de luz UV. Remova a folha protetora da resina fotossensível e desenvolva a resina por cerca de dois minutos em uma solução de carbonato de sódio a 1%, utilizando um banho ultrassônico padrão, pré-aquecido a 42 graus Celsius e com potência ultrassônica de 100%. Para interromper imediatamente a reação, agite a resina por um minuto em um banho de ácido clorídrico a 1% em um agitador orbital. Enxágue e seque cada camada de DFR como anteriormente.Para laminar as camadas de DFR sobre o substrato de PI, coloque a pastilha de PI sobre uma folha de transparência para retroprojetor e fixe-a usando fita adesiva comum. Ajuste a camada de DFR do canal sobre a pastilha de PI sob um microscópio, utilizando as estruturas de alinhamento correspondentes. Para a laminação, use um laminador térmico de rolo padrão e aqueça previamente o rolo superior a 100 graus Celsius e o rolo inferior a 60 graus Celsius.Defina a pressão em três bar com uma velocidade de avanço de 0,3 metros por minuto. Coloque a pastilha com a camada de DFR fixada no centro do laminador e inicie o processo para que o DFR seja empurrado através do laminador. Repita o passo após girar a pastilha em 180 graus.Em seguida, remova a camada protetora do lado frontal da camada do canal DFR colocando fita adesiva comum em uma extremidade do DFR e puxando-a para cima. Use um dispensador manual com tubos de 0,004 polegadas para dispensar pequenas gotas de politetrafluoretileno dissolvido nos poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídico, lamine a camada superior DFR sobre a camada de canal como anteriormente.Em seguida, faça a cura final do biossensor microfluídico removendo primeiramente todas as películas protetoras das camadas DFR da tampa e do lado traseiro. Corte os biossensores em tiras usando uma tesoura comum. Por fim, cure os chips em uma estufa a 160 graus Celsius por três horas.Para absorver avidina na área de imobilização do canal, aplique dois microlitros da solução de avidina na entrada do biossensor. Para garantir que o fluxo permaneça parado na barreira durante todo o tempo de incubação, aplique dois microlitros de água desionizada na saída do chip. Incube o chip a 25 graus Celsius por uma hora em um recipiente fechado.Remova os reagentes em excesso através da entrada do chip aplicando vácuo. Em seguida, lave o canal com 50 microlitros de tampão de lavagem dispensado na saída enquanto o vácuo estiver sendo aplicado. Seque o canal por 30 segundos com vácuo.Bloqueie a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica, aplicando dois microlitros de solução de BSA 1% na entrada e dois microlitros de água desionizada na saída do canal. Incube o chip a 25 graus Celsius por uma hora em um recipiente fechado antes de remover os reagentes de acesso e secar o canal como anteriormente. Em seguida, incube os oligonucleotídeos de DNA marcados com biotina e seis FAM dispensando dois microlitros de uma concentração da solução de DNA na entrada e dois microlitros de água desionizada na saída.Incube o chip a 25 graus Celsius por 15 minutos em um recipiente fechado antes de remover os reagentes de acesso e secar o canal. Para imobilizar os anticorpos anti-seis FAM marcados com glicose oxidase, introduza dois microlitros da solução de anticorpo na entrada e dois microlitros de água desionizada na saída do canal. Novamente, incube os anticorpos marcados a 25 graus Celsius por 15 minutos em um recipiente fechado antes de remover os reagentes em excesso.Aplicar o espaçador de PMMA fluídico sobre o biossensor e conectar eletricamente o biossensor ao potenciostato. Realizar a conexão fluídica da bomba de seringa com o biossensor utilizando o adaptador fluídico. Iniciar manualmente a bomba de seringa com PPS 0,1 molar a uma taxa de fluxo de 20 microlitros por minuto.No eletrodo de trabalho em relação ao eletrodo de referência em chip, aplique 30 ciclos de uma voltagem alternada de 0,8 e 0,05 volts durante cinco segundos cada. Em seguida, oxide o eletrodo de trabalho aplicando uma voltagem de 0,8 volts por 60 segundos. Para iniciar a leitura do sinal do ensaio, aguarde até que o sinal de corrente medido se estabilize.Interrompa a bomba de seringa e troque o reagente de PPS 0,1 molar para uma solução de glicose 40 milimolar antes de iniciar o software no controlador da bomba de seringa. Após interromper automaticamente o fluxo por um, dois ou cinco minutos, a bomba de seringa reiniciará o fluxo novamente. Observe o pico das correntes resultantes.O biossensor eletroquímico contém um único canal microfluídico com duas áreas distintas separadas por uma barreira hidrofóbica de parada. A área de imobilização, onde o ensaio é imobilizado pela simples absorção das biomoléculas, e a célula eletroquímica, onde é realizada a leitura amperométrica do ensaio. Para a leitura amperométrica do biossensor, utiliza-se a chamada técnica de parada de fluxo.Primeiro, aplica-se um fluxo constante do substrato enzimático glicose. Após a estabilização do sinal, o fluxo é interrompido. Durante a fase de parada, a glicose é convertida em peróxido de hidrogênio e acumulada no canal.Ao reiniciar o fluxo, o peróxido de hidrogênio é lavado através da célula eletroquímica, onde é detectado, resultando em um pico de corrente. Dependendo da quantidade de analito ligado, e portanto da quantidade de glicose oxidase ligada, a altura do sinal varia, o que resulta em uma curva de calibração exemplar, como vista aqui. Uma vez dominada, a fabricação do biossensor pode ser realizada em aproximadamente 10 horas, se for feita corretamente.Embora o tempo de incubação e leitura do ensaio dependa do ensaio empregado, geralmente pode ser realizado em até três horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão sobre a fabricação, preparação do ensaio em chip e operação dos biossensores eletroquímicos baseados em fotoresiste seco em filme. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que todas as etapas do protocolo sejam rigorosamente seguidas e realizadas com grande cautela.Como o desempenho do sensor depende fortemente do processo de fabricação, as implicações dessa técnica estendem-se à medicina personalizada, abrangendo o diagnóstico in loco de diferentes tipos de doenças e medicamentos, facilitando assim terapias individualizadas. Não se esqueça de que trabalhar com soluções eletrolíticas de prata pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos de segurança e luvas apropriadas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema (Vídeo) | JoVE Journal

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

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