Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

O objetivo geral deste procedimento é introduzir uma plataforma versátil de biossensor microfluídico eletroquímico baseada na tecnologia fotorresistente de filme seco de baixo custo, capaz de medir vários tipos de analitos, dependendo do ensaio ligado a enzima imobilizada usado posteriormente. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo dos testes no local de atendimento, como a quantificação de diferentes medicamentos, como antibióticos, ou o diagnóstico de várias doenças, como o câncer. A principal vantagem desta técnica é que o biossensor aqui apresentado é baseado principalmente em materiais de baixo custo, fáceis de usar e altamente versáteis em termos de aplicação.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas relacionadas às fotorresistências de filme seco são difíceis de dominar porque o manuseio requer muito treinamento e prática. Demonstrando a imobilização e medição do ensaio no chip estará Eva Grether, uma assistente estudantil do meu grupo. Para começar, corte um substrato de poliimida ou PI em bolachas redondas de seis polegadas.

Em seguida, coloque o wafer PI no forno a 120 graus Celsius, por cerca de uma hora para assar por desidratação. Para executar a primeira etapa de fotolitografia para o processo de decolagem, programe o codificador de rotação para um tempo de rotação de 30 segundos a 3000 rpm com uma aceleração de 2000 rpm por segundo. Coloque o wafer PI no codificador de rotação e fixe-o aplicando um vácuo.

Em seguida, inicie o programa do codificador de rotação e dispense dois mililitros de resistência, permitindo o processo de decolagem. Remova o wafer do codificador de centrifugação e asse suavemente o wafer PI em uma placa quente por dois minutos a 100 graus Celsius. Ajuste a máscara desejada para padronizar os eletrodos no wafer PI a olho nu e exponha-a a 400 milijoules por centímetro quadrado de luzes UV.

Em seguida, coloque o wafer em uma tigela cheia de um revelador de resistência em um agitador orbital e deixe agitar levemente por um minuto. Depois que a resistência de acesso for removida, use um chuveiro para enxaguar o wafer PI com água deionizada em uma bancada úmida, antes de secá-lo com ar comprimido. Em seguida, deposite platina para a formação dos eletrodos usando um processo de deposição de vapor físico padrão para depositar 200 nanômetros de platina no wafer.

Depois de colocar o wafer em uma tigela, adicione o removedor correspondente à tigela e remova a resistência à decolagem, enquanto agita levemente o wafer em um agitador orbital até que toda a platina de acesso seja removida. Após enxaguar e secar o wafer PI como antes, execute a segunda etapa de fotolitografia e limpe os eletrodos conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, passivar as almofadas de contato de platina do wafer com uma fita adesiva sensível aos raios UV.

Para isso, corte a folha em tiras de cinco milímetros de largura e 11 centímetros de comprimento e prenda-as ao wafer, protegendo as partes que não devem ser depositadas com prata. Para a deposição de prata, coloque um banho sônico em uma capela de exaustão e insira um recipiente de solução de eletrólito de prata no banho. Defina o banho sônico para temperatura ambiente e depower para 10%Conecte o contato em massa dos eletrodos de referência a uma fonte de corrente constante.

Em seguida, conecte o contra-eletrodo, um fio de prata imerso na solução de eletrólito de prata, à fonte de corrente, usando cabos de conexão padrão. Defina a fonte de corrente para DC e para uma densidade de corrente de cerca de 4,5 miliamperes por centímetro quadrado, resultando em uma taxa de deposição de prata de aproximadamente 0,3 mícrons por minuto. Inicie o banho sônico e deixe a fonte atual funcionar por 10 minutos.

Após 10 minutos, enxágue o wafer com água deionizada. Para realizar a terceira etapa da fotolitografia, primeiro corte as camadas de fotorresistente de filme seco em um tamanho semelhante ao do wafer. Fixe a máscara desejada na unidade de exposição e alinhe a camada DFR na máscara a olho nu.

Em seguida, ilumine a resistência com 250 milijoules por centímetro quadrado de luz UV. Remova a película protetora do fotorresistente e desenvolva a resistência por cerca de dois minutos em uma solução de carbonato de sódio a 1%, usando um banho sônico padrão, pré-aquecido a 42 graus Celsius e a uma potência sônica de 100% Para interromper a reação imediatamente, agite a resistência por um minuto em um banho de ácido clorídrico a 1% em um agitador orbital. Enxágue e seque cada camada de DFR como antes.

Para laminar as camadas de DFR no substrato PI, coloque o wafer PI em uma folha suspensa de transparência e fixe usando fita adesiva padrão. Ajuste a camada DFR do canal no wafer PI sob um microscópio usando as respectivas estruturas de alinhamento. Para a laminação, use um laminador de rolo quente padrão e pré-aqueça o rolo superior a 100 graus Celsius e o rolo inferior a 60 graus Celsius.

Defina a pressão para três bar com uma velocidade de avanço de 0,3 metros por minuto. Coloque o wafer com a camada fixa de DFR no meio do laminador e inicie-o de forma que o DFR seja empurrado através do laminador. Repita a etapa depois de girar o wafer em 180 graus.

Em seguida, remova a camada protetora da parte frontal da camada do canal DFR colocando fita adesiva padrão em uma extremidade do DFR e puxando-a para cima. Use um dispensador manual com tubos de 0.004 polegadas para dispensar pequenas gotículas de politetrafluoretileno dissolvido nos poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídico, laminar a camada de cobertura DFR na camada do canal como antes.

Em seguida, faça o cozimento do biossensor microfluídico removendo primeiro todas as películas protetoras da tampa e das camadas traseiras de DFR. Corte os biossensores em tiras usando uma tesoura comum. Por fim, cure as batatas fritas em um forno a 160 graus Celsius por três horas.

Para absorver a avidina na área de imobilização do canal, dispense dois microlitros da solução de avidina na entrada do biossensor. Para garantir que o fluido continue parando na barreira durante todo o tempo de incubação, dispense dois microlitros de água deionizada na saída do cavaco. Incube o chip a 25 graus Celsius por uma hora em um recipiente fechado.

Remova o excesso de reagentes através da entrada do chip aplicando um vácuo. Em seguida, lave o canal com 50 microlitros de tampão de lavagem dispensado na saída enquanto o vácuo está sendo aplicado. Seque o canal por 30 segundos com vácuo.

Bloqueie a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica pelo cabeçalho do tubo dois microlitros de solução 1% BSA na entrada e dois microlitros de água deionizada na saída do canal. Incube o chip a 25 graus Celsius por uma hora em um recipiente fechado antes de remover os reagentes de acesso e secar o canal como antes. Em seguida, incube oligos de DNA marcados com biotina e seis FAM, dispensando dois microlitros de uma concentração da solução de DNA na entrada e dois microlitros de água deionizada na saída.

Incube o chip a 25 graus Celsius por 15 minutos em um recipiente fechado antes de remover os reagentes de acesso e secar o canal. Para imobilizar a glicose oxidase marcada com seis anticorpos FAM, introduza dois microlitros da solução de anticorpos na entrada e dois microlitros de água deionizada na saída do canal. Novamente, incube os anticorpos marcados a 25 graus Celsius por 15 minutos em um recipiente fechado antes de remover o excesso de reagentes.

Aplique o espaçador de PMMA fluídico no biossensor e conecte eletricamente o biossensor ao potenciostato. Realize a conexão fluídica da bomba de seringa com o biossensor usando o adaptador fluídico. Ligue a bomba de seringa manualmente com um PPS de 0,1 molar a uma taxa de fluxo de 20 microlitros por minuto.

No eletrodo de trabalho versus o eletrodo de referência no chip, aplique 30 ciclos de uma tensão alternada de 0,8 e 0,05 volts por cinco segundos cada. Em seguida, oxide o eletrodo de trabalho aplicando uma tensão de 0,8 volts por 60 segundos. Para iniciar a leitura do sinal do ensaio, aguarde até que o sinal de corrente medido se estabilize.

Pare a bomba de seringa e mude o reagente de PPS 0.1 molar para uma solução de glicose 40 milimolar antes de iniciar o software no controlador da bomba de seringa. Depois de interromper automaticamente o fluxo por um, dois ou cinco minutos, a bomba de seringa reiniciará o fluxo novamente. Observe o pico das correntes resultantes.

O biossensor eletroquímico contém um único canal microfluídico com duas áreas distintas separadas pela barreira de parada hidrofóbica. A área de imobilização, onde o ensaio é imobilizado por simples absorção das biomoléculas e a célula eletroquímica onde é realizada a leitura amperométrica do ensaio. Para a leitura amperométrica do biossensor, é utilizada a chamada técnica de stop-flow.

Primeiro, um fluxo constante do substrato enzimático glicose é aplicado. Depois que o sinal se estabiliza, o fluxo é interrompido. Durante a fase de parada, a glicose é convertida em peróxido de hidrogênio e é acumulada no canal.

Ao reiniciar o fluxo, o peróxido de hidrogênio é liberado através da célula eletroquímica onde é detectado, resultando em um pico de corrente. Dependendo da quantidade de analito ligado e, portanto, da quantidade de glicose oxidase ligada, a altura do sinal varia, o que resulta em um exemplo de curva de calibração, como visto aqui. Uma vez dominado, a fabricação do biossensor pode ser feita em cerca de 10 horas se for executada corretamente.

Enquanto o tempo de incubação e leitura do ensaio depende do ensaio empregado, geralmente pode ser realizado dentro de três horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre a fabricação na preparação do ensaio de chip e a operação dos biossensores eletroquímicos baseados em fotorresistentes de filme seco. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que todas as etapas do protocolo sejam rigorosamente seguidas e executadas com muito cuidado.

Uma vez que o desempenho do sensor depende fortemente do processo de fabricação. As implicações desta técnica estendem-se a uma medicina personalizada que abrange o diagnóstico presencial de diferentes tipos de doenças e medicamentos, facilitando assim a terapia individualizada. Não se esqueça de que trabalhar com soluções de eletrólitos de prata pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de óculos de segurança e luvas apropriadas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.