Name: Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda nanotomia por microscopia eletrônica em larga escala para estudar o cérebro de Danio rerio saudável e lesionado. Esta técnica permite análise de macromoléculas a tecidos com resolução nanométrica.

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Maior parte do trabalho foi realizada no UMCG Microscopia e Imaging Center (UMIC), que é patrocinado pela NWO 175-010-2009-023 e ZonMW 91.111.006; STW &quot;Microscopia Vale 12718&quot; para BNGG. Este trabalho foi patrocinado por uma concessão ZonMW Veni, uma bolsa de integração na carreira Marie Curie (economia morrendo neurônios) e uma bolsa de Alzheimer Nederland para TJvH

Todos os experimentos com larvas do peixe foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Groningen Experimentação Animal de acordo com as diretrizes nacionais e da UE. Preparação 1. Amostra <ol><li> Fixação and Embedding <ol><li> Fixação <ol><li> Anestesiar as larvas de peixes em tricaina (0,003%) adicionado ao (NaCl a 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33, MgSO4 0,33 mM, HEPES 10 mM, pH 7,6) E3 água do peixe-zebra e teste de profundidade de anestesia picando suavemente com uma ponta de pipeta 200 uL sob microscópio de dissecção até que o movimento não é mais detectado (Figura 1A). </li><li> Quando o processamento de amostras para o EM correlativo depois de adquirir em dados de imagem in vivo utilizando imagiologia confocal ou dois fotões em 1,8% de agarose como descrito, 5,15 correcção larvas em agarose utilizando 4% de PFA em PBS contendo Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Corte larvas de agarose e processo paraEM grande escala 5. </li><li> Fix larvas em fresco de paraformaldeído 4% em PBS contendo Triton-X-100 (0,05%) durante 2 horas à temperatura ambiente em tubos de plástico. Nota: As células cultivadas em cultura (in vitro) pode ser directamente fixado em glutaraldeído, tal como descrito no passo seguinte (1.1.1.5). </li><li> Remoção da solução e adiciona-se 100 uL de 0,5% de PFA, glutaraldeído a 2% (GA), e cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4). Armazenar durante a noite a 4 ° C. Lavar as amostras duas vezes em cacodilato de sódio 0,1 M. </li><li> Cortar cabeças de larvas rostralmente ao hindbrain para facilitar a penetração de ósmio. Use seringas finas / fórceps. </li><li> Sufixo larvas em 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) /1.5% ferrocianeto de potássio (K 4 [Fe (CN) 6]) em cacodilato de sódio 0,1 M em gelo durante 2 horas e lavar 3 x 5 min em banho-H2O destilada </li><li> Desidratar em etanol por 20 min incubações em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 3 vezes 100%). </li></ol></li><li>Incorporação <ol><li> Prepare resina epóxi de acordo com receitas padrão usados ​​em laboratórios de EM. Nota: Nós usamos resina epoxi como se segue: Mistura de 19,8 g de éter glicídico 100, 9,6 g de anidrido do ácido 2-dodecenilsuccínico e 11,4 g de anidrido methylnadic utilizando um agitador magnético. Adicionar 0,5 g de DMP-30 (tris- (dimetilaminometil) fenol) e misturar novamente. </li><li> Incubar durante a noite em larvas de resina epóxi 50% em etanol (v / v) durante a rotação (RT). </li><li> Substitua diluído epoxy-resina com resina pura. Incubar durante 30 min, adicionar resina fresca novamente e incubar durante mais 30 min. Novamente actualizar a resina e, em seguida incubar 3 horas à temperatura ambiente, seguido de 15 min a 58 ° C e mais 1 h à TA sob pressão reduzida (200 mbar). </li><li> Orientar as cabeças em silício plana moldes de incorporação disponíveis comercialmente sob um microscópio de dissecação com uma agulha ou com o palito anterior virado para o lado do molde ou conforme necessário (Figura 1B). </li><li> Polimerizar res epóxino dia para o outro a 58 ° C. Se resina epóxi é ainda muito mole permitir que outro dia para polimerizar e endurecer a 58 ° C. Teste rigidez através da aplicação de pressão usando uma pinça. Se isso deixa facilmente um recuo permitir que outro dia para polimerizar e endurecer a 58 ° C. Quando amostra é completamente endurecido avançar para desbastar e cortar. </li><li> Corte o excesso de resina das stub usando lâminas de barbear (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li><li> Seccionamento, contrastando, e Montagem <ol><li> seccionamento <ol><li> bloco de resina epóxi seção usando um ultramicrotome. </li><li> Usar uma faca de vidro ou um histoknife diamante para cortar secções de cortes semifinos (500 nm) para o azul de toluidina fucsina / básico (Figura 1D) coloração para detectar o posicionamento direito. </li><li> Transferência de secções semi-finas em lâminas microscópicas por pegá-los com uma pipeta Pasteur de vidro cuja ponta foi fechado pelo derretimento em uma chama. Seco sobre um prato quente uté a água terminar. Mancha durante 10 segundos com 1% de azul de toluidina em água em uma placa quente e após enxaguamento com água, a mancha durante 10 segundos com 0,05% fucsina básica em 1% de tetraborato de sódio. Examinar com um microscópio de luz normal em 10X a 40X. </li><li> Quando o local apropriado / orientação dentro do cérebro é alcançado, continuar o corte do bloco de resina epóxi com uma faca de diamante para cortar cortes ultrafinos (~ 70 nm; Figura 1E) </li><li> Use estruturas anatômicas facilmente identificáveis ​​e em torno do cérebro, incluindo poços olfativos, olhos, limites matéria cinzenta-brancas, para identificar a região de interesse durante ultrafinos de corte e para ajustar o ângulo de corte quando a amostra é inclinada. </li><li> Seção de montagem no único slot grades L2 x 1 cobre (Figura 1F), para permitir a aquisição ininterrupta por barras da grade. Use Formvar grades revestidas para apoiar as seções. </li></ol></li><li> contrastando <ol><li> cortes ultrafinos mancha na grades durante 2 min em 2% de acetato de uranilo em metanol seguido por citrato de chumbo de Reynolds durante mais 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Aquisição de Imagem <ol><li> Large Scale STEM Nota: Nós usamos EM digitalização com um gerador de varredura externa capaz de adquirir vários grandes campos de visão em alta resolução 3,5,7,17 ​​usando a detecção de STEM. Tipicamente, uma imagem gerada desta forma é equivalente aos campos de visão de ~ 100 imagens Microscópio Electrónico de Transmissão (TEM), reduzindo significativamente a quantidade de costura. <ol><li> Montagem da amostra no microscópio <ol><li> Coloque grade com seção no suporte de amostras grade do múltiplo e transferir para a câmara do SEM. </li></ol></li><li> Alinhamento do Detector STEM <ol><li> Coloque a grade com a amostra sob o feixe e movê-lo para que ele será aprox. 5 mm a partir do poste de lente. Adquirir uma imagem a 20 kV usandoo detector na lente. </li><li> Concentre-se na borda da rede e ajustar a distância de trabalho para 4,0 mm. </li><li> Mova o suporte de amostra para uma posição segura e trazer o detector STEM. </li><li> O centro do furo do detector STEM na imagem de campo girando os ajustes parafusos enquanto os de imagem na velocidade máxima com o detector na lente. </li><li> Cuidadosamente trazer de volta o suporte da amostra que só vai caber entre a lente do pólo e do detector. </li><li> Adquirir uma imagem com o detector na lente ter a certeza de estar na área de seção. </li><li> Mudar para STEM detecção (meio de ganho e de todos os quadrantes definidos em &quot;menos&quot;) e adquirir uma imagem e selecione a área a ser digitalizada. </li><li> Levante voltagem de aceleração de 21 kV e esperar para a estabilização do feixe (imagem estável novamente) e, em seguida, ir para 29 kV em passos de 2 kV. </li></ol></li><li> Obtenção de imagens <ol><li> Pré-irradiar a amostra (para evitar alterações de brilho causadas pelo e-beam) por zoompara fora de modo que a área total a ser digitalizado encaixa janela de imagem. </li><li> Mudar a abertura 120 um (para manter a gama dinâmica adequada os ganhos do detector têm de ser reduzida uma etapa). </li><li> De-foco para a imagem está desfocada. </li><li> Faça a área digitalizada tão apertada quanto possível usando a opção de digitalização área reduzida. </li><li> Defina a velocidade de verificação de tal modo que um quadro é digitalizada em aprox. 1-2 seg. Nota: Dependendo do tamanho e do tecido isso normalmente leva ½ h (100 x 100 um FOV) de até 3 h (1000 x 500 mm). </li><li> Aumentar em pelo menos 100X e digitalizar uma pequena área por 10 seg. Nota: Quando esta área não alterar o brilho em comparação ao seu redor, pré-irradiação é suficiente. </li><li> Trazer de volta a abertura 30 mm (e STEM ganho em média) </li><li> Focar a amostra. </li><li> Alinhar abertura usando o wobbler (em ~ 40,000X ampliação). </li><li> Enquanto em foco selecionar o mais leve / área de recurso, defina a velocidade de verificação de tal forma que detalhessão visíveis. </li><li> No software microscópio ajustar brilho e contraste, observando cuidadosamente o histograma para manter todos os pixels na faixa dinâmica. Faça o mesmo para os mais escuros área / recursos. </li><li> Volte para a área brilhante e verifique novamente. Seja no lado seguro para que haja algum espaço em ambos os lados do histograma. </li><li> Zoom out para que a área total a ser digitalizado se encaixa a janela de imagem, e iniciar o grande programa de aquisição de área. </li><li> Use a opção de assistente para configurar um mosaico ao selecionar uma área da tela. Use tamanho do pixel 2-5 nm, dependendo do que detalhes são necessários. Use tempo de permanência 3 mS para STEM. </li><li> Selecione a opção &quot;autofocus na telha anterior&quot;, use o autofocus grande software de aquisição de escala, com configurações da empresa padrão, a caixa de seleção &quot;verificar a configuração antes da execução&quot; e definir onde salvar os dados. </li><li> Pressione &quot;otimizar&quot; para verificar as configurações de microscópio. Nota: Agora o tempo necessário será shpróprio. Isso pode ser de até 72 horas por 1 x 0,5 mm áreas. </li><li> Na janela tipo &quot;resolução máxima telha&quot; 20.000 telhas para individuais não será maior do que 20k x 20k, evitar efeitos de borda arredondada. Pressione o botão &quot;executar&quot;. </li><li> Quando perguntado para verificar a focagem e Brightness / Contrast (B / C), desligue gerador de varredura externa e cuidadosamente ajustar o foco e astigmatismo no software microscópio. Não altere B / C. Nota: A fase de podem ser movidos e ampliação alterado, mas a ampliação deve ser ajustado de volta para o tamanho do pixel desejado. </li><li> Ligue gerador de varredura externa novamente e pressione &quot;continuar&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> Análise 3. Dados <ol style="margin-left: 40px;"><li> Abra o programa visualizador de arquivos EM grande escala e abra o arquivo &quot;info mosaico&quot;. Isto irá abrir todos os tif-arquivos azulejos. Esta preferência é realizado em outra estação de trabalho a não obstruir novas aquisições. </li><li> Escolha a opção &#39;aupara costurar toda mosaico (parâmetros modo de sobrepor-se a metade, costurando limiar de 0,90, redução de ruído automática. Em caso critérios de costura não pode ser cumprida, zoom in e colocar manualmente azulejo na posição e clique em &quot;Continuar como está&quot;). </li><li> Exportar como um arquivo HTML, ou, alternativamente, como um único TIF. Note que para TIF exportar um downscaling pode ser necessário. Incluir o tamanho final do pixel no nome do arquivo que permite medições mais tarde. </li><li> Execute as anotações no arquivo TIF abrindo-o em um programa de edição de imagem. Em paralelo, abra o arquivo html com zoom em um navegador da web para observação resolução ideal. </li></ol>

<ol><li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+nanoscopy%3A+generation+of+ultra-large+high+resolution+electron+microscopy+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps.</a> J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

EM permite a análise de contexto celular com imagens de alta resolução das macromoléculas em contexto biológico. No entanto, isso normalmente limita o campo de visão. Maior escala 3D EM é particularmente adequado para a conectividade mapeamento neuronal através da criação de resolução nanoescala 3 reconstruções tridimensionais, exigindo processamento de dados complexos 10. Em contraste, 2D larga escala EM requer apenas uma única seção e costura dos dados de imagem e avaliação dos dados é possível por qualquer pessoa com acesso a um navegador de Internet. Nós e outros anteriormente utilizado EM grande escala para analisar tecidos e animais inteiros. Quanto mais se aproxima, TEM e costura à base de SEM tem suas próprias vantagens. Aqui, a transmissão de varredura EM (STEM) foi usada que permite a geração de um grande campo de visão em alta resolução. Normalmente, uma imagem STEM é equivalente aos campos de visão de cerca de 100 imagens de TEM, reduzindo significativamente a quantidade de costura quando imagiologia grande fields de vista em alta resolução. Se mais de alta resolução é necessária, pode ser vantajoso MET. HASTE tem a vantagem sobre TEM que as amostras não contrastou pode ser utilizado com um bom contraste ultra-6. Além disso, o método descrito aqui pode ser simplesmente ajustadas para utilização com uma detecção electrónica dispersa de volta (DEB) em secções montadas em lâminas de Si, o alargamento do uso de vários sistemas de microscópio. Tecidos HTML-zoomable arquivos EM são muito útil para a quantificação, a partilha de dados que podem não ter sido analisados ​​ao seu conteúdo completo, combinando LM e os dados de EM (Clem) 8, fins de apresentação na investigação científica, para analisar os dados do paciente, e para a educação. Alternativamente, em EM grande escala num SEM, mas não de uma ETM, bolachas de sílica pode ser usado, o qual tem duas vantagens principais: BSD pode ser utilizado, o que é mais, geralmente disponíveis no microscópios electrónicos de varrimento de detecção STEM. Em segundo lugar, a montagem de grandes secções (&gt; 1 mm 2 áreas dejuros) é simples. Montagem sobre grelhas de fenda simples é trabalhoso e tecnicamente desafiador. Comparação detalhada entre TEM, SEM e STEM é detalhado em outros lugares 6. Uma desvantagem de imagiologia BSD é que, em comparação com caule, as imagens têm um aumento de ruído. Isto pode em parte ser compensada pelo aumento do tempo de permanência do pixel, resultando em tempos de aquisição mais longos. Embora para preparação de amostras de processamento relativamente padrão EM (fixação, incorporação e de corte) é necessária 5-7, é tecnicamente desafiador para cortar grandes cortes ultrafinos completamente desprovido de artefatos. As seções são muito frágeis, facilmente quebrar, dobrar ou são destruídas durante o exame, o que normalmente leva várias horas por conjunto de dados. No entanto, devido à partilha on-line dos dados brutos imparciais, deve tornar-se possível comparar mais facilmente com dados publicados, e usar conjunto de dados publicados no domínio aberto como controlos. Actualmente, alguns dispositivos EM capaz de Laanálise rge escala estão em uso e, portanto, a acessibilidade a esta técnica é um pouco limitada, embora a maioria dos centros de imagem acolher os esforços de colaboração. Para as secções de grande escala o tecido tem de ser correctamente fixada em toda a amostra. É por isso uma mistura do jejum, mas moderada fixador PFA é utilizado em combinação com a lenta mas forte fixador GA. Corte e pegar grandes seções sem artefatos é difícil. Trabalhando com wafers em combinação com BSD é mais fácil em comparação com a coleta seções em grades único furo. Heavy metal post coloração é mais crítica em relação a EM clássica. Desde a seção inteira é imaginada cada artefato será visível. usuários TEM normalmente têm dificuldade em mudar para um SEM, por causa da diferença na operação microscópio. Quantificação e partilha de dados - Quantificar características subcelulares é difícil em imagens EM individuais. A possibilidade de zoom in e out de grande escalaimagens permite prontamente a identificação das células de interesse, que pode ser seguido por meio de medições em nano-escala no interior das células. Estes conjuntos de dados indicam que tipos específicos de células podem ser rapidamente identificados e quantificados de forma imparcial nestas secções de tecido de grande porte, com base em características detectáveis ​​em diferentes escalas. Por exemplo microglia podem ser identificados com base na sua morfologia e citoplasma denso. Posteriormente, após zoom em células individuais, características subcelulares e moleculares em nanoescala dessas células pode ser medida dentro do mesmo conjunto de dados, como mostramos anteriormente para a largura ER dentro de uma larga escala de tecido EM cultura conjunto de dados 2. Uma vantagem adicional é que nanotomy hospedagem de conjuntos de dados de grande escala on-line irá permitir que outros para inspecionar os dados, talvez para outros recursos, e tirar suas conclusões sobre a nova hipótese. CLEM - Além de facilitar EM quantitativo, EM grande escala torna mais fácil correlacionar microsco luzrotulagem pic EM nível 8. No presente exemplo, mostra-se a presença da microglia fagocíticas num modelo de ablação do peixe-zebra. Uma questão importante em neurociência é o que as funções e as contribuições individuais são de microglia e potenciais outras fontes de fagocíticas e células do sistema imunológico. Estudos EM preliminares mostraram características subcelulares distintas de microglia na doença 18. Infelizmente, é difícil rotular selectivamente microglia em particular numa configuração patológica, uma vez que exibem grande sobreposição com outras células do sistema imunológico na expressão genética, a morfologia e função. Portanto, não é claro se a microglia e quando ao nível ultra-estrutural diferente a partir de células imunes de outras fontes, incluindo derivados de monócitos macrófagos infiltrantes. Entender se existem diferenças ultra-estruturais entre estas células irá proporcionar um ponto de partida para a análise das diferenças funcionais. Combinando marcadores transgênicos ou expressão selectiva e CLEM permite que detexão de características ultra-estruturais seletiva para populações específicas. Diagnóstico &amp; apresentação e educação - Ao visualizar nanoescala a microescala dentro de um único conjunto de dados de dados EM é muito facilitada a um público amplo. Com o aumento das possibilidades e ferramentas para a EM-larga escala correlativa e prevemos um renascimento do EM em pesquisa básica e médica. O nosso método aqui representado é aplicado a um modelo de lesão de cérebro de peixe zebra 5, mas foi usado no tecido humano 7, cérebro de rato 3, num modelo de rato de diabetes 4 e em cultura de células de 2, e também pode ser utilizado em combinação com uma ETM abordagem com base na 1 que mostra a versatilidade deste método. O operador microscópio não é mais a gravação altamente selecionada e imagens, portanto, tendenciosas, mas todos os inúmeros recursos ultra-estruturais são registrados e aberto para análise em todo o mundo.

desenvolvimentos técnicos recentes têm melhorado a versatilidade, aplicabilidade e natureza quantitativa da EM, levando a um renascimento da análise ultra-estrutural. Os avanços incluem 3D EM, em larga escala 2D EM e métodos aperfeiçoados e reagentes para microscopia de luz e microscopia eletrônica correlata (CLEM) para comparar outros modos de análise microscópica diretamente para o nível EM 8-10. Em larga escala de 2D EM é particularmente adequado para quantificar ou identificar (romance) características da doença de patologia humana, estudo de modelos animais para modelos de doença e de cultura de tecidos. Devido à pequena tipicamente campo de visão que é difícil de correlacionar as modificações em alta ampliação com uma escala larga de tecido, bem como para analisar quantitativamente unbiasedly e características ultra-estruturais. Para a análise patológica de tecido humano ou a avaliação da patologia em modelos animais, hematoxilina e eosina (H &amp; E) colorido seções de formaldeído parafina fixo incorporado (FFPE) tissue é o padrão. Além de simples H &amp; E coloração imunomarcação também é realizada para identificar anomalias patológicas. Se tais tecidos pode ser analisada ao nível EM, tipos específicos de células, e as alterações intracelulares podem ser identificados. A natureza imparcial de EM em grande escala permite encontrar características inesperadas e novos da doença. Por larga escala áreas em up a milímetros quadrados pode ser visualizado. Nós e outros anteriormente nanotomy de rato ilhotas pancreáticas 4, cultura de células 2, cérebro do rato 3, pele e mucosa 7 e toda larvas do peixe 1,5 (www.nanotomy.org) aplicada. Os peixes-zebra são altamente adequados para imagiologia in vivo, em particular para visualizar os tipos de células que são de difícil acesso, em tecidos de mamíferos, incluindo as células cerebrais imunológicas 11. Aqui o procedimento nanotomy é descrito em pormenor, aplicadas a secções coronais de cabeças de peixe-zebra submetidos à ablação condicional neuronal por conversão de metronidazol por neuronalnitro-redutase expressa (www.nanotomy.org) 5,12-14. Todos os dados brutos são apresentados como arquivos HTML com zoom, visualização molecular para mudanças de escala do tecido. A apresentação dos dados brutos permite análises imparciais sobre os conjuntos de dados de outros ângulos de especialistas em todo o mundo.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>baixo ponto de fusão agarose</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaína</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeído</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato de sódio</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianeto de potássio (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>acetato de uranila&nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>tetraborato de sódio</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>toluidene azul</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>fucsina básica</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>citrato de chumbo</td><td>BDH</td><td>descontinuado</td><td></td></tr><tr><td><forte>EPON</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenilsuccínicoácido anidrido&nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>anidrido metilnádico</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>éter glicídeo 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp;</td><td>Policiências</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>padrão plana molde de incorporação</td> Ciências <td>de Microscopia Eletrônica</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>faca de diamante</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>grades de cobre&nbsp;</td>Fita de carbono dupla face <td>da Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de varredura EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrótomo Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas gerador de varredura externa&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Oficiais</tr></tbody></table>

transmissão de digitalização em grande escala electron microscopy (nanotomy) de saudável e ofendidos zebrafish cérebro

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

microscopia em grande escala de elétrons 2D (EM), ou nanotomy, é a aplicação de todo o tecido da microscopia eletrônica de resolução nanoescala. Outros e que anteriormente aplicada EM larga escala para ilhotas pancreáticas humanas da pele, cultura de tecidos e toda larvas do peixe 1-7. Aqui nós descrevemos um método universalmente aplicável para EM digitalização escala tecido para detecção imparcial de recursos sub-celulares e moleculares. Nanotomy foi aplicado para investigar o saudável e um cérebro de peixe zebra neurodegenerativa. Nosso método é baseado em protocolos de preparação de amostra padronizados EM: fixação com glutaraldeído e ósmio, seguido por incorporação de resina de epóxi, ultrafinos de corte e montagem de ultrafinos-seções sobre grades de um furo, seguido de pós coloração com uranyl e chumbo. Em larga escala de imagens 2D em mosaico são adquiridos usando uma varredura EM conectada a um gerador de varredura ampla área externa usando EM transmissão de varredura (STEM). Grande escala imagens EM são tipicamente ~ 5 - 50 g de pixels itamanho n, e melhor visualizado usando arquivos HTML com zoom, que pode ser aberto em qualquer navegador web, semelhante a mapas HTML geográficas on-line. Este método pode ser aplicado ao tecido (ser humano), as secções transversais de animais inteiros, bem como cultura de tecidos 1-5. Aqui, os cérebros de peixe-zebra foram analisados ​​em um modelo de ablação neuronal não-invasiva. Visualiza-se dentro de um único conjunto de dados de tecidos, celular e alterações subcelulares que pode ser quantificada em vários tipos de células incluindo neurónios, macrófagos e microglia do cérebro. Além disso, nanotomy facilita a correlação de EM com microscopia de luz (CLEM) 8 no mesmo tecido, como grandes áreas de superfície trabalhada anteriormente usando microscopia de fluorescência, pode ser subsequentemente submetida a grande área de EM, resultando na nano-anatomia (nanotomy) de tecidos. Ao todo, nanotomy permite a detecção imparcial de recursos a nível EM de forma quantificável todo o tecido.

Em larga escala EM conjunto de dados de cortes coronais da cabeça de larvas de peixe-zebra de 1 semana de idade mostra muitos tecidos e características celulares na imagem em escala de um único grande (www.nanotomy.org). Nanotomy de seções do cérebro de controle revela características típicas ultra-estruturais de tecido neural do cérebro anterior rostral incluindo pacotes olfativos fibra, núcleos neuronais e neuronais sub-compartimentos incluindo sinapses (Figura 2A, www.nanotomy.org). tipos de células na cabeça que podem ser distinguidos incluem condrócitos com grandes vacúolos no maxilar inferior, mielina osmiophilic das células nervosas olfativas, células endoteliais de uma pequena embarcação, estruturas incluem a meninge (a contrapartida peixe-zebra das meninges, o encasing camada membranoso o cérebro de mamíferos). estruturas subcelulares incluem o glicocálice da epiderme, morfologias diferentes e focos nucleares em cel diferente<html> l tipos e organelas, incluindo aparelho de Golgi, retículo endoplasmático (ER), mitocôndrias e vesículas sinápticas e densidades pós-sinápticas. Inesperadamente os núcleos de células do epitélio do ventrículo são muito electrões denso comparado com outras células dispersas mais lateralmente no cérebro. Além disso, estes núcleos ventriculares mostram focos escuro que estão ausentes em outras células no cérebro e aparecem diferentes em tamanho e estrutura da heterocromatina, que se encontra nos núcleos da microglia fagocítica (Figura 2). Células que revestem o ventrículo no desenvolvimento do peixe-zebra incluem células gliais principalmente radiais e progenitores neuronais, o que pode refletir um estado de cromatina alterada do que as células mais diferenciadas. Como as células-tronco no tecido são geralmente bastante raro, nanotomy correlacionar rotulagem de tecido para marcadores de células-tronco com escala tecido EM poderia, portanto, ser usados ​​para identificar características ultra-estruturais de células-tronco. ve_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; grande escala EM (www.nanotomy.org) de uma secção coronal em uma larva de peixe-zebra submetidos à ablação neuronal revela muitos tecidos específicos, e as características moleculares e celulares que não são encontrados em animais de controlo. recursos celulares incluem microglia fagocítica e vacúolos o tamanho das células, provavelmente representando células que morrem (Figura 2B, www.nanotomy.org). eM estudos anteriores identificaram microglia em vertebrados 18,19. Aspectos característicos da microglia incluem núcleos alongados , aglomerados de cromatina irregular ao lado do envelope nuclear, aparelho de Golgi proeminente, polirribossomos livres, retículo endoplasmático granular (ER) com cisternas longa e estreita, relativamente escuro citoplasma / denso, e numerosas inclusões, tais como phagosomes, gotículas lipídicas e lisossomos. Todos estes características, atribuídas a microglia em tecidos de mamíferos, foram também encontradas nestas células em cérebros de peixe-zebra (Figura 2B, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho de tecido em larga escala Electron Microscopy em Brains Zebrafish. (A) 7 dias de idade, larva de peixe-zebra. (B) cabeças de larvas Zebrafish lado a lado embutidos em resina epóxi. Faca (C) Vidro para semi -thin seccionamento e orientando a amostra. Seção Representante cortes semifinos toluidina azul manchado mostrando dois (D) side-by-side incorporado larvas do peixe. (E) diamante faca para cortar ultrafinos seções (70 nm). (F) imagem editada em (D) da seção do cérebro de larvas de peixe-zebra inteira na grade de um buraco para indicar o posicionamento. (G) sistema de microscopia usado para grande escala 2D eM neste estudo. (H) Fluxo de processamento de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Figura 2: Nanotomy Resultados:. A partir de Macromoléculas ao tecido (A) Nanotomy de cérebros de 7 dias de controle após a fertilização e (b) tratados (ablação neuronal; Figura 1), mostrando características específicas ao neuronal ablated degenerativa do cérebro (B) Estes incluem fagocíticas microglia, células escuras submetidos a morte celular e aparência esponjosa de tecido neural ((A) e (B)). Painéis superiores (adaptado de 5): 10X visão ampliada da região indicada em painéis de média. painéis Média: vista 10X ampliada da região indicada nos painéis inferiores. (A, painel do meio) Alto ampliação de neurópilo mostrando sinapse em (A, painel inferior), vesículas sinápticas (SVS) edensidade pós-sináptica (PD). (B, painel médio) Alto ampliação de microglia amebóides ou possivelmente um macrófago (painel do meio, M) mostrando características típicas amebóides microgliais (painel inferior), incluindo aparelho de Golgi proeminente (G), inclusões incluindo vacúolos lisossomais (L). Barras de escala: 50 mm (superior), 5 m (meio) e 0,5 m (fundo). Este valor foi modificado a partir de 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a> , ou visite o on-line de dados completo (nanotomy.org).

A microscopia eletrônica 2D em larga escala (EM), ou nanotomia, é a aplicação em todo o tecido da resolução em nanoescala. Aqui descrevemos um método universal de nanotomia aplicado para investigar o cérebro larval do peixe-zebra na saúde e em lesões cerebrais não invasivas.

Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

O objetivo geral deste experimento de microscopia eletrônica em larga escala, ou nanotomia, é definir alterações do nível macromolecular ao nível tecidual, no caso de hoje, no cérebro de peixe-zebra em degeneração. A nanotomia pode ajudar a responder perguntas-chave nas ciências da vida. Por exemplo, na pesquisa sobre neurodegeneração e diabetes tipo 1.A principal vantagem da nanotomia é que informações imparciais são obtidas, abrangendo desde macromoléculas, organelas e células até tecidos. Isso permite a quantificação e o compartilhamento aberto de dados por meio do nanotomy.org. Embora a nanotomia forneça insights sobre a manutenção imunológica e a microglia no cérebro neurodegenerativo do peixe-zebra, ela também é aplicada a outros modelos de doenças, incluindo culturas celulares, camundongos e até tecidos humanos.De modo geral, os cientistas novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque a quantidade de dados é avassaladora. Isso pode ser mil vezes maior do que a obtida com microscopia eletrônica tradicional. Após fixar as larvas de peixe-zebra de acordo com o protocolo descrito no texto, corte as cabeças das larvas na região rostral ao cerebelo para facilitar a penetração do ósmio. Coloque as larvas em tetróxido de ósmio 1%, ferrocianeto de potássio 1,5%, em cacodilato de sódio 0,1 molar e incube no gelo por duas horas.Em seguida, use água destilada duas vezes para lavar os embriões três vezes, durante cinco minutos cada vez. Antes da inclusão, as amostras precisam ser desidratadas em uma série de etanol. Para incluir os embriões, após a incubação em resina epóxi diluída durante a noite de acordo com o protocolo descrito, remova a resina diluída e substitua-a por resina pura.Incube por 30 minutos, depois substitua a resina pela segunda vez e incube por mais 30 minutos. Após renovar a resina pela terceira vez, incube à temperatura ambiente por três horas. Em seguida, incube a 58 graus Celsius por 15 minutos.Por fim, incubar sob pressão reduzida à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, usar uma agulha ou palito para orientar as cabeças em moldes de inclusão planos de silicone disponíveis comercialmente. Depois, polimerizar a resina epóxi a 58 graus Celsius durante a noite.Quando o espécime estiver completamente endurecido, use lâminas de barbear para remover o excesso de resina do suporte. Para detectar o posicionamento correto, utilize uma faca de vidro ou uma faca histológica de diamante em um ultramicrótomo para cortar seções semifinas das larvas para azul de toluidina/fucsina básica. Transfira as seções semifinas para lâminas de microscopia pegando-as com uma pipeta de vidro de Pasteur cuja ponta tenha sido fechada por fusão em uma chama.Seque em uma placa aquecedora até que não reste água. Em seguida, coloque as amostras em azul de toluidina 1% em água e incube as seções em uma placa aquecedora por 10 segundos para corar. Depois, após lavar as seções com água, use fucsina básica 0,5% em tetraborato de sódio 1% para corar as amostras por mais 10 segundos.Com um microscópio óptico com aumento de 10X a 40X, examine as amostras. Quando o local ou orientação adequados forem alcançados, utilize estruturas anatômicas facilmente identificáveis, como as fossas olfativas, olhos ou limites entre substância cinzenta e branca, para identificar a região cerebral de interesse durante o corte ultrafino e para ajustar o ângulo de corte quando a amostra estiver inclinada. Continue cortando o bloco de resina epóxi com uma lâmina de diamante para obter cortes ultrafinos de 70 nanômetros.Monte cada seção em uma grade de cobre com código de barras do tipo L2 por 1 ranhura única para permitir a aquisição sem interrupção pelas barras da grade. Um milímetro quadrado pode parecer pequeno. Caberá exatamente na abertura.Dessa forma, evitamos que as barras da grade bloqueiem nossa amostra. Perceba que todos os artefatos introduzidos em nossa amostra serão registrados, diferentemente da microscopia eletrônica tradicional. Contraste as amostras com metais pesados conforme o protocolo descrito no texto e armazene-as em uma caixa de grades. Para montar a amostra no microscópio eletrônico de varredura, ou MEV, coloque a grade da caixa de transferência, com o corte, no suporte múltiplo de grades para amostras e transfira-o para a câmara do MEV.Após alinhar o detector de acordo com o protocolo descrito, pré-irradie a amostra diminuindo o zoom para que toda a área a ser escaneada caiba na janela da imagem. Uma vez que a abertura tiver sido alterada para 120 micrômetros e a imagem desfocada, use a opção de escaneamento de área reduzida para tornar a área escaneada o mais ajustada possível. Em seguida, configure a taxa de quadros para escanear o quadro em aproximadamente um a dois segundos.Em seguida, aumente o zoom em pelo menos 100X e escaneie uma pequena área por 10 segundos. Se o brilho na área ainda mudar, continue a pré-irradiação. Quando esta área não apresentar alteração no brilho em comparação com suas redondezas, a pré-irradiação estará suficiente.Enquanto estiver em foco, selecione a área ou característica mais clara e ajuste a velocidade de varredura para que os detalhes sejam visíveis. No software do microscópio, ajuste o brilho e o contraste observando cuidadosamente o histograma, mantendo todos os pixels dentro da faixa dinâmica. Faça o mesmo para as áreas e características mais escuras.Volte para a área clara e verifique novamente para que haja espaço em ambos os lados do histograma. Para os passos quatro seis a quatro oito, o ajuste de brilho e contraste deve ser feito com muito cuidado, de modo que toda a área esteja dentro da faixa dinâmica. Reduza o zoom para que a área completa a ser escaneada caiba na janela de imagem e inicie o programa de aquisição de grande área.Em seguida, use a opção assistente para configurar um mosaico, selecionando uma área da tela. Utilize um tamanho de pixel entre dois e cinco nanômetros, dependendo dos detalhes necessários, e defina um tempo de permanência de três microssegundos para microscopia eletrônica de transmissão com varredura, ou STEM. Pressione otimizar para verificar as configurações do microscópio e o tempo necessário será exibido.Em seguida, ligue novamente o gerador de varredura externo e pressione continuar. Para analisar os dados de MEV, abra um programa visualizador de arquivos de microscopia eletrônica em larga escala e abra o arquivo chamado informações do mosaico, que abrirá os arquivos tif em mosaico. Escolha a opção Montar Automaticamente Todo o Mosaico e selecione os seguintes parâmetros: modo de sobreposição igual a metade, limite de montagem igual a 0,90 e redução de ruído igual a automática.Se os critérios de montagem não puderem ser cumpridos, aumente o zoom e posicione manualmente o quadro no lugar desejado e clique em Continuar Assim. Exporte os dados como um arquivo HTML ou como um único arquivo tif. Inclua o tamanho final do pixel e o nome do arquivo para permitir medições posteriores e, em seguida, analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Como mostrado aqui, a nanotomia de seções cerebrais controle revela características ultraestruturais típicas do tecido neural do prosencéfalo rostral, incluindo feixes de fibras olfativas, núcleos neuronais e subcompartimentos neuronais, incluindo sinapses.Aqui, estruturas subcelulares incluem diferentes morfologias nucleares e focos em diversos tipos celulares e organelas, como o complexo de Golgi, retículo endoplasmatico, mitocôndrias, vesículas sinápticas e densidades pós-sinápticas. Inesperadamente, os núcleos das células que revestem o ventrículo são muito densos ao elétron em comparação com outras células dispersas mais lateralmente no cérebro. Nas micróglias, os núcleos também apresentam focos escuros, possivelmente heterocromatina, que estão ausentes em outras células do cérebro.Esta imagem de uma microscopia eletrônica em larga escala de uma seção coronal de uma larva de peixe-zebra submetida à ablação neuronal revela micróglias fagocíticas. Características típicas de micróglias em células de mamíferos também foram encontradas nessas células, incluindo aparelho de Golgi proeminente e numerosas inclusões, como lisossomos. Após dominar a técnica, a aquisição pode ser realizada em um dia, enquanto a microscopia eletrônica tradicional levará pelo menos uma semana.Ao realizar este procedimento, é importante que o operador do microscópio desempenhe um papel crucial na obtenção de imagens de alta qualidade. Esta não é apenas uma técnica de apertar um botão. Atualmente, aplicamos a nanotomia não somente ao modelo de degeneração neural em peixe-zebra, mas também para a imunomarcação de células e para o estudo de tecidos de moscas, tecidos humanos e outros.Essa técnica abre caminho para pesquisadores de qualquer área. Eles podem revisitar os conjuntos de dados on-line em nanotomy.org. Em seguida, podem explorar alterações putativas, que variam desde a escala de nanômetro até a escala de milímetro, em todos os modelos estudados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar a nanotomia à sua questão de pesquisa e ao sistema celular ou tecidual que está investigando. Não se esqueça: apenas um profissional deveria realizar a preparação de amostras devido aos reagentes tóxicos e às considerações éticas, mas qualquer pessoa pode experimentar o site nanotomy.org em casa.

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Research

JoVE Journal

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