Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

O objetivo geral desta microscopia eletrônica em larga escala ou um experimento de nanotomia é definir alternâncias do nível macromolecular para o nível do tecido, no caso de hoje, no cérebro degenerado do peixe-zebra. A nanotomia pode ajudar a responder a questões-chave nas ciências da vida. Por exemplo, na neurodegeneração e na pesquisa do diabetes tipo 1.

A principal vantagem da nanotomia é que informações imparciais são adquiridas, variando de macromoléculas, organelas, células a tecidos. Isso permite a quantificação e o compartilhamento de dados de acesso aberto via nanotomy.org. Embora a nanotomia forneça informações sobre a manutenção imunológica e a microglia no cérebro neurodegenerativo do peixe-zebra, ela também é aplicada a outros modelos de doenças, incluindo cultura de células, camundongos e até tecidos humanos.

Geralmente, os cientistas novos nessa técnica lutam porque a quantidade de dados é esmagadora. Isso pode ser mil vezes mais do que o obtido com o EM tradicional. Depois de fixar as larvas de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, corte as cabeças das larvas rostralmente ao rombencéfalo para facilitar a penetração do ósmio. Coloque as larvas em tetróxido de ósmio a 1%, ferrocianeto de potássio a 1,5%, em cacodilato de sódio a 0,1 molar e incube no gelo por duas horas.

Em seguida, use água bidestilada para enxaguar os embriões três vezes por cinco minutos de cada vez. Antes da incorporação, as amostras precisam ser desidratadas em uma série de etanol. Para embutir os embriões, após incubação em resina epóxi diluída durante a noite de acordo com o protocolo de texto, remova a resina diluída e use resina pura para substituí-la.

Incube por 30 minutos, depois substitua a resina uma segunda vez e incube por mais 30 minutos. Depois de refrescar a resina pela terceira vez, incubar à temperatura ambiente durante três horas. Em seguida, incube a 58 graus Celsius por 15 minutos.

Finalmente, incube sob baixa pressão em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use uma agulha ou palito de dente para orientar as cabeças em moldes de incorporação plana de silicone disponíveis comercialmente. Em seguida, polimerize a resina epóxi a 58 graus Celsius durante a noite.

Quando a amostra estiver totalmente endurecida, use lâminas de barbear para aparar o excesso de resina do toco. Para detectar o posicionamento correto, use uma faca de vidro ou uma histofaca de diamante em um ultramicrótomo para cortar seções de larvas semifinas para azul de toluidina / fucsina básica. Transferir as secções semifinas para lâminas microscópicas, recolhendo-as com uma pipeta de vidro Pasteur cuja ponta foi fechada por fusão em chama.

Seque em uma chapa quente até que não haja mais água. Em seguida, coloque as amostras em azul de toluidina a 1% em água e incube as seções em uma placa quente por 10 segundos para corá-las. Em seguida, depois de usar água para enxaguar as seções, use 05% de fucsina básica em tetraborato de sódio a 1% para corar as amostras por mais 10 segundos.

Com um microscópio de luz normal de 10X a 40X, examine as amostras. Quando o local ou orientação adequada for alcançado, use estruturas anatômicas facilmente identificáveis, incluindo fossas olfativas, olhos ou limites de substância cinza-esbranquiçada, para identificar a região cerebral de interesse durante a secção ultrafina e para ajustar o ângulo de secção quando a amostra for inclinada. Continue seccionando o bloco de resina epóxi com uma faca de diamante para cortar seções ultrafinas de 70 nanômetros.

Monte cada seção em uma única grade de cobre com código de barras L2 por 1 forma para permitir a aquisição ininterrupta por barras de grade. Um milímetro quadrado pode parecer pequeno. Ele só vai caber na abertura.

Dessa forma, evitamos que as barras de grade bloqueiem nossa amostra. Perceba que todos os artefatos introduzidos em nossa amostra serão registrados em comparação com o EM tradicional. Compare as amostras com metais pesados de acordo com o protocolo de texto e armazene em uma caixa de grade. Para montar a amostra no microscópio eletrônico de varredura, ou SEM, coloque a grade da caixa de transferência com a seção no suporte de amostra de grade múltipla e transfira-a para a câmara do SEM.

Depois de alinhar o detector de acordo com o protocolo de texto, pré-irradie a amostra diminuindo o zoom para que toda a área a ser digitalizada se ajuste à janela da imagem. Depois que a abertura for alterada para 120 micrômetros e a imagem for desfocada, use a opção de varredura de área reduzida para tornar a área digitalizada o mais apertada possível. Em seguida, defina a taxa de quadros para verificar o quadro em aproximadamente um a dois segundos.

Em seguida, aumente o zoom em pelo menos 100X e escaneie uma pequena área por 10 segundos. Se o brilho na área ainda mudar, continue a pré-irradiação. Quando esta área não muda de brilho em comparação com o ambiente, a pré-irradiação é suficiente.

Enquanto estiver focado, selecione a área ou recurso mais claro e defina a velocidade de digitalização para que os detalhes fiquem visíveis. No software do microscópio, ajuste o brilho e o contraste observando cuidadosamente o histograma para manter todos os pixels na faixa dinâmica. Faça o mesmo para as áreas e recursos mais escuros.

Volte para a área clara e verifique novamente para que haja algum espaço em ambos os lados do histograma. Para as etapas quatro seis a quatro oito, o ajuste do brilho e contraste deve ser feito com muito cuidado para que toda a área esteja dentro da faixa dinâmica. Diminua o zoom para que toda a área a ser digitalizada caiba na janela de imaginação e inicie o programa de aquisição de grandes áreas.

Em seguida, use a opção do assistente para configurar um mosaico selecionando uma área na tela. Use um tamanho de pixel de dois a cinco nanômetros, dependendo de quais detalhes são necessários, e defina um tempo de permanência de três microssegundos para microscopia eletrônica de transmissão de varredura, ou STEM. Pressione otimizar para verificar as configurações do microscópio e o tempo necessário será exibido.

Em seguida, ligue o gerador de varredura externo novamente e pressione continuar. Para analisar os dados STEM, abra um programa visualizador de arquivos EM em grande escala e abra o arquivo chamado mosaic info, que abrirá os arquivos tif lado a lado. Escolha a opção Auto Stitch Entire Mosaic e escolha os seguintes parâmetros: o modo de sobreposição é igual à metade, o limite de costura é igual a 0,90 e a redução de ruído é igual a automática.

Se os critérios de costura não puderem ser atendidos, amplie e coloque manualmente o bloco na posição e clique em Continuar como está.Exporte os dados como um arquivo HTML ou como um único tif. Inclua o tamanho final do pixel e o nome do arquivo para permitir medições posteriores e, em seguida, analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, a nanotomia de seções cerebrais de controle revela características ultraestruturais típicas do tecido neural do prosencéfalo rostral, incluindo feixes de fibras olfativas, núcleos neuronais e subcompartimentos neuronais, incluindo sinapses.

Aqui, as estruturas subcelulares incluem diferentes morfologias e focos nucleares em diferentes tipos de células e organelas, incluindo aparelho de Golgi, retículo endoplasmático, mitocôndrias, vesículas sinápticas e densidades pós-sinápticas. Inesperadamente, os núcleos das células que revestem o ventrículo são muito densos em elétrons em comparação com outras células dispersas mais lateralmente no cérebro. Na microglia, os núcleos também mostram focos escuros, possivelmente heterocromatina, que estão ausentes em outras células do cérebro.

Esta imagem de um EM em grande escala de uma seção coronal em uma larva de peixe-zebra submetida a ablação neuronal revela micróglia fagocítica. Características características da microglia em células de mamíferos também foram encontradas nessas células, incluindo o proeminente aparelho de Golgi e numerosas inclusões, como lisossomos. Uma vez dominada, a aquisição pode ser feita em um dia, onde o EM tradicional custará pelo menos uma semana.

Ao tentar este procedimento, é importante que um operador de microscópio desempenhe um papel crucial na obtenção de imagens de alta qualidade. Esta não é apenas uma técnica de apertar um botão. Agora aplicamos a nanotomia não apenas ao modelo de degeneração neural do peixe-zebra, mas também a usamos para a imunomarcação de células e para estudar tecidos de moscas, tecidos humanos e muito mais.

Essa técnica abre caminho para qualquer pesquisador em qualquer campo. Eles podem revisitar os conjuntos de dados online no nanotomy.org. Eles podem então explorar supostas alterações, variando da escala nanométrica à milimétrica e todos os modelos estudados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar a nanotomia à sua questão de pesquisa e ao sistema celular ou tecidual que está investigando. Não se esqueça, apenas um profissional deve fazer a preparação da amostra por causa dos reagentes tóxicos e da consideração ética, mas todos podem experimentar a nanotomia do site. org em casa.