Name: Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a dissecar hipófises de camundongos em desenvolvimento e preparar secções coronais com arquitetura tecidual preservada. Este método permite estudar histologia, diferenciação celular e apoptose em neurociência e biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (31201086, 31470759 e 31671219) e a Fundação de ciência Natural de Shanghai (12ZR1436900).

camundongos C57BL/6 são criados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. Todos os métodos experimentais animais estejam em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de ética na Universidade de medicina militar de segundo e cuidado Animal.
 1. dissecação de pós-natal desenvolvendo hipófise <ol><li>realizar anestesia: Coloque gelo picado para induzir hipotermia neonatais ratos (P0 - P5). Para os ratos mais de 5 dias de idade, injete intraperitonealmente uretano 5% (30 µ l/g de peso corporal) para induzir anestesia. Avalie respostas para toe cauda pitadas. Prossiga somente depois que o mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.</li>
	<li>Segura o mouse na posição supina (deitado na parte de trás com face para cima) gravando suavemente as dianteiras e composto para uma superfície de trabalho que é capaz de ser fixado (ou seja, isopor) dentro de uma coifa química.</li>
	<li>Executar a perfusão transcardial.
	<ol><li>Cortar a caixa torácica de rato com uma tesoura cirúrgica para expor o coração (e outros órgãos torácicos).</li>
		<li>Segura o coração a bater com fórceps rombudo e insira uma agulha 26G (0,45 mm) no ventrículo esquerdo. A agulha está ligada a uma seringa de 10 mL, preenchida com solução salina heparinizada tamponada de fosfato (PBS; suplementado com nitrito de sódio 5 mg/mL e 10 U/mL heparina, pH 7,4, aquecer a 37 ° C antes do uso). Imediatamente cortar o átrio direito com uma tesoura bem e começam a perfundir o corpo com o PBS quente até o fluido sair do átrio direito é claro. 
		Nota: Aproximado de 5-10 mL de PBS é necessária para os ratos Neonatais e 10-20 mL de solução Isotónica de ratos adultos.</li>
		<li>Manter a agulha no lugar e mudar para outra seringa preenchida com paraformaldeído 4% (PFA; pH 7,4). Perfundir 10 mL e 20 mL de fixador para neonatal e P21 mouse, respectivamente. 
		Atenção: O PFA é tóxico. Pode causar irritações respiratórias, pele e lesões oculares. Use luvas e trabalhar sob uma capa química.</li>
	</ol></li> <li>Decapitar o mouse PFA-fixo e abriram o osso do crânio com uma tesoura.
	<ol><li>, Levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio com uma pequena pinça. Ao primeiro sinal da Sela túrcica, paragem de levantamento, mas mantenha o rombencéfalo, cortar a haste hipofisária e fibras nervosas conectando à base do cérebro com uma tesoura bem. Esta etapa é fundamental para garantir que a hipófise não é levantada longe com o cérebro.</li>
		<li>, Então, continuar levantando o cérebro e remover o cérebro inteiro para expor a glândula pituitária totalmente. Cortar a região toda sella, incluindo a glândula pituitária, laterais nervos trigêmeo e as por baixo do osso esfenoide com tesoura (aproximadamente 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>Colocar o tecido dissecado em um prato de 35mm ou um bem de uma placa de 6 contendo 2 mL frio 4% PFA (pH 7,4). Fixar o tecido a 4 ° C por 40 min para P0 - P7 pituitaries, 1h para P14 pituitaries, 1,5 h para P21 - P28 pituitaries e 3h para adultos pituitaries.</li>
	<li>Outras dissociação da hipófise <ol><li>lava o tecido fixo com 10 mL de PBS, 5 mudanças, 15 min cada. A glândula pituitária neonatal juntamente com seus tecidos circundantes e o abaixo do osso esfenoide podem ser processados diretamente à desidratação. No entanto, as glândulas pituitárias de ratos mais de 5 dias deve ser dissociadas mais sob um microscópio estéreo.</li>
		<li>Colocar o tecido fixo em um prato de 35 mm, contendo 1 mL de PBS. Para P5 - P14 pituitaries, retire as membranas conectivos entre os nervos e os ossos com pinça fina e tesoura e isolar cuidadosamente a glândula pituitária, juntamente com nervos laterais do trigêmeo como um todo, mas deixando a Sela túrcica. A glândula isolada e os nervos estão ligados por membranas conjuntivo com uma &#34; H &#34;-como a aparência ( figura 1B).</li>
		Pituitaries de <li>para P21 e adulto, remova os nervos e membranas conectivos ao redor a hipófise e livre a glândula os tecidos circundantes. O tecido da hipófise, enrole com papel de tecido de limpeza de lentes e colocá-lo dentro de um estojo de encastre. 
		Nota: A hipófise minúscula de embrulho com papel de tecido de limpeza de lentes ajuda a evitar qualquer possível perda de espécimes e preservar a integridade do tecido o seguinte procedimento de incorporação de parafina. Pode não ser necessário embrulhar a hipófise se é processado em uma pequena garrafa no procedimento cryo-incorporação.</li>
	</ol></li></ol> 2. Incorporação e Set Sectioning de parafina <ol><li>desidratar os espécimes em incorporação cassettes com soluções de etanol 50%, 65%, 75% e 95% por 15 min cada. Posteriormente desidrate com 3 alterações de etanol puro, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Claro com xileno, 3 mudanças, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Infiltrar-se com cera de parafina derretida, 3 alterações, 7 min cada para P0 - P4 glândulas, e 8 min duas vezes seguido por 6 min uma vez para P5 e glândulas mais velhas. 
	Nota: Os parâmetros ideais para processamento do tecido podem ser empiricamente ajustados. Para obter as seções de alta qualidade, desidratação insuficiente ou superior deve ser evitada. O mesmo é verdadeiro para limpar o tecido usando xileno.</li>
	<li>Orientação ao incorporar <ol><li>sobre um tecido de incorporar o sistema do console, retirar a amostra da gaveta e colocá-lo em um molde base half-filled com cera de parafina derretida. Orientação adequada da glândula pituitária de encastre é essencial para satisfazer secções coronais.</li>
		<li>Para P21 e adulto as glândulas pituitárias, posicione a glândula pituitária, com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde base (o plano de corte). Use esfenoide ossos e nervos trigêmeo como pontos de referência anatômicos para P0 - P4 e P5 - P14 pituitaries, respectivamente. Orientar os espécimes com seus nervos trigêmeo ou lâmina transversal dos ossos esfenoide perpendiculares à superfície inferior de um molde base.</li>
		<li>Pressione cuidadosamente o tecido na posição desejada com a pinça bem aquecida até que a cera se torne semi-sólido em uma placa de resfriamento. Encha o molde com cera de parafina derretida. Permitir que o bloco de parafina esfriar até que a cera é totalmente solidificada. 
		Nota: A hipófise no dia embrionário 18,5 (E18.5) pode ser tratada da mesma forma como a hipófise neonatal. Mas os pituitaries (Rathke &#39; malotes s) mais jovem que E16.5 deve ser encaixado com a cabeça inteira e orientada com o eixo sagital (da boca ao occipício) perpendicular à superfície inferior de um molde base.</li>
	</ol></li> <li>Chill o bloco de parafina a-20 ° C por 10-20 min e depois cortá-la em finas fatias (4 µm de espessura é preferencial) com um micrótomo. Para obter secções coronais satisfatórias, ajuste a posição dos blocos de parafina durante o corte. Montar as fatias de tecido em lâminas de vidro revestido polylysine para evitar o desprendimento de fatias nos procedimentos a seguir. 
	Nota: Alternativamente, as amostras podem ser desidratadas em 15%, 30% (P/V) de soluções de sacarose (em PBS) a 4 ° C até que eles descem para o fundo, incorporado em crio-incorporação composto usando o mesmo método de orientação e rapidamente congelado em gelo seco. Os blocos de tecido congelado corte em fatias de 8-10 µm usando um criostato. A morfologia da cryo-seções, no entanto, é muitas vezes inferior a secções de parafina.</li>
</ol> 3. H &#38; E coloração e imunofluorescência rotulagem <ol><li>quente os slides em um calor bloqueiam a 55 ° C e dewax com xilol, 2 trocas, 4 min. Desidrate as amostras com o dobro de etanol a 95% e 75% de etanol duas vezes, 3 min cada. Lave os slides com água destilada por 5 min num agitador.</li>
	<li>Para H &#38; E mancha, mancha as seções na solução de alúmen hematoxilina por 6 min, enxaguar em runnágua da torneira ing por 2 min, diferenciar-se com água de amônia de 0,2% para 45 s e re-enxaguar em água corrente por 2 min. Então desidrata-se as seções com etanol a 95% por 1 min e mancha com eosina por 2 min. sequencialmente desidratam, limpar e montagem.</li>
	<li>Imunofluorescência rotulagem <ol><li>trata as seções com metanol contendo 3% H 2 O 2 e 0,01% NaN 3 por 20 min em temperatura ambiente para inactivar peroxidases endógenas. Recuperar a antígenos por ebulição seções no buffer de recuperação (EDTA 1 mM e 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) em uma panela de pressão por 2 min. Incubar as secções com tampão de bloqueio (5% de soro de cabra em PBS) por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar seções com anticorpo anti-hormônio (GH) (1:2, 000) ou anticorpo proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) (1:2, 000), diluídas em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Seções com anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-HRP, 1: 300 em tampão de bloqueio), incubar durante 35 minutos a 37 ° C.</li>
		<li>Amplificar os sinais usando Biotinyl Tyramide (01:50 em solução salina tamponada de Tris contendo 0,3% H 2 O 2) durante 15 minutos à temperatura ambiente e Visualizar com Streptavidin-Alexa594 ou 488 (1: 300 no bloqueio de buffer, 30 min, a 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain os núcleos com DAPI (50 mg/L em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente. 
		Nota: Pode não ser necessário amplificar o sinal usando o sistema de amplificação de sinal de Tyramide (TSA). Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado fluorescência pode ser usado para visualizar o sinal.</li>
	</ol></li> <li>Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência equipado com DAPI, Texas Red e conjuntos de filtros FITC, × 4/0,13 × 40/0.75 objectivos e câmera de 5.0 megapixel. Use o 360, 488 e 594 nm laser comprimentos de onda para imagiologia DAPI, Alexa 488 - e seções manchadas de 594 Alexa, respectivamente. Otimizar a potência do laser (0.8 foi usado geralmente) e tempo de exposição para os níveis desejados para cada canal. Capturar a imagem sob o controle do software de aquisição de imagem e sobrepor as imagens de fluorescência posteriormente usando o software de processamento de imagem.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mostrar anterior, ...

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ' dois-em-um ' da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio3,4,5.
A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto10, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.
Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Ferramentas/Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica-reta</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Tesoura fina-esticar</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Pinça sem corte</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>para isolamento da agulha pituitária</td></tr><tr><td>26G (0,45 mm)</td><td>HongDa</td><td></td><td>para perfusão transcárdica</td></tr><tr><td>Seringa (1 mL)</td> <td>BD</td><td>300841</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Seringa (10 mL)</td> <td>BD</td><td></td><td>pode ser comprada de outros fornecedores Prato</td></tr><tr>de<td>35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Papel para limpeza de lentes</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores Microscópio</td></tr><tr><td>anatômico</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores</td></tr><tr><td>de embutir</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores Sistema</td></tr> de <tr><td>console de embutir lenços de papel</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Lâminas Superfrost-Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td><forte>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>uretano</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de heparina sódica</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>para perfusão salina</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>para H & Coloração E</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>para H & Hormônio</td></tr> <tr><td>nacional</td><td></td><td>anti-crescimento de coelho de coloração E (GH)</td> <td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>de anticorpo</td><td>Hituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFAP de coelho anti-rato</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>de cabra anti-coelho IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>Sistema TSA</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>para imunocoloração</td></tr></tbody></table>

dissecação e preparação coronal fatia de desenvolver mouse hipófise

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.
O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.

Este protocolo apresenta um método para dissecar as glândulas pituitárias de desenvolver ratos. Para o mouse neonatal, as regiões de sella inteira que contém a glândula pituitária, os nervos trigêmeo e parte de baixo osso esfenoide foram dissecados para fora da base do crânio. A glândula pituitária pequena e delicada permaneceu intacta durante o processo (figura 1A). Para os ratos mais de 5 dias, as glândulas pituitária anexadas aos nervos trigêmeo laterais f...

Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

O objetivo geral deste procedimento é obter cortes coronais hipofisários adequados com arquiteturas de tecido bem preservadas de camundongos em desenvolvimento. Este procedimento pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento hipofisário, como histologia hipofisária, diferenciação celular, proliferação e apoptose. A principal vantagem dessa técnica é que as hipófises murinas em desenvolvimento podem ser dissecadas sem danos visíveis e devidamente orientadas para a obtenção de cortes coronais.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobrimos que, para o desenvolvimento de hipófise murina, era tecnicamente difícil obter cortes coronais adequados. Depois de anestesiar e fixar os ratos de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura para cortar o osso do crânio. Em seguida, com uma pinça, levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio.Então, ao primeiro sinal da sela túrcica, pare de levantar, mas segure o rombencéfalo e use uma tesoura fina para cortar o pedúnculo da hipófise e as fibras nervosas conectadas à base do cérebro. Continue a levantar e remover todo o cérebro para expor totalmente a glândula pituitária. A glândula pituitária repousa sobre a superfície dorsal do osso esfenoidal e é circundada lateralmente pelos nervos trigêmeos.Em seguida, use uma tesoura para cortar toda a região selar, incluindo a glândula pituitária, os nervos trigêmeos laterais e abaixo do osso esfenóide. Coloque o tecido em uma placa de 35 mm contendo 4% de PFA e incube-o a 4 graus Celsius por 40 minutos a 3 horas, dependendo da idade. Em seguida, use 10 mL de PBS para lavar o tecido fixo por cinco trocas em 15 minutos cada.Transfira o tecido fixo para uma placa de 35 mm contendo 1 mL de PBS e, sob um microscópio estéreo, dissocie as glândulas pituitárias. Para as hipófises P5 a P14, com pinças finas e tesouras, remova as membranas conjuntivas entre os nervos e o osso e isole cuidadosamente a glândula pituitária junto com os nervos trigêmeos laterais como um todo, mas deixando a sela túrcica. Para P21 e hipófise adulta, remova os nervos e as membranas conjuntivas ao redor da hipófise e liberte a glândula dos tecidos circundantes.Após a desidratação, limpeza de xileno e infiltração de cera realizada de acordo com o protocolo de texto, em um sistema de console de incorporação de tecido, remova a amostra do e coloque-a em um molde de base preenchido até a metade com cera de parafina derretida. Para glândulas pituitárias P21 e adultas, use pinças finas aquecidas para posicionar a glândula pituitária com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde de base. Para hipófises P0 a P4, oriente as amostras com seus ossos esfenóides perpendiculares à superfície inferior de um molde de base.Para glândulas pituitárias P5 a P14, oriente as amostras com seus nervos trigêmeos perpendiculares à superfície inferior de um molde de base. Depois de posicionar a glândula, use uma pinça fina aquecida para manter suavemente o tecido na posição desejada até que a cera se torne semi-sólida em uma placa de resfriamento. Complete o molde com cera de parafina derretida.Deixe o bloco de parafina esfriar até que a cera esteja totalmente solidificada. Resfrie o bloco de parafina a menos 20 graus Celsius por 10 a 20 minutos e, em seguida, use um micrótomo para cortá-lo em fatias finas, ajustando a posição do bloco de parafina durante o corte. Realizar a imunomarcação de acordo com o protocolo de texto.Como mostrado aqui, para dissecar a glândula pituitária do camundongo neonatal, toda a região selar contendo a glândula pituitária, os nervos trigêmeos e o osso esfenóide abaixo foram dissecados da base do crânio. A minúscula e delicada glândula pituitária permaneceu intacta durante o processo. Para camundongos com mais de cinco dias, as glândulas pituitárias ligadas aos nervos laterais do trigêmeo foram isoladas.A estrutura de crescimento da glândula pituitária isolada do camundongo P7 foi bem preservada. Aqui, a glândula pituitária do camundongo P21 foi isolada com sucesso sem danos visíveis durante a remoção do tecido circundante. Nesta figura, a coloração H & E de cortes coronais adequadamente orientados demonstra morfologia bem preservada da adeno-hipófise e da neuro-hipófise nas glândulas pituitárias P0, P7 e P21.Por fim, as lâminas processadas também foram compatíveis com a marcação por imunofluorescência. Como exemplo, a adeno-hipófise e a neuro-hipófise apresentaram imunomarcação específica de GH e GFAP, respectivamente. Uma vez dominado, o processo de dissecção à incorporação pode ser feito em 7,5 horas em camundongos adultos e ainda menos em camundongos mais jovens, se for realizado corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de dissecar toda a região selar para evitar tocar a glândula pituitária com quaisquer ferramentas cirúrgicas. Seguindo este procedimento, a hipófise que não foi prefixada também pode ser isolada. Nesse caso, deve-se ter mais cuidado para evitar danos indesejados.A glândula também deve ser dissecada o mais rápido possível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar as glândulas pituitárias de camundongos e preparar seções coronais hipofisárias em diferentes estágios de desenvolvimento.

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

O vídeo demonstra a preparação de fatias de cérebro colículo-tálamo-cortical de cérebros de filhotes de camundongos. Um cérebro isolado é alinhado em uma lâmina marcada e cortado em um ângulo para alinhar o mesencéfalo auditivo e o prosencéfalo no mesmo plano. O cérebro é então cortado usando um vibratome, e as fatias contendo as principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo são transferidas para uma câmara de retenção para preservação.

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Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

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Um tumor cerebral / Slice organotípicas Co-cultura Sistema de Estudos de Tumor Microenvironment e alvejado droga Terapias

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Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

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