Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

O objetivo geral deste procedimento é preparar sinaps translacionalmente ativas para zonas neurológicas do córtex cerebral de camundongos, usando um gradiente de densidade de sacarose peral descontínuo. Isso é feito primeiro coletando e homogeneizando os córtices de camundongo e, em seguida, centrifugando o homogeneizado. Em seguida, aplicar o homogeneizado da centrífuga ou o estimulante ao relatório por gradientes de cosacarose.

A etapa final é centrifugar e coletar a fração do sinaptossomo. Em última análise, a análise de western blot e os experimentos de incorporação de metionina S 35 mostram que a fração do sinaptossomo é sinapticamente enriquecida e translacionalmente ativa. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como centrifugação e filtração, nosso primeiro dano mecânico é evitado utilizando gradientes de densidade e o segundo por chamada tem baixa toxicidade para as células em seus constituintes.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades com esse protocolo porque o tempo desempenha um papel fundamental. Uma vez que os cortis tenham sido colhidos, o procedimento deve ser concluído rapidamente. Para iniciar o procedimento, prepare as camadas de gradiente de 3, 10, 15 e 23% adicionando as respectivas quantidades de SIP conforme descrito no manuscrito que acompanha ao tampão GM e misture bem.

Despeje camadas de gradiente pipetando dois mililitros de cada uma das 23 soluções de 15, 10 e 3% de perol isosmótico nos tubos de centrífuga Beckman com tampas. Usando uma pipeta P 1000, a interface entre as camadas deve ser claramente discernível, sem mistura das camadas. Armazene os gradientes de quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos antes de usar.

Antes de iniciar este procedimento, prepare outras soluções necessárias, conforme descrito no manuscrito anexo. Eutanasiar o camundongo com a idade de P 13 a P 21 e prepará-lo para a dissecação borrifando a nuca e a cabeça com etanol a 70%. Em seguida, use uma tesoura afiada para cortar a medula espinhal na base do crânio.

Em seguida, remova a pele do topo do crânio. Corte o crânio lateralmente entre o osso parietal e o osso interparietal, ou entre as regiões do cérebro e do córtex. Depois disso, corte o crânio da base ao nariz ao longo da sutura sagital.

Nesta etapa, remova cuidadosamente o osso parietal mole, puxando cada hemisfério para o lado. Depois disso, insira a espátula no cérebro acima do cerebelo para retirar o córtex. Coloque-o em tampão GM gelado e repita os procedimentos novamente para coletar mais córtices.

Agora enxágue os córtices em tampão GM gelado. Em seguida, transfira dois córtices para um homogeneizador de vidro contendo cinco mililitros de tampão GM frio. Homogeneizar suavemente os córtices com cinco a 10 pinceladas de pilão A, o pilão solto seguido de cinco a 10 pinceladas de pilão B, o pilão tipo.

O número de golpes varia de acordo com o homogeneizador individual. Transferir o homogeneizado para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugue-o 1000 vezes.

Gravidade por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga Allegra seis KR para pellet detritos celulares e núcleos. Coloque dois mililitros de supinato para cada gradiente per ou de sacarose com um gradiente para cada córtex inteiro e tampe os tubos. Em seguida, centrifugue-os em um rotor de ângulo fixo a 32.500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga Beckman J 2 21.

Usando adaptadores apropriados quando concluído, o gradiente deve fornecer uma pipeta de banda SN forte e descartar a solução acima da banda SN. Usando uma pipeta de macarrão de vidro pipetas fora da banda SN na interface de 15 a 23%, um gradiente geralmente dá cerca de 0,9 a 1,1 mililitros de sns. Depois disso, transfira para um tubo cônico e guarde no gelo.

Em seguida, ajuste a concentração de sal do SNS adicionando um 10º volume de 10 vezes o tampão de estimulação. Opcionalmente, adicione 1000 vezes cloreto de cálcio para obter uma concentração final de 12 anos molar. Em seguida, adicione um estoque TTX milimolar para dar uma concentração final de um micromolar para suprimir a excitação não específica.

O próximo passo é usar o SNS na aplicação downstream aplicável, como estudos de tradução de proteínas. Para outras aplicações, o lisado de SN pode ser limpo ou concentrado usando o kit de preparação de amostra de página Pierce SDS. A concentração de proteína do SNS pode ser determinada usando o kit de ensaio de proteína micro BCA.

Aqui está um exemplo de seis bandas ou frações. Quando o córtex de camundongo foi homogeneizado e separado em gradientes descontínuos de perol sacarose, os SNS enriquecidos foram contidos na Banda cinco na interface de 23 a 15%, esta banda foi removida e examinada por microscopia eletrônica. Um exemplo de vesículas sinápticas intactas e a preservação de elementos pré-sinápticos e pós-sinápticos são mostrados aqui no western blot.

Um aumento nos marcadores sinápticos e uma diminuição nas impurezas na banda SN de um gradiente descontínuo por sacarose são mostrados para confirmar que o aumento na incorporação de S 35 metionina após a adição de glutamato é devido à síntese proteica de novo. 40 micromolares ANESA micina um inibidor da síntese de proteínas foi adicionado. Esta figura mostra a diminuição acentuada na incorporação de S 35 metionina na presença de anso micina com ou sem glutamato presente quando comparada aos níveis basais.

Assim, os gradientes descontínuos de sacarose peral produzem rapidamente SNS altamente ativo e relativamente puro que pode ser usado para estudar a tradução de proteínas. Esta figura mostra que a banda cinco do gradiente de sacarose descontínuo por núcleo contém os níveis mais altos de síntese proteica de novo. O SNS preparado passando o córtex homogeneizado através de uma série de filtros com tamanho de poro decrescente e, em seguida, centrifugando sobre um gradiente de sacarose descontínuo por núcleo para comparação contém mais membranas quebradas e menos SNS inteiro do que o SNS preparado a partir do método de gradiente de sacarose perol descontínuo SNS preparado usando o método de gradiente de sacarose peral descontínuo mostra conter mais atividade de síntese de proteína de novo do que SNS preparado usando o método de filtração.

O SNS preparado a partir de camundongos mais jovens demonstrou ter maior atividade translacional do que os camundongos mais velhos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar zonas neurológicas sinápticas translacionalmente ativas homogeneizando córtices de camundongos, centrifugando o homogeneizado em um rotor de caçamba oscilante, centrifugando o sobrenadante sobre um gradiente de sacarose por chamada em um rotor de ângulo fixo e, em seguida, coletando a banda de zona neuro sináptica resultante.