Name: Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a preparar sinaptoneurossomas ativos do córtex de camundongo usando gradiente de densidade Percoll-sacarose descontínuo. Este método evita danos mecânicos e reduz toxicidade celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gostaríamos de agradecer a BK agosto da Universidade de Wisconsin-Madison Facility Microscópio Eletrônico para a microscopia eletrônica. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).

1. Preparações 1-4 <ol><li> Prepare 500 mL de tampão de meio de gradiente (GM), misturando 50 mL de uma pasta de sacarose 2,5 M, 2,5 mL de uma 1M Tris-HCl, pH 7,5 valores, e 0,1 mL de um 0,5 m EDTA, pH 8,0 estoque com mili- Q água para volume. Filtro de esterilizar a solução de alíquota, e armazenar congelados. </li><li> Prepare um estoque de 1000x tetrodotoxina (TTX) fazendo uma solução de 1 mM em mili-Q H 2 O. Alíquotas de TTX podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> Preparar o tampão de Estimulação 10x, fazendo uma solução de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, e 800 mM NaCl em água milli-Q. Estoque pode ser armazenado a 4 ° C. </li><li> Pré-cool centrífugas a 4 ° C. </li><li> Prepare uma solução estoque de Percoll isosmótica (SIP), adicionando 9 volumes de Percoll (18 mL) para 1 volume de 2,5 M de sacarose (2 mL) em água milli-Q e misture bem. </li><li> Preparar a 3, 10, 15, e camadas gradiente de 23%, adicionando os respectivos montantes de SIP para a GM de buffer e cada mistura: </li></ol><img alt="Tabela 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 0"><ol start="7"><li> Despeje camadas gradiente por pipetagem de 2 ml cada um dos 23, 15, 10, e 3% em soluções de Percoll isosmótica os tubos de centrifugação Beckman com tampas usando um P1000 Gilson Pipetman. A interface entre as camadas devem ser claramente distinguíveis, sem mistura das camadas. Armazenar os gradientes de temperatura de 4 ° C durante pelo menos 20 min antes do uso. Os gradientes podem ser armazenadas por até 24 horas, embora use mesmo dia é recomendado. [Pessoal de laboratório inexperientes podem praticar gradientes preparando adicionando corante azul para as soluções isomotic Percoll para a visualização das interfaces da camada.] </li></ol> 2. Dissecção do mouse uma <ol><li> Garantir que todos os criação de mouse e eutanásia procedimentos são realizados de acordo com as diretrizes do NIH e da Universidade. Euthanize filhotes (idade P13 a P21) por asfixia dióxido de carbono ou por um método aprovado no protocolo animal. </li><li> Pin o mouse para uma placa de dissecção e pulverizar a parte de trás do pescoço e da cabeça com etanol. Usando uma tesoura afiada corte através da medula espinhal na base do crânio, retire a pele da parte superior do crânio, corte no crânio lateralmente entre o osso eo osso parietal interparietal ou entre o cérebro e as regiões do córtex. Em seguida, corte no crânio da base para o nariz (ao longo da sutura sagital), remova cuidadosamente o osso parietal macia puxando cada hemisfério para o lado e remover o córtex com uma espátula. Inserir a espátula no cérebro acima do cerebelo e, em seguida, retire o córtex e colocá-lo na gelada tampão GM. Proceder de imediato para a etapa de homogeneização. Não deixe que os córtices sentar na gelada tampão por muito tempo como este irá afectar negativamente a formação de SNs. </li></ol> 3. Preparação de homogenato e SNs 04/01 <ol><li> Enxágüe os córtices no gelada tampão GM e transferência de dois córtices para um homogeneizador de vidro Dounce contendo 5 mL de tampão GM frio. </li><li> Homogeneizados suavemente os córtices com golpes 10/05 do pilão solto (pilão "A"), seguido por acidentes vasculares cerebrais 10/05 do pilão apertado (pilão "B"). Strokes deve ser rápido, mas lento o suficiente para não causar bolhas de ar. A imagem do homogenato após homogeneização está no Esquema 1. O número de acidentes vasculares cerebrais irá variar consoante a homogeneizador individuais e pilões de acompanhamento. Quando terminar os gradientes deve dar uma banda SN forte, se não, ajustar o número de acidentes vasculares cerebrais. </li><li> Transferir o homogeneizado para a 15 mL cônica e centrifugar a 1000xg por 10 min a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (Allegra 6KR centrífuga) para pellet restos celulares e núcleos. A Imagem do homogeneizado é girado no Esquema 1. </li><li> Layer 2 mL do sobrenadante por Percoll-sacarose gradiente de tampão, os tubos, e centrifugar a 32.500 xg por 5 min a 4 ° C em um rotor de ângulo fixo (Beckman J2-21 centrífuga, JA-17 rotor) o uso de adaptadores apropriados ( ver Reagentes e Equipamentos Tabela). </li><li> Pipeta e descartar a solução acima da banda SN usando um copo Pasteur pipeta. Pipeta off da banda SN na interface 15/23%, transferir para um cone e armazenar no gelo. Cada gradiente ou um córtex produzirá 0,9-1,1 mL de SN. </li><li> Ajustar a concentração de sal do SNS, adicionando um décimo volume de tampão de estimulação 10x, adicione CaCl 1000x 2 a uma concentração final de 12 nM, e adicionar 1 mM de ações TTX a uma concentração final de 1 mM para suprimir a excitação inespecífica. (Adição de CaCl 2 é opcional se ele vai interferir com aplicações a jusante SN). </li><li> Determinar a concentração de proteína do SNs usando o Micro BCA Protein Assay Kit. (O teste de proteína Bradford não é recomendado porque de inferência do Percoll.) </li><li> SNs podem ser usados ​​diretamente e rapidamente para a proteína traduçãoção estudos. Para outras aplicações SN lisado podem ser limpos ou concentrado com o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep. </li></ol> 4. Resultados representativos: Quando o mouse córtex foi homogeneizado e separados em descontínuo de Percoll-sacarose gradientes (Esquema 1), 6 bandas ou frações foram (Figura 1). Foi mostrado anteriormente para o córtex cerebral de ratos 3,5 que os componentes da alta bandas de peso molecular foram quebrados e membrana de mielina e que o material continha mitocôndrias peletizada ou organelas (Tabela 1). Os 23% interface / 15% (faixa 5) continha os SNs enriquecido. A banda na interface de 23% / 15%, contendo SNs intacta, foi retirado e examinado por microscopia eletrônica (EM) conforme descrito anteriormente. 2,6 EM mostrou a presença de vesículas sinápticas intacta ea preservação de elementos pré-sináptico e pós-sinápticos (Figura 2). Isolamento de compartimentos pré e pós-sináptica é importante para o exame de sinalização e de síntese de proteína, que ocorre em ambos os compartimentos. 7-13 O gradiente de Percoll-sacarose é um purificação bruto então vimos menor contaminação, celular organela nuclear e na fração de SN, mas o separação geral foi bom. Quando examinados por Western Blot, as frações Percoll continha os marcadores de proteína com um aumento esperado na pureza sináptica na banda SN (Figura 3, Tabela 2). Marcadores sináptica e neuronal foram mantidos na faixa de SN enriquecido (faixa 5), ​​mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Em particular, a presença de GFAP, um marcador de células neoplásicas e astrócitos de origem glial, e Lamin-B1, um marcador nuclear, foram insignificantes, enquanto marcadores estruturais e sinápticas foram mantidos ou melhorados. Além disso, houve retenção de marcadores de organelas, como as mitocôndrias e Golgi, que desempenham um papel na síntese protéica. Rendimentos típicos para a banda SN foram 250-500 ng de proteína por mL, conforme determinado pelo BCA ensaio de proteína. A atividade do SNS foi determinada pela quantidade de síntese protéica de novo presente como monitorados por [35S]-Met incorporação (Figura 4). Basal 2 atividade translacional aumentou 1,56 vezes quando SNs foram estimulados com 50 mM mM glicina glutamate/10 (Glu), ou 5,12 vezes quando ativada com o inibidor juglone Pin1. Inibição Pin1 é conhecido por resultar em aumento da síntese protéica. 2 Para confirmar que o aumento do [35S]-Met incorporação era devido a síntese de proteínas de novo, nós adicionamos 40 anisomicina mM, um inibidor da síntese de proteínas, e viu uma acentuada diminuição na incorporação na presença e ausência de Glu, quando comparado aos níveis basais. Também, mediante a adição de 2% Triton-X 100, o que perturba a integridade dos SNs, tradução basal foi reduzida em 75%. 2 Além disso, ao examinar as bandas (B4-B6), que mostrou o enriquecimento marcador mais sináptica, O SNS ou Banda 5 teve a maior atividade de síntese protéica de novo (Figura 5). Assim, o descontínuo de Percoll-sacarose gradientes rapidamente produzir um altamente ativa e enriquecido banda SN que pode ser usado para estudar a tradução proteica. O procedimento de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose é mais vantajoso do que outros métodos, porque dano mecânico é causado pelas condições mais duras. Quando comparado com o método de filtração, em que apurou homogeneizado cortical é passado através de uma série de filtros que diminuem em tamanho, 3,14-15 o método Percoll formas SNs mais com maior atividade. Como visto na Figura 6, quando uma alíquota de SNs preparados pelo método de filtração foi passada ao longo de um gradiente de Percoll-sacarose há SNs muito menos na interface 15/23% e uma maior quantidade de membranas quebrado. Quando de novo a síntese de proteínas foi medida através S35 met-incorporação, o SNS preparado pelo método de filtração eram muito menos ativa (Figura 7). Para maximizar a atividade translacional usamos ratos que estão entre a idade P14 e P18. SN pode ser preparado a partir de camundongos adultos, mas observamos um aumento significativo de atividade translacional com SN preparados a partir de ratinhos jovens (Figura 8). <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Constituintes das bandas do Percoll descontínuo gradiente de fracionamento do córtex do rato homogeneizado. 3,5 <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 2"> Tabela 2. Resumo da análise de parafuso ocidental de Percoll descontínuo de sacarose-constituintes banda degradê. Concentrações de proteína relativa para cada uma das frações isoladas banda usando um Percol descontínual de sacarose-gradiente foi determinada por Western Blot. Sem proteína presente (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), ou&gt; 0,8 vezes (+++) = maior proteína presente no sobrenadante representante (S, centrifugado córtex homogenato), de n 3. <img alt="Esquema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Esquema 1"> Esquema 1: Esquema de uma preparação SN utilizando um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose córtex cerebral de camundongos foram dissecados, homogeneizado, e centrifugação a baixa velocidade para remover não-homogeneizado de tecido, células, organelas todo, como núcleos e membranas.. O gradiente descontínuo deve ter camadas bem definidas. A imagem mostra um exemplo de inserção das camadas, que têm sido tingido de azul apenas para fins ilustrativos, a fim de visualizar as camadas. O sobrenadante é camadas em cima de um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e centrifugado a velocidade média. A banda SN é então recuperado do gradiente e está pronto para usar. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fracionamento homogeneizado em um gradiente Percoll-sacarose descontínua. Córtex do rato foi homogeneizado e separados em um gradiente Percoll-sacarose descontínua dando origem a 6 bandas ou frações. A purificada, ativa SNs (*) foram encontrados na faixa 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Preparações SN dar uma mistura heterogênea de SNs que retêm elementos pré-sináptico e pós-sináptica. Uma micrografia eletrônica de uma preparação SN preparados a partir de camundongos C57BL / 6 (idade P13 a P21) foi realizada como descrito anteriormente SNs e shows com preservados elementos pré-sináptico e pós-sináptica. 2 , 6 pontos setas vermelhas para pós-sinápticos densidades. Barra de escala é 1 mícron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análises de Western blot de preparações SN mostraram que os marcadores sináptica e neuronal foram mantidas no SNs purificada (Band 5), mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Immunoblots do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) e Bandas 1-6 de uma descontínua Percoll-sacarose gradiente foram sondados para β-actina (controle, estruturais de carga), GFAP (astrocitária), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmática e nuclear), Lamin-B1 (nuclear), Prohibitin (mitocondrial), PSD95 (densidade pós-sináptica ), SNAP25 (sináptica), sinaptofisina (synaptic) e β3-tubulina (neurônio-específica). As bandas foram visualizadas utilizando uma tempestade 860 Phosphorimager, representante de n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. SNs são ativos e apresentam a síntese de proteínas de novo através de [35S]-Met incorporação. SNs foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Em seguida, o SNs foram pré-tratados ou não tratada por 15 min com 40 mM anisomicina ou 1 mM juglone a 37 ° C seguido por adição de [35S]-Met, 20 l expresso Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Banda de 5 a partir do gradiente de Percoll-sacarose descontínua continha os mais altos níveis de síntese protéica de novo. Bandas 4, 5 e 6 e do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. SNs preparados a partir de um método de filtração contêm membranas mais quebrado e SNs menos do que toda SNs preparado a partir do método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente. 3,14-15 alíquota Um dos SNs preparados pelo método de filtração foi centrifugado em um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e em comparação com um montante equivalente de material usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. SNs preparados a partir de um método de filtragem de novo contêm menos proteínas do que atividade de síntese SNs preparado from o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente, 3,14-15 e pelos métodos Percoll descontínuo de sacarose-gradiente. SNs de ambas as preparações foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. SNs de ratos jovens (P14) têm maior atividade translacional do que os camundongos mais velhos (P85). SNs foram preparados a partir de diferentes ratos idosos usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose, preequilibrated a 37 ° C por 10 min, tratada ou não com Glu na presença de [35S]-Met (Express Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil) por 30 min, snap congelados, e depois limpou com o Kit Prep Pierce SDS-PAGE da amostra. Os SNs foram executados em um 12% de gel de poliacrilamida SDS, secas e fotografada em uma tempestade Molecular Dynamics 860 phosphorimager representante do n = 3, ± SEM. SNs de P14 camundongos foram pelo menos 3 vezes mais ativo do que P85 camundongos.

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A preparação de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose aqui descrito é um método rápido e confiável para isolar SNs ativo, que pode ser usado em uma variedade de experimentos de transmissão sináptica. Este método do gradiente, que é baseado no método desenvolvido por Dunkley et al., 3,4 é um procedimento de fracionamento subcelular cérebro que isola pré e pós-sináptica da membrana derivada vesículas que estão associados com o outro. Sem purificação adicional esses SNs são compatíveis com uma variedade de t...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Assay Kit </td><td> Perfurar </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Pescador </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gás CO2 </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pescador </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Pescador </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Pescador </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS PAGE-Sample Prep Kit </td><td> Perfurar </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Pescador </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Pescador </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base de Dados </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxina </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Expressar Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Ferramentas de dissecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homogeneizador, 7 mL (vem com dois pilões de vidro &quot;A&quot; e &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra Centrifugar 6KR </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH Rotor 3.8, rotor de caçamba móvel </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga Beckman J2-21 </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tubos com tampas </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Branco adaptadores murada </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Azul adaptadores murada </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, rotor de ângulo fixo </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela de anticorpos utilizados para western blots: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome de anticorpos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Espécies hospedeiras </th><th> Fator de diluição </th></tr><tr><td> β-Actina </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> mouse </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> coelho </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> cabra </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> coelho </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> mouse </td><td> 5 mg / mL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> Abcam </td><td> ab5666-100 </td><td> coelho </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Sinaptofisina </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> mouse </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparação de synaptoneurosomes de rato cortex usando um gradiente de densidade percoll descontínuo sacarose-

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNS) são obtidos após homogeneização e fracionamento de rato córtex cerebral. Eles são selados vesículas ou terminais isolados que romper com os terminais do axônio quando o tecido cortical é homogeneizado. Os SNs reter características pré e pós-sináptico, o que os torna útil no estudo da transmissão sináptica. Conservem as máquinas moleculares utilizados na sinalização neuronal e são capazes de captação, armazenamento e liberação de neurotransmissores. A produção e isolamento de ativos SNs pode ser problemático mídias usando como Ficoll, que podem ser citotóxicos e centrifugação prolongada devido a alta densidade, e filtração e métodos de centrifugação, que pode resultar em baixa atividade, devido a danos mecânicos do SNS. No entanto, o uso de gradientes descontínuos de Percoll-sacarose de densidade para isolar SNs fornece um método rápido para produzir bons rendimentos de SNs traducionalmente ativo. O método do gradiente Percoll-sacarose é rápido e gentil como ele emprega condições isotônica, tem spins centrifugação menos e mais curtos e evita que as etapas de centrifugação pellet SNs e causar danos mecânicos.

Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Sinaptoneurossomos (SNs) são obtidos após a homogeneização e o fracionamento do córtex cerebral de camundongos. Eles são vesículas resseladas ou terminais isolados que ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar sinaptossomos com atividade translacional a partir do córtex cerebral de camundongo, utilizando um gradiente de densidade de sacarose percal descontínuo. Isso é realizado primeiramente coletando e homogenizando os córtices de camundongo, e então centrifugando o homogenato. Após isso, aplique o homogenato centrifugado, ou sobrenadante, aos gradientes pré-formados de sacarose percal.O passo final é centrifugar e coletar a fração de sinaptossomos. Em última análise, análises por western blot e experimentos de incorporação de metionina S 35 mostram que a fração de sinaptossomos é enriquecida sinapticamente e ativa do ponto de vista traducional. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como centrifugação e filtração, são: primeiro, os danos mecânicos são evitados mediante o uso de gradientes de densidade, e segundo, a toxicidade por célula é baixa em relação aos constituintes celulares.De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades com este protocolo porque o tempo desempenha um papel fundamental. Uma vez que os córtices tenham sido coletados, o procedimento deve ser rapidamente concluído. Pa

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células cerebrais e células imunes infiltradas de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos por digestão enzimática, seguida pela remoção de detritos celulares e mielina por centrifugação por gradiente de densidade, para estudar as respostas inflamatórias na pesquisa de AVC.

Obtenção de suspensões celulares de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos

Fonte: Lunelli, L., et. al. Examinando polissomos cerebrais com microscopia de força atômica. J. Vis. Exp.(2016). Este vídeo demonstra a imagem de polissomos usando microscopia de força atômica. Uma folha de mica revestida de íons de níquel ancora o RNA com ribossomos anexados. A amostra é lavada, seca e montada no estágio do microscópio. A ponta cantilever varre a superfície da amostra, registrando deflexões do laser para mapear a topologia. O software é usado para corrigir distorções e...

 Imagem de polissomos isolados de um cérebro de camundongo usando microscopia de força atômica

Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Embora a estrutura do ribossomo tenha sido extensivamente caracterizada, a organização dos polissomos ainda é pouco estudada. Para superar essa falta de conhecimento, apresentamos aqui um protocolo de preparação detalhado para imagens precisas de polissomos de mamíferos por microscopia de força atômica (AFM) em ar e líquido.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

A identificação de moléculas e vias que controlam a plasticidade sináptica e a memória ainda é um grande desafio na neurociência. Aqui, é descrito um fluxo de trabalho abordando a quantificação relativa de proteínas sinápticas supostamente envolvidas na reorganização molecular das sinapses durante a aprendizagem e consolidação da memória em um paradigma de aprendizagem auditiva.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Este protocolo apresenta um método robusto e detalhado para obter sinaptossomos, vesículas sinápticas e outras frações sinápticas altamente puras do cérebro de camundongos. Este método permite a avaliação de processos sinápticos, incluindo a análise bioquímica da localização e função de proteínas com resolução compartimental.

Fracionamento subcelular para o isolamento de componentes sinápticos do cérebro murino

Aprenda a preparar sinaptoneurossomas ativos do córtex de camundongo usando gradiente de densidade Percoll-sacarose descontínuo. Este método evita danos mecânicos e reduz toxicidade celular.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Explorar mais vídeos