Name: Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda métodos padronizados de esterilização de sementes de Arabidopsis usando hipoclorito e gás cloro. Esta técnica otimizada permite esterilizar centenas de linhagens com alta taxa de germinação e prevenção eficaz de contaminação microbiana.

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Gostaríamos de agradecer sua ajuda na preparação de materiais experimentais Gauri Datta. Agradecemos também a Bettina Wittler e James Mann a revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo MCB-1143813 e subsídios NSF DBI-1049341.

1. preparação de 1x do meio de Murashige e Skoog (MS) <ol><li>Adicionar 4.31 g MS basal mistura de sal, 10 g sacarose e 0,5 g de 2-(N-Morpholino) etanesulfónico ácido (MES) para um béquer contendo 0,8 L de água destilada e agitar para dissolver. Verificar e ajustar o pH a 5.7 usando 1 M de hidróxido de potássio (KOH). Adicionar água destilada para fazer 1 L.</li>
	<li>Dividir os meios de comunicação em duas garrafas de 1L, 500 mL cada. Adicione 5 g de agar para cada garrafa. Manter a tampa solta.</li>
	<li>Autoclave por 20 min a 121 ° C, 15 psi com uma barra de agitação magnética na garrafa.</li>
	<li>Após a autoclavagem, coloque as garrafas num prato misture a baixa velocidade e permitir que o meio MS arrefecer até 45-50 ° C (até a garrafa pode ser realizada com as próprias mãos).</li>
	<li>a partir desta etapa, execute todas as etapas em condições estéreis de um capuz de fluxo laminar. Adicionar 500 µ l Gamborg ' s solução de vitamina a cada frasco e agitar o meio MS para distribuir uniformemente a solução vitamina.</li>
	<li>Despeje bastante mídia placas para cobrir aproximadamente metade da profundidade da placa.</li>
	<li>Permitir que as placas esfriar em temperatura ambiente por cerca de 1h permitir que o ágar solidificar. 
	Nota: Se as placas não devem ser usados imediatamente, embrulhe em plástico e armazenar a 4 ° C (temperatura de geladeira). Coberto de placas, caixas ou tubos com ágar solidificado podem ser armazenados por várias semanas a 4 ° C em um recipiente hermético.</li>
</ol> 2. Esterilização de sementes de Arabidopsis com lixívia <ol><li>preparar a MS placas nos termos da secção 1 do protocolo. 100 mL de água destilada, ao mesmo tempo como o MS Media de autoclave. Isto usar mais tarde como água de enxágue e para ajudar a suspender as sementes para auxiliar no chapeamento. 
	Nota: Se desejar, mistura de ágar de 0,8% (p/v) (por exemplo, phytagar) também pode ser autoclavada nesta etapa. A mistura de ágar-ágar pode ser substituída por água destilada durante chapeamento (etapa 2.5.3.). A extra viscosidade da mistura agar facilita a sementes de espaço na placa ou planta em linhas se necessário.</li>
	<li>Preparar 50% (v/v) descorar a solução a ser usado para esterilizar as sementes. Para diluir a água sanitária, adicione 100 mL de água sanitária para 100 mL de água destilada. Adicionar 50 µ l de detergente Tween 20 para a solução de lixívia. 
	Nota: Solução de lixívia preparado pode ser armazenada por até um mês, enquanto ele só é aberto em condições estéreis.</li>
	<li>Alíquota 100 sementes em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Esterilizar as sementes usando uma solução de água sanitária 50%.
	<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, adicionar 500 µ l de solução a 50% para o tubo de microcentrifugadora contendo as sementes. Toque o fundo do tubo para suspender as sementes na solução de água sanitária. 
		Nota: Como alternativa, um rotador ou agitador de plataforma pode ser usado para manter as sementes suspendidas.</li>
	</ol></li> <li>Enxaguar a solução do descorante do tubo de.
	<ol><li>Após 10min, remover a solução de lixívia do tubo microcentrifuga usando uma pipeta ou um aspirador munido de uma ponta da pipeta no final.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de água destilada estéril ao tubo. Fechar o tubo e inverter para misturar. Permitir que sementes de resolver para o fundo do tubo. Uma vez que as sementes se instalaram no fundo do tubo cuidadosamente remova a solução de água sanitária por pipetagem. Repetir esta lavagem processo 6 vezes.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de água destilada esterilizada no tubo para suspender as sementes.</li>
	</ol></li> <li>Placa as sementes esterilizadas em placas de MS.
	<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, rotular o inferior da placa com o nome de estoque e a data atual de MS.</li>
		<li>Derramar as sementes do tubo microcentrifuga na chapa de MS. Espalhar as sementes em torno da placa MS usando um loop inoculando estéril de uso único ou uma ponta de pipeta estéril. 
		Nota: Se as sementes devem ser semeadas em linhas, uma pipeta com uma ponta de 200 µ l pode ser usada individualmente, colocar as sementes na posição desejada. Para melhorar o fluxo de sementes, o fim da ponta da pipeta pode ser aparado por 3-5 mm, com uma tesoura. Qualquer sementes extraviadas ou dos grupos de sementes então pode ser reposicionados ou separadas usando um loop inoculando estéril de uso único.</li>
		<li>Coloque a placa de MS na parte traseira da do exaustor de fluxo laminar com a tampa meio fechado. Permitir que o excesso de água evapore da placa de MS.</li>
		<li>Coloque a tampa sobre a chapa de MS. Selo, a placa de MS encapsulando a placa com papel microporoso cirúrgica de fita (consulte a Tabela de materiais).</li>
	</ol></li></ol> 3. Esterilização de sementes de Arabidopsis com gás de cloro <ol><li>preparar a MS placas nos termos da secção 1 do protocolo. Autoclave de 100 mL de água destilada, ao mesmo tempo como a Media de MS; Isso será usado mais tarde para ajudar a suspender as sementes para auxiliar no chapeamento. 
	Nota: Se desejar, mistura de ágar de 0,8% (p/v) (por exemplo, phytagar) também pode ser autoclavada nesta etapa. A mistura de ágar-ágar pode ser substituída por água destilada durante chapeamento (etapa 3.6.2.). A extra viscosidade da mistura agar facilita a sementes de espaço na placa ou planta em linhas se necessário.</li>
	<li>Antes de começar a esterilização, calcular as quantidades de água sanitária e ácido clorídrico (HCl) necessárias para produzir o gás de cloro.
	<ol><li>Calcular a quantidade de HCl necessário para produzir a 6,1% Cl 2 necessários para a esterilização.</li>
		<li>Usar a fórmula a seguir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> com 7.000 mL como o volume do recipiente de esterilização e 6,1% Cl 2; o volume de HCl é calculado para ser de 3 mL. 
		Nota: Uma planilha programada para realizar o cálculo em diferentes volumes do recipiente e % Cl 2 é fornecida como quadro suplementar 1.</li>
	</ol></li> <li>Alíquota 100 sementes num tubo de microcentrifuga de 0,5 mL. Feche as tampas para cada frasco, coloque os frascos em um rack de plástico e reserve. 
	Nota: As sementes podem ser armazenadas por um período prolongado de tempo neste momento, enquanto eles são armazenados em condições adequadas. Condições de armazenamento encontram-se na seção 3.3.2 do protocolo por Rivero e colegas 4. formato da placa de 96 poços também pode ser usado.</li>
	<li>Preparar os materiais necessários para realizar a esterilização por gás cloro.
	<ol><li>Obter água sanitária e HCl de seus locais de armazenamento.</li>
		<li>Corte uma tira de parafina grande filme (consulte a Tabela de materiais) para usar na etapa 3.5.3. para selar o recipiente de esterilização.</li>
		<li>Coloque o recipiente plástico com tampa, em que a esterilização terá lugar dentro de uma coifa. Abra as tampas em todos os frascos de semente e coloque o Carré de semente inteira dentro do recipiente de plástico.</li>
	</ol></li> <li>Executar a esterilização por gás cloro em temperatura ambiente. 
	Atenção: Trabalhe separadamente com água sanitária e ácido. Não deixe qualquer garrafa estreantes para reduzir risco de derrames. Use equipamento de protecção adequado (EPI) incluindo luvas e um jaleco. Se água sanitária ou ácido espirra em luvas, altere luvas antes de manusear a outros materiais. Retire sempre as luvas na coifa em caso de contaminação de água sanitária ou ácido.
	<ol><li>Coloque dentro do recipiente um copo de 250 mL e adicionar 100 mL de água sanitária. 
		Nota: A reação entre o HCl e lixívia requer pelo menos 22 volumes excesso de alvejante. A reação irá consumir o HCl e bleach por liberando gás de 2 Cl com cloreto de sódio (NaCl) e água como subprodutos. Usar um grande excesso de água sanitária permite o consumo de adicional d HClurante o período de ventilação, o que diminui a quantidade de bicarbonato de sódio (NaHCO 3) necessária para neutralizar a solução para a eliminação. 
		Atenção: O copo deve ser pelo menos duas vezes o volume de líquido total de lixívia + HCl. Isso impede que espirra escapando o copo durante a próxima etapa, que pode danificar as sementes, alvejante de roupas ou queimar a pele exposta.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de HCl para o béquer contendo a água sanitária. 
		Atenção: A reação inicial irá produzir bolhas, especialmente nas concentrações de gás superiores a 6,1%. Um jaleco de mangas compridas é necessário para esta etapa.</li>
		<li>Fechar o recipiente de esterilização e selá-lo com a película de parafina imediatamente.</li>
		<li>Monitorar o recipiente de esterilização durante o tempo de esterilização para garantir a acumulação de gás; o acúmulo de gás de cloro deve ser visível como uma névoa amarela fraca dentro do recipiente. 
		Atenção: Verifique periodicamente se o recipiente de esterilização para assegurar que a pressão no interior não tem desbancou a tampa ou filme de parafina. Se a tampa veio destituída ou a película de parafina se soltou, feche a tampa e envolva cuidadosamente o recipiente com uma camada adicional de película de parafina.</li>
		<li>Depois da 1 h-esterilização período, abre o recipiente, removendo a película de parafina e abrir a tampa em um canto. Permitir que o contêiner desabafar para 3h completar a reação e eliminar o gás cloro.</li>
		<li>Feche as tampas dos todos os microcentrifuga tubos no rack semente. 
		Nota: Sementes esterilizadas podem ser armazenadas até o tempo do chapeamento, enquanto eles são armazenados em condição seca.</li>
		<li>Retire o cesto de sementes e coloque-o em uma capa de fluxo laminar.</li>
		<li>Neutralizar a reação de cloro gás <ol><li>Adicionar 1,5 g NaHCO 3 pó lentamente para o béquer contendo a solução de água sanitária/HCl e agitar com uma vareta de vidro para dissolver o NaHCO 3 em solução. Continuar a adicionar NaHCO 3, até que as bolhas de gás de dióxido de carbono (CO 2) pararam de formar. 
			Atenção: Adicione lentamente para evitar salpicos. Usar EPI apropriado, incluindo luvas e um jaleco.</li>
			<li>Testar o pH da solução usando tiras de pH ou um medidor de pH. Adicionar adicionais NaHCO 3 se necessário até que o pH da solução é neutro (pH 7.0). Neste ponto a solução pode ser retirada a coifa e eliminada de acordo com todas as orientações aplicáveis disposição. 
			Cuidado: Se qualquer cheiro é notado durante a eliminação, então a solução deverá ser devolvida imediatamente para a coifa.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Placa as sementes esterilizadas em placas de MS.
	<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, rotular o inferior da placa com o nome de estoque e a data atual de MS.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de água destilada esterilizada a cada tubo microcentrifuga de suspender as sementes. Despeje as sementes para a placa de MS e espalhar as sementes uniformemente ao redor da placa usando um loop inoculando estéril de uso único ou uma ponta de pipeta estéril.</li>
		<li>Coloque a placa de MS na parte traseira da do exaustor de fluxo laminar com a tampa meio fechado. Permitir que o excesso de água evapore da placa de MS.</li>
		<li>Coloque a tampa sobre a chapa de MS. A placa de MS do selo encapsulando a placa com fita cirúrgica microporosa.</li>
	</ol></li></ol> 4. Crescimento de Arabidopsis em placas de MS <ol><li>colocar as placas com a tampa no topo durante três dias a 4 ˚ c e umidade do ambiente. 
	Nota: Este processo é chamado de estratificação e serve para sincronizar a germinação de sementes individuais.</li>
	<li>Transferir as placas para o ambiente de crescimento.
	<ol><li>Temperatura de manutenção a 23 ° C e da intensidade de luz em 120-150 µmol/m 2 s com luz de 16 h / a 8h escuro fotoperíodo. Colocar placas planas para o ambiente de crescer com a tampa na parte superior para que as raizes que crescem no meio de.</li>
	</ol></li> <li>Deixar as mudas em placas crescem por 8 dias. 
	Nota: Um período de crescimento dia 8 permite tarde germinando sementes para germinar. Placas podem ser marcadas mais cedo do que 8 dias se todas as sementes já germinadas.</li>
	<li>Marcar as taxas de germinação.
	<ol><li>Recorde o número de sementes que têm germinado e que não tenham germinado. Calcular a taxa de germinação, dividindo o número de sementes que germinaram pelo número total de sementes no prato. 
		Nota: Germinação é contada quando a radícula projetou fora o revestimento de semente e os dois cotilédones são visíveis.</li>
		<li>Também contar o número de sementes afetadas pelo molde para determinar a eficácia das condições de esterilização.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).</li>
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<li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)"> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
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<li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291(2013).</li>
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<li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li>
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<li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+screening+for+insertional+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li>
<li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li>
<li>López-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quando crescer sementes de Arabidopsis na mídia estéril, alguma forma de esterilização deve ser aplicada. Tratamentos de esterilização de gás cloro e o cloro resultam em semelhante inibição do crescimento taxa e molde germinação. Nenhum método de esterilização provoca uma redução significativa na taxa de germinação de sementes com alta germinação potencial; no entanto, esterilização da água sanitária é recomendada para linhas com menor potencial de germinação (20-70%), devido a pequena, embora não significantes, melhoria na taxa de germinação em comparação a esterilização por gás (Figura 3A).
Esterilização de sementes de Arabidopsis com concentrações de lixívia de 40-100% para até 10 min fornece percentagens de germinação satisfatória e supressão de molde eficaz. Embora as concentrações de cloro inferior a 40% fornecer esterilização adequada para a maioria dos lotes de sementes, usando uma concentração de 40% ou maiores garantias esterilização eficaz dos lotes de sementes fortemente contaminadas mesmo. É importante para não exceder a 10 min da esterilização ao usar lixívia concentrações igual ou superior a 80% para evitar sementes de alta mortalidade e defeitos no desenvolvimento da plântula.
Tratamento de sementes de Arabidopsis com concentrações de gás cloro de 6,1%, ou 16,5% para resultados de 1h em taxas altas de germinação e eliminação adequada de molde. Concentração de gás cloro baixo (2,1%) pode ser usada com sucesso, aumentando a duração da esterilização para 3h.
Quando poucas linhas precisam ser esterilizados, recomenda-se esterilização líquida em uma solução de água sanitária 50% por 10 min. Para um maior número de linhas, esterilização por gás com uma concentração de gás de 6,1% para 1h é uma opção melhor, já que muitas linhas podem ser esterilizadas rapidamente e facilmente com menos manipulação.
Nossos resultados oferecem condições padronizadas para esterilização tanto grande número de sementes de diferentes genótipos e as sementes com baixa germinação potencial. A única limitação destas técnicas de esterilização é que eles não podem ser aplicados às sementes com taxas de germinação inferior a 20% devido à mortalidade de sementes extensa. Métodos alternativos, tais como sonication17, para aumentar a taxa de germinação, na ausência de esterilização podem ser benéficos nestes casos.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) é um organismo modelo principal para a pesquisa básica e aplicada na planta biologia1,2,3. Enquanto condições padrão para crescimento de Arabidopsis têm sido bem estabelecida4, o efeito da esterilização de sementes na viabilidade de sementes não foi rigorosamente testado. Meio sólido em chapas ou caixas rotineiramente é usado para facilitar o crescimento de plântulas de Arabidopsis para muitas aplicações experimentais, tais como identificação de mutantes letais homozigotos em uma população segregando, observação de fenótipos atirar e raiz no início estágios, isolamento dos tecidos isentos de organismos patogénicos, coleção de grandes quantidades de tecido de plântulas, seleção de plantas resistentes ou transformants e avaliação de germinação1,2,3,4 . As sementes colhidas de plantas cultivadas em uma estufa ou câmara de crescimento são ocasionalmente contaminados com microorganismos e poeira. Crescimento de plântulas de Arabidopsis em diferentes tipos de mídia estéril requer esterilização prévia semente para remover contaminantes microbianos, tais como fungos e bactérias presentes na superfície da semente. O uso de um regime de esterilização eficaz da semente é fundamental para um equilíbrio de alta germinação mínima contaminação e crescimento vigoroso das plantas.
Os dois métodos mais comuns utilizados para a esterilização de sementes de Arabidopsis baseiam-se na lixívia comercial (líquido-fase) e gás cloro (fase vapor). Vários procedimentos têm sido empregados para ambos esterilização líquido-fase1,4,5,6,7,8,9 , 14,8,10,11,12,13,de15 de sementes de esterilização 10 e vapor-fase de Arabidopsis ,16. No entanto, enquanto esses procedimentos têm sido eficazes na realização de esterilização de sementes de genótipos utilizados, uma análise detalhada do efeito dos tratamentos de esterilização diferentes nas sementes de diferentes genótipos não foi relatada. Portanto, a otimização destes procedimentos de esterilização é necessário definir as condições em que a esterilização eficiente é combinada com taxa de germinação de alta.
A Arabidopsis biológica Resource Center (ABRC) está singularmente posicionada para um) testar a viabilidade de sementes de uma variedade de diferentes genótipos na coleção e b) aproveitar os procedimentos de controle de qualidade aplicados internamente e em resposta ao feedback dos utilizadores sobre a germinação de sementes. Os objetivos das experiências aqui apresentados foram determinar os efeitos de diferentes métodos de esterilização na germinação de sementes de genótipos uma gama de Arabidopsis. Procedimentos de esterilização otimizada que resultem em taxas de germinação de sementes de alta, mantendo a contaminação mínima patógeno são apresentados para a esterilização de gás cloro e o cloro.

método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de arabidopsis

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana Mudas (Arabidopsis) muitas vezes precisam de ser cultivadas em meios estéreis. Isto requer esterilização prévia semente para impedir o crescimento de contaminantes microbianos presentes na superfície da semente. Atualmente, as sementes de Arabidopsis são esterilizadas usando duas técnicas diferentes de esterilização em condições que diferem ligeiramente entre laboratórios e não tem sido padronizadas, muitas vezes resultando em esterilização apenas parcialmente eficaz ou na mortalidade excessiva de sementes. A maioria desses métodos não é também facilmente escalável para um grande número de linhas de sementes de diferentes genótipos. Como as tecnologias para a análise do elevado-throughput de Arabidopsis continuam a proliferar, técnicas padronizadas para um grande número de sementes de diferentes genótipos de esterilização estão se tornando essenciais para a realização desses tipos de experimentos. A resposta de um número de linhas de Arabidopsis para duas técnicas diferentes de esterilização foi avaliada com base na taxa de germinação de sementes e o nível de contaminação de sementes com micróbios e outros agentes patogénicos. Os tratamentos incluíam diferentes concentrações de sterilizing agentes e tempos de exposição, combinados para determinar as condições ideais para a esterilização de sementes de Arabidopsis. Protocolos otimizados foram desenvolvidos por dois métodos diferentes de esterilização: lixívia (líquido-fase) e cloro (Cl2) gás (vapor-fase), ambas resultando em taxas de germinação de sementes de alta e mínima contaminação microbiana. A utilidade destes protocolos foi ilustrada através de ensaios de tipo selvagem e mutantes sementes tanto com uma gama de potenciais de germinação. Nossos resultados mostram que as sementes podem ser efetivamente esterilizadas usando qualquer método sem mortalidade excessiva de sementes, embora observaram-se efeitos nocivos da esterilização para as sementes com o mais baixo do que o potencial de germinação ideal. Além disso, uma equação foi desenvolvida para permitir aos investigadores a aplicar as condições de esterilização de gás cloro padronizada para recipientes herméticos de tamanhos diferentes. Os protocolos descritos aqui permitem esterilização de sementes fácil, eficiente e barato para um grande número de linhas de Arabidopsis.

Arabidopsis sementes coletadas em campo, com efeito de estufa ou crescimento câmara aberta às vezes são contaminadas por vários microorganismos como fungos e bactérias de1,4. Assim, germinação de sementes na mídia estéril pode ser particularmente difícil devido à contaminação das placas, especialmente quando o fornecimento de sementes é limitado. O protocolo otimizado para esterilização por gás cloro e o cloro, cujos resultados são apresentados abaixo, minimiza este problema e preserva a viabilidade de sementes necessárias para aplicações de alta produtividade.
Efeitos da esterilização de lixívia na germinação de sementes de Arabidopsis Col-0
Bleach é o agente mais comumente usado para esterilização de sementes em numerosas espécies de plantas. A concentração ideal do agente de esterilização e o tempo de exposição varia entre espécies. Um número de protocolos têm sido empregado com o uso de lixívia para esterilização de Arabidopsis sementes1,4,5,6,7,8,9 , 10. quatro diferentes concentrações de água sanitária com 5 tempo de exposição diferentes períodos foram testados e os resultados são apresentadas em Figura 1. Os tratamentos foram aplicados para as sementes (Col-0) de tipo selvagem Columbia. O efeito da concentração de lixívia na germinação de sementes de Col-0 variou dependendo do tempo de esterilização, como demonstrado por uma interação significativa entre a concentração de água sanitária e tempo de esterilização (Figura 1, P &lt; 0.001, ANOVA-análise de variância).
Nos experimentos com tempos de esterilização entre 5 e 10 min, tratamentos com todas as concentrações de lixívia resultaram em taxa de igualmente alta germinação de sementes de Col-0 (Figura 1). Taxas de germinação alta também foram observadas para as concentrações de lixívia de 40% e 50% de todos os tempos de esterilização. Tratamentos com lixívia de 80% e 100% para períodos maiores do que 10 min resultaram em uma significativa diminuição da taxa de germinação, em comparação com os tempos mais curtos de imersão (P &lt; 0,01, ANOVA). Além disso, para ambos os 80% e 100% alvejante tratamentos por 20 min, germinação foi diminuiu significativamente em comparação com o correspondente a 40% e 50% de alvejante tratamentos (P &lt; 0.001, ANOVA).
Sementes exibido vários níveis de branqueamento e encolhimento ao usar lixívia alta concentrações por 15 min ou mais. Além de relativamente elevada (até 32%) mortalidade de sementes, sementes germinadas esterilizadas nestas condições muitas vezes mostrou defeitos de crescimento, refletidos em uma falha dos cotilédones e hipocótilo a desdobrar e alongar, resultando na detenção do desenvolvimento. A maioria dos tratamentos (14 dos 20) foram completamente livre de molde, resultando em molde nível média geral de 0,21% ± 0,003 (tabela 1).
Um tratamento com água sanitária 50% e um tempo de imersão de 10 min foi selecionado como o melhor regime de esterilização porque combinou o percentual de germinação alta com boa inibição do crescimento de superfície do patógeno. Este tratamento foi selecionado para testar o efeito da esterilização de água sanitária em diferentes linhas de mutante, como descrito abaixo.
Efeitos da esterilização por gás cloro na germinação de sementes de Col-0
Para otimizar as condições de esterilização de gás cloro, três diferentes concentrações de gás cloro foram usadas para esterilizar as sementes Col-0 por dois períodos de tempo (tabela 2). A concentração de gás foi calculada com base no volume de HCl concentrado e o volume do recipiente de esterilização utilizando a seguinte equação:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Esta equação foi derivada usando a lei dos gases ideais assumindo 12.3 M de HCl, uma temperatura de 23 ° C e à pressão atmosférica padrão de 101.3 kPa.
O efeito da concentração de gás cloro na germinação de sementes de Col-0 foi mostrado a depender do tempo de esterilização conforme indicado por uma interação significativa entre o tempo e os fatores de concentração (Fig. 2A, P &lt; 0,01, ANOVA) . Concentração de gás de cloro não teve nenhum efeito significativo na germinação de sementes de Col-0 sujeitos a esterilização por 1h. Com este tempo de esterilização, todas as concentrações de gás cloro promovido, da mesma forma, níveis elevados de germinação, acima de 85% (P &gt; 0.05, ANOVA). Por outro lado, uma esterilização h-long 3 resultou em uma diminuição significativa na taxa de germinação para a maior concentração de gás de cloro, em comparação com as duas concentrações de gás inferiores (P &lt; 0.05, ANOVA). Estes resultados indicam que tratamentos de sementes de Arabidopsis com qualquer um das concentrações de gás cloro testado por 1h, ou com concentrações de gás abaixo de 16,5% para 3 h, são igualmente eficazes na preservação viabilidade de sementes, desde que as taxas de germinação foram sempre maiores de 82%. No entanto, esterilização de sementes para 3h com gás 16,5% foi prejudicial para a germinação das sementes.
A incidência de mofo também era dependente da concentração de gás e tempo de exposição. Crescimento de molde efetivamente foi inibido com as relativamente altas concentrações de gás de cloro de 6,1% e 16,5% para 1 h de duração de tratamento e com todas as concentrações de gás para 3h (Figura 2B).
Com base nestes resultados, um tratamento com uma concentração de gás de 6,1% para 1 h (tabela 2) foi selecionado como a melhor condição de esterilização vapor-fase para testar o efeito da esterilização por gás nas diferentes linhas de mutante, desde que ele combinado (taxa de germinação de alta 85%) com baixíssimo nível de contaminação de molde (0.02%).
Efeitos da esterilização de água sanitária e cloro gás em sementes com germinação diferente potencial
A análise estatística mostrou que a resposta de germinação aos métodos de esterilização foi dependente do potencial de germinação das linhas (Figura 3A, P &lt; 0,01, ANOVA). Esterilização por gás cloro nem alvejante reduzida taxa de germinação de sementes com alta germinação potencial (grupos 4 e 5). Nenhum tratamento teve um efeito sobre a taxa de germinação já baixa do grupo com a menor germinaçãopotencial (grupo 1). Em contraste, esterilização por gás cloro resultou em uma redução significativa em cerca de 12-18% (P &lt; 0,01, ANOVA) na germinação de sementes com potencial de germinação intermediária (grupos 2 e 3). Esterilização de água sanitária também diminuiu a taxa de germinação por 13% do grupo 2, mas isso não diminuiu a taxa de germinação do grupo 3. Embora tenha havido nenhuma diferença significativa na taxa de germinação entre a água sanitária e cloro tratamentos de gás em qualquer grupo de germinação (Figura 3A, P &gt; 0.442, ANOVA), sementes, esterilizadas com água sanitária teve um ligeiramente mais elevada taxa de germinação de sementes de gás-esterilizado em todos os grupos de germinação.
Tratamentos de esterilização significativamente alterados (P &lt; 0.001, ANOVA) a porcentagem de sementes afetadas pelo molde (Figura 3B). Ambos esterilização de gás e alvejante de cloro resultou em menor crescimento de molde (P &lt; 0.05, ANOVA) comparado a não esterilização. Não houve diferença no nível de molde detectado entre esterilização de gás e água sanitária em qualquer grupo (Figura 3B, P &gt; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figura 1: efeitos do tempo de concentração e a esterilização de lixívia na germinação de sementes de Arabidopsis Col-0. Os valores são meios ± SD obtido de 5 replicações independentes da experiência. * indica diferenças significativas em relação a 5 min de duração para uma gama de concentrações de lixívia de imersão (P &lt; 0,01, ANOVA). #indica diferenças significativas de 80% e 100% de alvejante concentrações em relação a 40% e 50% para um 20 min de período de tempo (P &lt; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figura 2: efeitos do cloro gás concentração e tempo de esterilização em sementes de Arabidopsis Col-0. (A) (B) molde nível e taxa de germinação. Barras de erro representam meios ± SD obtido de 5 biológica e 5 técnicas repetições do experimento. Significa que não compartilham uma carta são significativamente diferentes (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figura 3: efeitos da esterilização de água sanitária e cloro gás em sementes com potencial diferente germinação. (A) (B) molde nível e taxa de germinação. As 100 linhas de SALK T-DNA foram classificadas em cinco grupos de acordo com seu potencial de germinação, definidos como a taxa de germinação, na ausência de qualquer agente de esterilização. Os grupos com base na taxa de germinação foram como segue: grupo 1 (0-20%), grupo 2 (21-50%), grupo 3 (51-70%), grupo 4 (71-90%) e grupo 5 (91-100%). As linhas foram escolhidas aleatoriamente e seu potencial de germinação não dependem de genótipo. Os valores são meios ± SD obtido de três replicações independentes da experiência. Letras ("a", "ab", "c", etc.) acima de cada valor indicam os agrupamentos estatísticos da categoria meios. Significa que não compartilham uma carta são significativamente diferentes (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tempo de esterilização (min)</td>
			<td colspan="4">Concentração de água sanitária (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0,28%</td>
			<td>0,00%</td>
			<td>0,00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Nível de molde de sementes de Col-0 lixívia-esterilizados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Água sanitária</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tempo</td>
			<td rowspan="2">% De gás cloro (mol Cl2/mol total de gás)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Cloro (Cl2) gás tratamentos de esterilização em sementes de tipo selvagem de Columbia usando um recipiente de 7 L.
Suplementar tabela 1: Uma planilha programada para realizar o cálculo em diferentes volumes do recipiente e % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da esterilização de água sanitária e cloro gás na germinação de sementes de uma gama de Arabidopsis genótipos cultivados na mídia estéril. Protocolos de esterilização otimizada foram desenvolvidos para impedir o crescimento de contaminantes microbianos, proporcionando a sobrevivência satisfatória da semente.

Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer condições padronizadas para a esterilização bem-sucedida de sementes de um grande número de genótipos de Arabidopsis, evitando o crescimento microbiano. Este método permite esterilizar centenas de amostras de sementes de cada vez, simplificando assim uma etapa crítica de preparação de material vegetal nas áreas de genômica, proteômica, metabolômica e outros estudos de alto rendimento. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece condições nas quais a esterilização eficiente é combinada com uma alta taxa de germinação para um grande número de amostras de sementes.Para começar, prepare uma solução de alvejante a 50% com água destilada. Para cada 200 mililitros de solução de alvejante, adicione 50 microlitros de detergente TWEEN 20. A solução de alvejante pode ser armazenada por até um mês, desde que seja aberta apenas em condições estéreis.Em seguida, alíquota de 100 sementes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Isso pode ser feito manualmente ou usando um robô de sementes feito sob medida. Agora, em uma capela de fluxo laminar, adicione 500 microlitros da solução de alvejante a 50% às sementes.Em seguida, transfira os tubos para um rotador e incube as sementes no alvejante com agitação leve por 10 minutos. Após 10 minutos, aspire a solução de alvejante dos tubos, retirando o máximo possível. Em seguida, adicione de volta 500 microlitros de água destilada estéril e inverta os tubos para misturar.Deixe as sementes assentarem, aspire a água e substitua-a por outra alíquota para lavar as sementes novamente. Realize um total de seis dessas lavagens com água destilada esterilizada. Depois que as sementes forem bem lavadas com água, suspenda-as em um mililitro de água antes de colocá-las no prato.Antes de iniciar o processo de esterilização, calcule os volumes de alvejante e ácido clorídrico necessários para produzir cloro gasoso. Use a equação fornecida para obter o gás cloro recomendado de 6%. Certifique-se de calcular com precisão o volume de HCl necessário para garantir uma esterilização bem-sucedida e evitar respingos.Certifique-se de usar luvas e jaleco durante este protocolo e troque as luvas sempre que forem molhadas com ácido ou alvejante. Sob uma hotte, transfira os frascos para injetáveis de sementes para uma prateleira com as tampas abertas. Em seguida, coloque o rack em um recipiente de plástico no qual a esterilização possa ocorrer e prepare tiras de filme de parafina para selar a tampa do recipiente.Agora, carregue o copo com 100 mililitros de água sanitária e, em seguida, coloque um copo de 250 mililitros dentro. Usar um excesso de alvejante é um recurso de segurança e o copo deve ter pelo menos o dobro do volume total da solução que contém. Além disso, sempre manuseie o alvejante e os ácidos separadamente.Em seguida, adicione três mililitros de ácido clorídrico ao béquer e, em seguida, feche imediatamente o recipiente e feche-o com parafilme. Monitore o recipiente por uma hora para garantir que o gás esteja se acumulando durante a esterilização. O cloro gasoso deve ser visível como uma névoa amarela fraca dentro do recipiente ou a solução pode ser verificada quanto ao amarelo.Verifique periodicamente o lacre do recipiente. Se a tampa for desencaixada ou a vedação de parafina começar a se soltar, feche bem a tampa com uma camada adicional de filme de parafina. Após a esterilização de uma hora, abra um canto do recipiente para liberar o gás por um período de três horas.Após três horas de ventilação, tampe todos os tubos e armazene as sementes esterilizadas em condições secas até que estejam banhadas. Agora, neutralize a reação adicionando lentamente 1,5 gramas de pó de bicarbonato de sódio enquanto mexe com uma haste de vidro para dissolver os sólidos. Continue adicionando bicarbonato de sódio até que as bolhas de gás dióxido de carbono parem de se formar.Em seguida, meça o pH da solução e, se necessário, adicione mais bicarbonato de sódio até que o pH fique neutro. Desde que a solução não seja fedorenta, ela pode ser descartada. Caso contrário, espere até que todos os cheiros se dissipem.Adicione 500 microlitros de água destilada esterilizada a cada tubo de sementes esterilizadas a gás. Em seguida, despeje as sementes em uma placa de MS e espalhe-as uniformemente usando uma alça de inoculação estéril de uso único ou uma ponta de pipeta estéril. Após três dias de estratificação das sementes a quatro graus Celsius, transfira as placas para 23 graus Celsius com 16 horas de exposição diária à luz.Mantenha as tampas em cima para que as raízes cresçam no meio. Após oito dias de crescimento, marque a fração de sementes que germinaram. A germinação é contada quando o radical se projeta para fora do tegumento da semente e os dois cotilédones são visíveis.Além disso, conte o número de sementes afetadas pelo mofo para determinar a eficácia das condições de esterilização. Quatro concentrações diferentes de alvejante em cinco tempos de exposição diferentes foram testadas em sementes do tipo selvagem Columbia. Altas concentrações de alvejante afetaram negativamente a germinação com muita exposição.No entanto, altas taxas de germinação foram observadas com 40 e 50% de alvejante em todos os tempos de exposição. As sementes esterilizadas com altas concentrações de alvejante tiveram alta mortalidade e muitas vezes apresentaram defeitos de crescimento, mas geralmente eram completamente livres de mofo. A esterilização por 50% de alvejante por 10 minutos foi determinada para ter o equilíbrio ideal de inibição de fungos e germinação saudável.Para otimizar as condições de esterilização do cloro gasoso, três concentrações diferentes de cloro gasoso foram usadas para esterilizar as sementes do tipo selvagem Columbia em dois períodos de tempo diferentes. Houve uma interação significativa entre o tempo e a concentração de gás. Em uma hora, não houve efeito na germinação, enquanto a maior concentração de gás foi prejudicial em três horas.Assim, optou-se por um período de esterilização de uma hora. O crescimento de fungos foi efetivamente inibido por exposições a gás de três horas ou por exposições de uma hora usando gás de seis ou 17%. Assim, uma concentração de gás de 6% por uma hora foi determinada como ideal para germinação e inibição de fungos.Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para esterilizar com sucesso centenas de linhas de sementes por dia, se for executada corretamente. As sementes esterilizadas a gás também podem ser armazenadas por um longo período de tempo em condições secas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar as equações fornecidas para calcular os volumes necessários de HCl e alvejante.Após este procedimento, outros métodos, como estudos de associação genômica, podem ser realizados para vincular uma variedade de genótipos diferentes e os fenótipos de interesse. Boa sorte com seus experimentos.

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