Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

O objetivo geral deste procedimento é fornecer condições padronizadas para a esterilização bem-sucedida de sementes de um grande número de genótipos de Arabidopsis, evitando o crescimento microbiano. Este método permite esterilizar centenas de amostras de sementes de cada vez, simplificando assim uma etapa crítica de preparação de material vegetal nas áreas de genômica, proteômica, metabolômica e outros estudos de alto rendimento. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece condições nas quais a esterilização eficiente é combinada com uma alta taxa de germinação para um grande número de amostras de sementes.

Para começar, prepare uma solução de alvejante a 50% com água destilada. Para cada 200 mililitros de solução de alvejante, adicione 50 microlitros de detergente TWEEN 20. A solução de alvejante pode ser armazenada por até um mês, desde que seja aberta apenas em condições estéreis.

Em seguida, alíquota de 100 sementes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Isso pode ser feito manualmente ou usando um robô de sementes feito sob medida. Agora, em uma capela de fluxo laminar, adicione 500 microlitros da solução de alvejante a 50% às sementes.

Em seguida, transfira os tubos para um rotador e incube as sementes no alvejante com agitação leve por 10 minutos. Após 10 minutos, aspire a solução de alvejante dos tubos, retirando o máximo possível. Em seguida, adicione de volta 500 microlitros de água destilada estéril e inverta os tubos para misturar.

Deixe as sementes assentarem, aspire a água e substitua-a por outra alíquota para lavar as sementes novamente. Realize um total de seis dessas lavagens com água destilada esterilizada. Depois que as sementes forem bem lavadas com água, suspenda-as em um mililitro de água antes de colocá-las no prato.

Antes de iniciar o processo de esterilização, calcule os volumes de alvejante e ácido clorídrico necessários para produzir cloro gasoso. Use a equação fornecida para obter o gás cloro recomendado de 6%. Certifique-se de calcular com precisão o volume de HCl necessário para garantir uma esterilização bem-sucedida e evitar respingos.

Certifique-se de usar luvas e jaleco durante este protocolo e troque as luvas sempre que forem molhadas com ácido ou alvejante. Sob uma hotte, transfira os frascos para injetáveis de sementes para uma prateleira com as tampas abertas. Em seguida, coloque o rack em um recipiente de plástico no qual a esterilização possa ocorrer e prepare tiras de filme de parafina para selar a tampa do recipiente.

Agora, carregue o copo com 100 mililitros de água sanitária e, em seguida, coloque um copo de 250 mililitros dentro. Usar um excesso de alvejante é um recurso de segurança e o copo deve ter pelo menos o dobro do volume total da solução que contém. Além disso, sempre manuseie o alvejante e os ácidos separadamente.

Em seguida, adicione três mililitros de ácido clorídrico ao béquer e, em seguida, feche imediatamente o recipiente e feche-o com parafilme. Monitore o recipiente por uma hora para garantir que o gás esteja se acumulando durante a esterilização. O cloro gasoso deve ser visível como uma névoa amarela fraca dentro do recipiente ou a solução pode ser verificada quanto ao amarelo.

Verifique periodicamente o lacre do recipiente. Se a tampa for desencaixada ou a vedação de parafina começar a se soltar, feche bem a tampa com uma camada adicional de filme de parafina. Após a esterilização de uma hora, abra um canto do recipiente para liberar o gás por um período de três horas.

Após três horas de ventilação, tampe todos os tubos e armazene as sementes esterilizadas em condições secas até que estejam banhadas. Agora, neutralize a reação adicionando lentamente 1,5 gramas de pó de bicarbonato de sódio enquanto mexe com uma haste de vidro para dissolver os sólidos. Continue adicionando bicarbonato de sódio até que as bolhas de gás dióxido de carbono parem de se formar.

Em seguida, meça o pH da solução e, se necessário, adicione mais bicarbonato de sódio até que o pH fique neutro. Desde que a solução não seja fedorenta, ela pode ser descartada. Caso contrário, espere até que todos os cheiros se dissipem.

Adicione 500 microlitros de água destilada esterilizada a cada tubo de sementes esterilizadas a gás. Em seguida, despeje as sementes em uma placa de MS e espalhe-as uniformemente usando uma alça de inoculação estéril de uso único ou uma ponta de pipeta estéril. Após três dias de estratificação das sementes a quatro graus Celsius, transfira as placas para 23 graus Celsius com 16 horas de exposição diária à luz.

Mantenha as tampas em cima para que as raízes cresçam no meio. Após oito dias de crescimento, marque a fração de sementes que germinaram. A germinação é contada quando o radical se projeta para fora do tegumento da semente e os dois cotilédones são visíveis.

Além disso, conte o número de sementes afetadas pelo mofo para determinar a eficácia das condições de esterilização. Quatro concentrações diferentes de alvejante em cinco tempos de exposição diferentes foram testadas em sementes do tipo selvagem Columbia. Altas concentrações de alvejante afetaram negativamente a germinação com muita exposição.

No entanto, altas taxas de germinação foram observadas com 40 e 50% de alvejante em todos os tempos de exposição. As sementes esterilizadas com altas concentrações de alvejante tiveram alta mortalidade e muitas vezes apresentaram defeitos de crescimento, mas geralmente eram completamente livres de mofo. A esterilização por 50% de alvejante por 10 minutos foi determinada para ter o equilíbrio ideal de inibição de fungos e germinação saudável.

Para otimizar as condições de esterilização do cloro gasoso, três concentrações diferentes de cloro gasoso foram usadas para esterilizar as sementes do tipo selvagem Columbia em dois períodos de tempo diferentes. Houve uma interação significativa entre o tempo e a concentração de gás. Em uma hora, não houve efeito na germinação, enquanto a maior concentração de gás foi prejudicial em três horas.

Assim, optou-se por um período de esterilização de uma hora. O crescimento de fungos foi efetivamente inibido por exposições a gás de três horas ou por exposições de uma hora usando gás de seis ou 17%. Assim, uma concentração de gás de 6% por uma hora foi determinada como ideal para germinação e inibição de fungos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para esterilizar com sucesso centenas de linhas de sementes por dia, se for executada corretamente. As sementes esterilizadas a gás também podem ser armazenadas por um longo período de tempo em condições secas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar as equações fornecidas para calcular os volumes necessários de HCl e alvejante.

Após este procedimento, outros métodos, como estudos de associação genômica, podem ser realizados para vincular uma variedade de genótipos diferentes e os fenótipos de interesse. Boa sorte com seus experimentos.