Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

O objetivo geral deste protocolo é descrever o uso do peptídeo fotoativável MHC para induzir sinalização polarizada em linfócitos T. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na transdução de sinal de células imunes, como como os linfócitos transduzem sinais localizados rápidos e, em seguida, montam respostas celulares polarizadas a esses sinais. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece controle espaço-temporal da sinalização das células T.

Ele faz isso fixando a hora e o local precisos da ativação do receptor de células T. Demonstrando o procedimento estará Elisa Sanchez, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece adicionando poli-L-lisina biotinilada, ou bio-PLL, diluída de um a 500 em água destilada deionizada a uma tampa de vidro com câmara de oito poços.

Incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave com água destilada deionizada e seque por duas horas em temperatura ambiente. Bloqueie as superfícies revestidas com bio-PLL com tampão de bloqueio consistindo de solução salina tamponada com HEPES com 2% BSA por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, remova o tampão de bloqueio das superfícies revestidas com bio-PLL sem permitir que os poços sequem. Em seguida, adicione estreptavidina e incube a quatro graus Celsius. Após uma hora, lave as superfícies revestidas em HBS.

Encha e inverta os poços de deslizamento da câmara quatro a cinco vezes, removendo o HBS dos poços. Não deixe os poços secarem. Adicione o peptídeo fotoativável biotinilado específico, os principais ligantes do complexo de histocompatibilidade e as moléculas de adesão para células T CD4 positivas ou células CD8 positivas às superfícies revestidas com bio-PLL.

Proteger da luz e incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, lave como antes e deixe em HBS até que esteja pronto para semear. Finalmente, adicione 200.000 células T CD4 positivas ou CD8 positivas expressando o TCR apropriado nos poços corretos e deixe as células aderirem a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Uma vez que as células se ligam e se espalham na superfície, elas estão prontas para fotoativação e imagem. Use um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida equipado com uma lente objetiva 150X compatível com UV para aquisição de imagens. Monitore as sondas nos canais verde e vermelho usando lasers de excitação de 488 nanômetros e 561 nanômetros, respectivamente.

Depois de montar a lâmina da câmara contendo as células T, ajuste as configurações do microscópio para obter TIRF ou iluminação de epifluorescência, conforme necessário. No modo Live, selecione um campo de células que estão expressando as sondas fluorescentes de interesse. Estabeleça regiões em escala de mícron para fotoativação sob células individuais usando o controle de software.

Em seguida, inicie a aquisição. Normalmente, são necessários 80 pontos de tempo com um intervalo de cinco segundos entre cada um. Isso deixa tempo para exposições sequenciais de 488 nanômetros e 563 nanômetros no caso de experimentos de duas cores.

Em seguida, depois de adquirir 10 pontos de tempo, fotoative as regiões selecionadas abrindo o obturador de diafragma digital por um a 1,5 segundos. Após a conclusão do lapso de tempo, selecione um novo campo de células e repita o processo. Comece determinando a intensidade de fluorescência de uma região de fundo fora da célula a ser usada para correção de fundo.

Desenhe uma região quadrada do tamanho de um mícron fora da célula e faça uma máscara. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique em Analisar, Estatísticas da máscara. Selecione Intensidade média de fluorescência e exporte os valores.

Determine a intensidade de fluorescência dentro da região fotoativada para cada ponto de tempo. Selecione Máscara para destacar a região que foi fotoativada. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique em Analisar, Estatísticas da máscara.

Selecione Intensidade média de fluorescência e Exportar os valores. Obtenha as coordenadas X e Y do centro da região fotoativada selecionando Máscara para realçar a região que foi fotoativada. Depois que a região de fotoativação estiver destacada, selecione Analisar, Mascarar estatísticas, Centro da área e Exportar os valores.

Determine as coordenadas X e Y da sonda fluorescente de interesse. Selecione Rastreamento manual de partículas e clique na sonda fluorescente de interesse ao longo do tempo. Depois que todos os pontos de tempo forem rastreados, selecione Analisar, Mascarar estatísticas, Centro da área e Exportar os valores.

As células T foram anexadas a uma lamínula contendo MCC-IEFK fotoativável. C1-GFP, uma sonda para o segundo mensageiro lipídico DAG, foi fotografada usando microscopia TIRF e RFP-Tubulina no modo de epifluorescência. A fotoativação localizada da superfície abaixo da célula T induz o acúmulo de DAG na zona irradiada.

Isso é seguido em segundos pela reorientação do centrossomo para a mesma região. O acúmulo de C1-GFP pode ser quantificado calculando a intensidade de fluorescência normalizada após a correção de fundo no centro da região fotoativada ao longo do tempo. A reorientação do centrossomo em resposta à fotoativação pode ser quantificada calculando a distância entre o centrossomo e o centro da região fotoativada em função do tempo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de um dia se for executada corretamente. Normalmente, geramos de 15 a 20 filmes com lapso de tempo para análise nesse período. Essa abordagem abriu caminho para os pesquisadores explorarem a cinética precisa e a polarização da ativação da sinalização nas células T.

Também foi adaptado para estudar a sinalização inibitória em células natural killer. Como resultado, agora temos uma melhor compreensão de como as interações comunicativas das células imunes são montadas e dissolvidas.