Name: Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a ativar linfócitos T com controle espacial e temporal usando peptídeo-MHC fotoativável. Este método permite estudar a transdução de sinais localizados e respostas celulares polarizadas em imunologia.

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Agradecemos a membros do laboratório Huse para aconselhamento e assistência. Suportados pelos institutos nacionais de saúde (R01-AI087644 para MH) e P30-CA008748 ao Memorial Sloan-Kettering Cancer Center dos Estados Unidos.

1. preparação de superfícies de vidro estimulatórios
<ol><li>Casaco oito poços septada lamela com biotinilado poli-L-lisina (Bio-PLL) diluído em água destilada, deionizada (ddH2O) 1: 500. Incube durante 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavar com H2O.</li>
	<li>Seco por 2h em RT.</li>
	<li>Bloco Bio-PLL revestido de superfícies com tampão de bloqueio (HEPES salino [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], com 2% de BSA) durante 30 min à RT<ol>
<li>Dissolva 5 mg de poli-L-lysine hydrobromide em 1 mL de 10mm NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Adicionar 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotina (a partir de um estoque de 100 mg/mL em DMSO) e verificar o pH da reação. Se o pH estiver abaixo de 8,5, adicione 2 μL de 4 N NaOH para elevá-lo a entre pH 8,5 e 9,5.</li>
		<li>Vórtice por 30 min.</li>
		<li>Saciar a reação com 50 μL de 100mm glicina dissolvida em 20 mM Tris de pH 8.0.</li>
		<li>Rotação em potência máxima por 10 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Nota: Qualidade de Bio-PLL é tipicamente em comparação com anteriores preparações por revestimento dois diluíções do material em uma placa de ELISA de 96 poços e quantificar o conteúdo de biotina, após incubação com fosfatase alcalina acoplado streptavidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio. Não permita que poços secar. Adicione streptavidin (100 µ g/mL de tampão de bloqueio). Incubar durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar em HBS. Preencher e inverter poços de slide de câmara 4 - 5 vezes, removendo HBS dos poços. Não permita que poços secar.</li>
	<li>Adicione o biotinilado pMHC ligantes e moléculas de adesão à superfície. Nota: MCC e óvulos podem ser photocaged pela adição de orto-nitrobenzil com base proteger grupos (por exemplo, nitrophenylethyl (NPE) ou nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para o grupo ε-amino da chaves lisinas (K12 em MCC, K7 em óvulos). Photocaged MCC e óvulos podem ser obtidos de fornecedores comerciais. Após a reconstituição em tampão aquosa, eles são novamente em modo expressa-eu... Ek e H2-Kb utilizando abordagens estabelecida11,12.</li>
	<li>Validação de peptídeo MCC ou óvulos de photoactivatable<ol>
<li>Decage peptídeos NVOC protegido por irradiação de UV com uma lâmpada UV portátil (ver Tabela de materiais) por 20 min no RT</li>
		<li>Pulso de 1,0 x 105 APCs com 1 µM de peptídeo nonstimulatory (controlo negativo, por exemplo, Hb), não irradiados photoactivatable peptídeo, irradiados photoactivatable peptídeo e peptídeo agonista (controle positivo, por exemplo, MCC) por 1h para durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>Para estimular células T expressam a C. 5 C7/2B4/e TCR, usar células CH12 ou CH27 B. Para estimular as células T OT1, use RMA-s ou células de timoma EL4.</li>
		<li>Misture as APCs pulsados com igual número de células T em 96 poços redondo fundo placas em um volume final de 200 µ l. Incubar a 37 ° C, durante 12-24 h.</li>
		<li>Recuperar os sobrenadantes de cada poço e analisar IL-2 por ELISA com Detecção colorimétrica de peroxidase de rábano-estreptavidina. Nota: A confirmação do status de todos os peptídeos por espectrometria de massa electrospray antes de dobrar em complexos MHC, enjaulamento é altamente recomendável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o dobramento e purificação de MHC, a fim de minimizar a exposição à luz. Por exemplo, envolver reações de dobradura em papel de alumínio e realizar a cromatografia de gel filtração com a lâmpada UV. Nota: Tem sido encontrado que photoactivatable MCC-l-Ok e óvulos - H2-Kb induzem a ativação de célula independente de T UV em alta densidade, em decorrência de enjaulamento funcional incompleta. Portanto, o pMHC photoactivatable é diluída em um excesso de x de 10-30 de nonstimulatory pMHC (por exemplo, eu-Ek contendo o peptídeo de64-76 de hemoglobina (Hb)) durante a etapa de imobilização. Isso melhora a relação sinal / ruído do experimento de imagens subsequente.</li>
	<li>Para Fotoativar CD4+ T células, coletivamente, usar uma mistura de biotinilado Hb-l-Ok (3 µ g/mL), biotinilado photoactivatable MCC-l-Ok (0,1 µ g/mL) e anticorpo biotinilado contra a classe eu MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). O anticorpo anti-H2-Kk incentiva 5 C. Células C7/2B4/e T, que expressam o H2-Kk, para espalhar sobre a superfície de vidro sem sofrer ativação.</li>
	<li>Para CD8+ T células, usar uma mistura de biotinilado H2-Db o peptídeo KAVYDFATL do rolamento (1 µ g/mL), photoactivatable biotinilado óvulos-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e o domínio extracelular da molécula de adesão ICAM-1 (2 µ g/mL produzido por cultura de células de inseto13). O ICAM-1 incentiva formação próxima contato acoplando a integrina LFA1 na superfície das células T.</li>
	<li>Aplicar todas as misturas de proteínas em tampão de bloqueio, seguido de incubação por 1h no RT ou pelo menos 2 h a 4 ° C. Nota: A densidade molecular em superfícies desse tipo para ser ~ 8000 por µm2 tem sido previamente determinado6. Dado que photoactivatable pMHC representa ~1/30th da proteína biotinilado na superfície, sua densidade será ~ 267 moléculas por µm2, antes da decaging.</li>
	<li>Lave como na etapa 1.6 e deixar na HBS até estar pronto para usar.</li>
	<li>Adicionar 200.000 CD4+ ou CD8+ T células expressando o TCR apropriado em cada poço e permitir que as células a aderir a 37 ° C por 15 min. Uma vez que as células têm anexados e espalhar sobre a superfície, eles estão prontos para fotoativação e de imagem. Nota: Retroviral transdução de células efetoras T com fluorescentes sondas de imagem é descrita em detalhe elswhere6,7. Sinalização de cálcio pode também ser estudada usando pilhas de T untransduced carregadas com o corante de cálcio sensíveis Fluo-4,6. O corante ratiometric Fura-2 não é recomendado porque requer excitação na faixa de UV, que também induz decaging de pMHC a photoactivatable.</li>
</ol>2. aquisição de imagem
<ol><li>Use um microscópio invertido de TIRF equipado com uma lente objetiva de UV compatível 150 X para aquisição de imagens. UV irradiar regiões definidas pelo usuário, usando um sistema de diafragma digital ligado a uma lâmpada de mercúrio 100 W (HBO). Luz desta lâmpada para a amostra, usando um espelho de passe longo 400 nm direta UV.</li>
	<li>Use o software de análise de imagem para photoactivation localizada e aquisição de lapso de tempo. Na maioria dos experimentos, monitorar sondas em ambos os canais vermelhos e verdes usando 488 nm e 561 lasers de excitação de nm, respectivamente. Luz laser é dirigido para a amostra utilizando um espelho dicroico dual-bandpass que também transmite na faixa de UV (para habilitar decaging). Consulte a Tabela de materiais e a Figura 6 para obter informações adicionais sobre configuração de microscópio.</li>
	<li>Depois de montar o slide de câmara que contém as células T, ajuste as configurações para obter iluminação TIRF ou epifluorescência, conforme necessário. No modo de viver, selecione um campo de células que expressam a fluorescente ição de interesse. Estabelece regiões mícron-escala para photoactivation abaixo usando o software de controle de células individuais.</li>
	<li>Começa a aquisição de lapso de tempo. Normalmente, 80 momentos são adquiridos, com um intervalo de 5 s entre cada ponto de tempo. Isso deixa o tempo mais que suficiente para sequencial 488 nm e 563 exposições nm, no caso de experimentos de cor dupla.</li>
	<li>Após 10 momentos, Fotoativar as regiões selecionadas pela abertura do diafragma digital do obturador para 1-1.5 s.</li>
	<li>Após o lapso de tempo completo, selecione um novo campo de células e repita o processo.</li>
</ol>3. análise de dados
Nota: Photoactivation localizada de ligantes imobilizados cria um bem definido, estacionário estimulatórios que pode ser usado para análise quantitativa de sinalização respostas e eventos de remodelação do citoesqueleto. Análise de protocolos normalmente envolvem ou quantificar a intensidade de fluorescência na região irradiada ou usando a região irradiada como um ponto de extremidade posicional para medições de distância (por exemplo. para avaliar a polarização da centrossoma para o região irradiada). Ambos os protocolos de análise são descritos abaixo. Vários programas de análise de imagem interativo podem ser usados para fazer a intensidade e medições de distância, que podem então ser saída para processamento adicional e análise.
<ol><li>
Intensidade de fluorescência
	<ol>
<li>Determine a intensidade de fluorescência (FI) de uma região de fundo fora da célula (FIb). Isto será usado para a correção de fundo.<ol>
<li>Desenhe uma região quadrada micro-empresas fora da célula e fazer uma máscara. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação. Nota: Detalhes processuais (por exemplo, 3.1.1.1) referem-se ao software Slidebook (ver Tabela de materiais). Implementação do presente protocolo usando outros pacotes de software (ex., FIJI) será ligeiramente diferente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determine o FI dentro da região de fotoativados por cada ponto de tempo.<ol>
<li>Selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrai o fundo FI a partir dos valores medidos de FI dentro da região. Então, normalizar as medições FI corrigidas dividindo pela média, fundo corrigida FI dos primeiros 9 quadros antes de fotoativação. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: Gráfico ΔF/F como uma função do tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distância
	<ol>
<li>Obter o x e y coordenadas do centro da região fotoativados.<ol>
<li>Para determinar o x e y coordenadas do centro da região fotoativados, selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Uma vez que a região de fotoativação é realçada, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar o x e y coordenadas para a sonda fluorescente de interesse para cada ponto de tempo. Isto geralmente é conseguido através de partícula manual ou automatizada de rastreamento.<ol>
<li>Para determinar o x e y coordenadas da sonda fluorescente de interesse, selecione Manual de controle de partículas e clique sobre a sonda fluorescente de interesse ao longo do tempo. Uma vez que todos os pontos de tempo foram controlados, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular a distância entre a proteína fluorescente de interesse e o centro da região fotoativados por cada ponto de tempo usando a equação: distância = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), em que X2e y 2 são as coordenadas da proteína fluorescente de interesse e x1 e y1 são as coordenadas do centro da região fotoativados.</li>
		<li>Gráfico da distância em função do tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adicionalmente, en...

Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)1,2. A IS potencializa respostas de células T efetoras, permitindo o lançamento direcional de citocinas ou, no caso dos linfócitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruir o APC.
Noivado de TCR por pMHC induz a rápida fosforilação de várias moléculas de adaptador a jusante, incluindo o vinculador para as células de ativação de T (LAT), que, finalmente, promove a remodelação robusto do citoesqueleto sináptica2. Actina filamentosa cortical (F-Actina) conduz a célula T, espalhando sobre a superfície da APC e então resolve em uma estrutura anular caracterizada pelo acúmulo de F-Actina na periferia IS e depleção do centro. Formação de anel F-Actina é rigidamente acoplada a reorientação do centro organizador de microtúbulos (MTOC, também chamado a centrossoma em células T) para uma posição abaixo do centro da interface. Ambos os eventos ocorrem em poucos minutos de reconhecimento inicial do antígeno e estabelecer o contexto arquitetônico em que eventos de ativação subsequente e efetoras respostas ocorrem.
Para estudar a formação de IS, vários laboratórios desenvolveram abordagens em que o APC é substituído por uma superfície de vidro que contém ligantes TCR imobilizados ou suporta uma bicapa lipídica que em si contém o ligantes3,4. Células T formam IS-como contatos nestas superfícies que pode ser fotografada por microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal, permitindo estudos de alta resolução do início da ativação de células T e formação de IS.
Embora essas abordagens têm permitido para excelente visualização do IS totalmente montado, grande parte da sinalização da seguinte ligadura TCR:pMHC ocorre em segundos, complicando os esforços para determinar a sequência de eventos após a ativação de TCR com precisão . Para contornar esse problema, uma abordagem de fotoativação foi desenvolvida, em que photoactivatable pMHC é usado para obter um controlo spatiotemporal de TCR ativação5,6,7. Neste sistema, as células T estão conectadas em superfícies de vidro contendo photoactivatable pMHC que é não-estimulatório de TCR até irradiadas com luz ultravioleta (UV). Irradiação UV de uma região de mícron de tamanho da superfície abaixo da célula T remove o photocage criando uma zona estimulatório que pode ser reconhecida pela célula T. Sinalização de eventos subsequentes e remodelação do citoesqueleto são então monitorados usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Duas versões de photoactivatable de peptídeos antigênicos, traça citocromo c88-103 (MCC) e no257-264 ovalbumina (OVA), que são apresentados no contexto da classe II MHC-eu... Ek e classe de MHC H2-Kb, respectivamente, foram desenvolvido (Figura 1). Isto permite a análise de ambos CD4+ T células específicas para MCC-l-Ok (expressando o 5 C. C7, 2B4, ou e TCRs) e CD8+ T células específicas para óvulos-H2-Kb (expressando o TCR OT1).
Na última década, a abordagem de fotoativação e imagem latente de TCR tem sido utilizada para estabelecer a cinética precisa de TCR primeiros passos de sinalização e também para identificar as vias moleculares que regem a remodelação do citoesqueleto polarizada5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por exemplo, o ensaio foi fundamental na determinação que centrossoma reorientação em direção a APC é mediada por um gradiente localizado do lipídios segundo mensageiro diacilglicerol centrado no IS. Prevê-se que esta metodologia continuará a ser valioso para aplicações que exigem análise de imagens de alta resolução da função da célula T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>bromidrato de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: Kit de reação padrão de biotina-proteína ligase</td><td>BirA Avidity</td><td>BirA500</td><td>Será usado para biotinilar proteínas</td></tr><tr><td>Hb biotinilada I-EK&nbsp; </td>Para dobramento de <td></td><td></td><td>proteínas, consulte a referência 6. Para biotinilação, use o kit BirA</td></tr><tr><td>Biotinilated NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) pode ser adquirido na Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha; Anticorpo H2-Kk</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>NPE-OVA biotinilado H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) pode ser adquirido na Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>A</td><td>proteína sintetizada personalizada Anaspec (KAVYDFATL) pode ser adquirida na Anaspec</td>Biotinylated ICAM1&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Para dobramento de proteínas, consulte a referência no protocolo. Para biotinilação, use o kit BirA</td></tr><tr><td>Lâmpada UV portátil</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>A lâmpada é mantida a < 1 cm da amostra.&nbsp; 30 s de luz 365 é suficiente para decaging detectável, 20 min para decaging quantitativo.</td></tr><tr><td>Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Informações adicionais sobre o sistema de imagem podem ser encontradas em Figura 6</td></tr><tr><td>Mosaic diafragma digital</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

controle espacial e temporal da ativação de células t usando um agonista photoactivatable

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.

A abordagem de fotoativação e de imagem permite a observação e facile quantificação das respostas de sinalização rápidas, polarizadas. Para ilustrar suas capacidades, reproduzidas aqui, é um experimento examinando a spatiotemporal correlação entre acumulação de DAG TCR-induzida e de reorientação centrossoma. 5 C. Explosões de célula C7 T retrovirally foram transfectadas com dois repórteres fluorescentes: um biossensor DAG que contém os domínios de C1 em tandem da proteína quinase C-θ liga...

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever o uso do peptídeo fotoativável MHC para induzir sinalização polarizada em linfócitos T. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na transdução de sinal de células imunes, como como os linfócitos transduzem sinais localizados rápidos e, em seguida, montam respostas celulares polarizadas a esses sinais. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece controle espaço-temporal da sinalização das células T.Ele faz isso fixando a hora e o local precisos da ativação do receptor de células T. Demonstrando o procedimento estará Elisa Sanchez, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece adicionando poli-L-lisina biotinilada, ou bio-PLL, diluída de um a 500 em água destilada deionizada a uma tampa de vidro com câmara de oito poços.Incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave com água destilada deionizada e seque por duas horas em temperatura ambiente. Bloqueie as superfícies revestidas com bio-PLL com tampão de bloqueio consistindo de solução salina tamponada com HEPES com 2% BSA por 30 minutos em temperatura ambiente.Após a incubação, remova o tampão de bloqueio das superfícies revestidas com bio-PLL sem permitir que os poços sequem. Em seguida, adicione estreptavidina e incube a quatro graus Celsius. Após uma hora, lave as superfícies revestidas em HBS.Encha e inverta os poços de deslizamento da câmara quatro a cinco vezes, removendo o HBS dos poços. Não deixe os poços secarem. Adicione o peptídeo fotoativável biotinilado específico, os principais ligantes do complexo de histocompatibilidade e as moléculas de adesão para células T CD4 positivas ou células CD8 positivas às superfícies revestidas com bio-PLL.Proteger da luz e incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, lave como antes e deixe em HBS até que esteja pronto para semear. Finalmente, adicione 200.000 células T CD4 positivas ou CD8 positivas expressando o TCR apropriado nos poços corretos e deixe as células aderirem a 37 graus Celsius por 15 minutos.Uma vez que as células se ligam e se espalham na superfície, elas estão prontas para fotoativação e imagem. Use um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida equipado com uma lente objetiva 150X compatível com UV para aquisição de imagens. Monitore as sondas nos canais verde e vermelho usando lasers de excitação de 488 nanômetros e 561 nanômetros, respectivamente.Depois de montar a lâmina da câmara contendo as células T, ajuste as configurações do microscópio para obter TIRF ou iluminação de epifluorescência, conforme necessário. No modo Live, selecione um campo de células que estão expressando as sondas fluorescentes de interesse. Estabeleça regiões em escala de mícron para fotoativação sob células individuais usando o controle de software.Em seguida, inicie a aquisição. Normalmente, são necessários 80 pontos de tempo com um intervalo de cinco segundos entre cada um. Isso deixa tempo para exposições sequenciais de 488 nanômetros e 563 nanômetros no caso de experimentos de duas cores.Em seguida, depois de adquirir 10 pontos de tempo, fotoative as regiões selecionadas abrindo o obturador de diafragma digital por um a 1,5 segundos. Após a conclusão do lapso de tempo, selecione um novo campo de células e repita o processo. Comece determinando a intensidade de fluorescência de uma região de fundo fora da célula a ser usada para correção de fundo.Desenhe uma região quadrada do tamanho de um mícron fora da célula e faça uma máscara. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique em Analisar, Estatísticas da máscara. Selecione Intensidade média de fluorescência e exporte os valores.Determine a intensidade de fluorescência dentro da região fotoativada para cada ponto de tempo. Selecione Máscara para destacar a região que foi fotoativada. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique em Analisar, Estatísticas da máscara.Selecione Intensidade média de fluorescência e Exportar os valores. Obtenha as coordenadas X e Y do centro da região fotoativada selecionando Máscara para realçar a região que foi fotoativada. Depois que a região de fotoativação estiver destacada, selecione Analisar, Mascarar estatísticas, Centro da área e Exportar os valores.Determine as coordenadas X e Y da sonda fluorescente de interesse. Selecione Rastreamento manual de partículas e clique na sonda fluorescente de interesse ao longo do tempo. Depois que todos os pontos de tempo forem rastreados, selecione Analisar, Mascarar estatísticas, Centro da área e Exportar os valores.As células T foram anexadas a uma lamínula contendo MCC-IEFK fotoativável. C1-GFP, uma sonda para o segundo mensageiro lipídico DAG, foi fotografada usando microscopia TIRF e RFP-Tubulina no modo de epifluorescência. A fotoativação localizada da superfície abaixo da célula T induz o acúmulo de DAG na zona irradiada.Isso é seguido em segundos pela reorientação do centrossomo para a mesma região. O acúmulo de C1-GFP pode ser quantificado calculando a intensidade de fluorescência normalizada após a correção de fundo no centro da região fotoativada ao longo do tempo. A reorientação do centrossomo em resposta à fotoativação pode ser quantificada calculando a distância entre o centrossomo e o centro da região fotoativada em função do tempo.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de um dia se for executada corretamente. Normalmente, geramos de 15 a 20 filmes com lapso de tempo para análise nesse período. Essa abordagem abriu caminho para os pesquisadores explorarem a cinética precisa e a polarização da ativação da sinalização nas células T.Também foi adaptado para estudar a sinalização inibitória em células natural killer. Como resultado, agora temos uma melhor compreensão de como as interações comunicativas das células imunes são montadas e dissolvidas.

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Este vídeo demonstra um método de decaging de um complexo de histocompatibilidade peptídeo maior fotoativável usando irradiação UV. O processo de decaging expõe a sequência de peptídeos nativos, permitindo a ativação precisa das células T.

Avaliação da ativação controlada de células T com um peptídeo fotoativável MHC

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Aqui, é apresentado um procedimento para ativar seletivamente uma proteína neuronal com um pulso curto de luz codificando geneticamente um aminoácido não natural foto-reativo em uma proteína neuronal alvo expressa em neurônios em cultura ou in vivo.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Neste protocolo, enjaulado proteína quinase A (PKA), um bioeffector de transdução de sinal de celular, foi imobilizada em uma superfície de nanopartículas, injetada no citosol e ativada pelo upconverted UV luz de irradiação de infravermelho próximo (NIR), induzindo desintegração de fibra de stress a jusante no citosol.

Um sistema integrado para acionar remotamente a transdução do sinal intracelular por Photoactivation Upconversion Nanoparticle-mediada da quinase

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Este protocolo descreve o uso da única cadeia de MHC classe I complexos para investigar interações moleculares na ativação de células T CD8 + humana: geração de engenharia apresentadoras de celulas que expressam cadeia única constrói, cultura de clone humano de células T CD8 + e experimentos de ativação de células T.

Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 +

Este protocolo descreve a geração de quimeras misto murino da medula óssea com espontâneas centros germinativos auto-imune, na qual auto-reativas linfócitos transportar um repórter de proteína verde fluorescente (GFP-PA) photoactivatable. Isto fornece a capacidade de ligar a localização celular em tecidos com análises moleculares e funcionais a jusante.

Interrogando os centros germinativos auto-reativas individuais por Photoactivation em um modelo misto de quimérico de auto-imunidade

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

Aprenda a ativar linfócitos T com controle espacial e temporal usando peptídeo-MHC fotoativável. Este método permite estudar a transdução de sinais localizados e respostas celulares polarizadas em imunologia.

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

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