Name: Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a gerar nocautes gênicos em Danio rerio usando CRISPR/Cas9 com microinjeção em embriões e análise por heteroduplex. Este protocolo acessível permite pesquisadores de todos os níveis estudarem funções gênicas em vertebrados.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R21CA182197 de J.O.), o Ralph W. e Grace M. Showalter pesquisa confiança e pela ciência agrícola de Purdue e extensão para o programa de desenvolvimento econômico (AgSEED). Dados de sequenciamento Sanger foram adquiridos pela facilidade de Purdue Genomics Core suportada pelo P30 CA023168. Mary Witucki foi apoiado pelo centro da Universidade de Purdue para câncer verão graduação pesquisa programa de pesquisa apoiado pela Associação de câncer no Condado de Carroll. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Benjamin Carter, Ellen Denning e Taylor Sabato para fornecer feedback crítico sobre o manuscrito. Agradecemos o departamento de bioquímica para apoio deste trabalho e o centro de pesquisas de Zebrafish na Universidade de Purdue, por sua dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de zebrafish. Finalmente, agradecemos a instalação de núcleo de genômica Purdue, e contribuições de Phillip San Miguel no que respeita os serviços NGS.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve a produção dos nocautes gene no sistema de vertebrados modelo zebrafish usando tecnologia CRISPR-Cas9. Um número de protocolos anteriormente foram descrito para realizar engenharia de genoma CRISPR-mediada no zebrafish15,25,26,50,,51,,52. Este protocolo baseia-se na anteriores esforços pela combinação de um número de técnicas experimentais simples contudo reproducibly consistentes, em especial HMA e NGS de vários peixes heterozigotos, para criar um simples, econômico e experimentalmente robusto protocolo para mutagénese CRISPR-mediada no zebrafish que é apropriado para laboratórios compostos pessoal com uma gama de formação e experiência, bem como laboratórios de ensino.
Recomendações para o projeto e a síntese de RNAs estão incluídos neste protocolo de guia. Uma consideração principal na guia design do RNA é a minimização dos efeitos fora do alvo. Vários algoritmos de previsão foram desenvolvidos para permitir que os usuários CRISPR acessar ferramentas de computação com interfaces gráficas amigáveis que predizem tanto a atividade do guia no alvo e a chance de efeitos fora do alvo34, 35,36. Uma vantagem específica do sistema de zebrafish é abaixadas taxas de efeitos fora do alvo porque o Cas9 é injetado em embriões e, portanto, a expressão é transitória, que foi mostrado em ratos para resultar em diminuição da efeitos fora do alvo53. No entanto, foram demonstrados efeitos fora do alvo para ocorrer em zebrafish54. Uma forma de controle para efeitos fora do alvo é de fenótipo fundador zebrafish que foram gerados por dois RNAs de guia independente que destino o mesmo gene, como estes guias seria muito prováveis que afetam diferentes sites de fora do alvo. Um método alternativo para minimizar efeitos fora do alvo que não esteja descrito neste protocolo é o uso de um mutante Cas9 que gera único quebras no DNA, alvo que são reparadas com alta eficiência. Cortes de DNA dentro de proximidade um do outro que são complementares para o oposto de emparelhamento vertentes resultados na formação eficaz indel no locus desejado e minimiza os efeitos fora do alvo55,56.
Além de ter diferentes taxas de efeitos fora do alvo, sgRNAs diferentes podem ter diferentes taxas de mutagênese do alvo desejado57,58,59. Este protocolo utiliza HMA para analisar a eficiência de mutagênese de um determinado sgRNA usando doheteroduplex banda formação33,40. Doheteroduplex bandas são criadas por hibridação de geradas por PCR de DNA que contêm inadequações e pode ser facilmente resolvido usando electroforese em gel. Ao contrário de outros métodos comumente usados para medir a indel formação, tais como a endonuclease T7 ensaio ou alta resolução derreter análise25,26, HMA não requer uma enzima cara para cortar DNA incompatível e não requer complicada análise de PCR derreter as curvas. Importante, usar HMA para verificar taxas elevadas da indel formação na população injetada também permite que o investigador minimizar o número de peixes necessários para a produção subsequente de linhas de mata-mata, o que reduz o custo de identificar uma mutação com o características desejadas.
A relativa facilidade de gerar puntuais CRISPR-base permite a criação de múltiplos alelos de vários genes ao mesmo tempo. Software baseado em Web está disponível para análise de mutações única de peixes heterozigotos usando Sanger sequenciamento dos produtos PCR49. No caso onde analisam-se três ou mais alelos CRISPR-mutado, NGS para caracterizar a natureza da indel é provável ser mais rentável para caracterizar a natureza da indel como essa abordagem permite que uma piscina de até 50 diferentes alelos para ser caracterizado em ó NCE (ver Tabela de materiais)60,61,62. Essa economia de escala provavelmente seria particularmente útil em um ambiente de laboratório de graduação.
Em resumo, este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar reproducibly CRISPR-reagentes de alta qualidade (em particular, sgRNA), tal que menos peixes adultos precisam ser criados e analisados para identificar com sucesso os alelos mutantes de interesse, que também reduz o tempo e o custo de gerar as linhas desejadas. Importante, este protocolo foi projetado tais que pode ser aplicado por laboratórios com recursos limitados para produzir o peixe-zebra mutante de forma acessível. Além disso, descobrimos que essa abordagem é apropriada para alunos de graduação e assim expande as oportunidades de educação e formação de alunos de graduação interessados em experiência hands-on no genoma CRISPR-baseado de edição.

A conservação de máquinas moleculares em eucariontes subjaz o poder do uso de organismos modelo para pesquisa. Muitos destes sistemas modelo facilitam a utilização de abordagens reverso-genética como nocautes alvejado do gene para caracterizar a contribuição de um produto do gene de um processo biológico ou doença de interesse. Técnicas de perturbação genética em organismos como o zebrafish historicamente têm confiado na introdução alvo de mutações frameshift resultantes da reparação imprecisa de DSBs1,2. Quando um ORL é introduzido no genoma, a lesão de DNA é reparada através de um dos dois caminhos que estão universalmente presentes em quase todos os tipos de células e organismos: não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR)3,4 . A natureza imprecisa da maquinaria NHEJ frequentemente produz puntuais de vários comprimentos5,6,7,8,9. Introdução de mutações frameshift, na sequência de codificação de um gene pode produzir um codão stop prematuro, que muitas vezes torna o gene não-funcionais.
Primeiras estratégias de engenharia do genoma no zebrafish para promover puntuais incluíam meganucleases, nucleases de zinco-dedo e nucleases de ativador, como efetoras transcrição, os quais utilizaram interações DNA-proteína para direcionar uma nuclease para um determinado genoma destino onde introduziu um ORL10,11,12,13,14,15. No entanto, essas tecnologias são muitas vezes difíceis de aplicar devido a trabalhosa e complexa engenharia necessária para gerar uma nuclease que tem como alvo a sequência de DNA de interesse. Ao contrário de estratégias anteriores, baseadas em CRISPR gene edição não depende de interações proteína-ADN para o direcionamento. Em vez disso, a endonuclease CRISPR-associado (Cas) é direcionado por meio de um guia de RNA que usa base de interações de emparelhamento de nucleotídeos para direcionar um site genômico de interesse16,17,18,19 ,20,21. Devido à simplicidade de projetar um RNA guia com a base desejada emparelhamento interações para o direcionamento é relativamente fácil de direcionar a endonuclease de Cas para o local desejado. O tipo II CRISPR sistema em particular foi amplamente desenvolvido para aplicações de edição de genoma devido a várias características vantajosas, incluindo o uso de um único vários domínios Cas nuclease (Cas9) que requer a interação com o DNA de estimular a atividade endonuclease e uso de um único guia do RNA (sgRNA) para destiná-las para o cognato de sequência de DNA18. Os requisitos de sequência necessários para o direcionamento do cognato sgRNA são bem compreendido,19, e o sgRNA desejado é facilmente gerado pela transcrição em vitro . A simplicidade e robustez da abordagem CRISPR/Cas9 facilita grandemente a modificação genética direcionada no zebrafish e uma grande variedade de outros organismos.
A capacidade avançada de empreender genoma alvo edição no zebrafish como resultado de desenvolvimento baseado em CRISPR reagentes tem significativamente aumentado a oportunidade de estudar processos emblemáticos de organismos vertebrados tais como desenvolvimento do nervoso central sistema. O genoma de zebrafish contém orthologs de 70% dos genes codificantes de proteínas encontrados no genoma humano bem como 84% dos genes associados a doenças em seres humanos22. Desenvolvimento de zebrafish exibe várias qualidades-chave que melhoram a sua utilização em estudos de genéticas reversos: os embriões são colocados em grandes garras, desenvolvem-se externamente da mãe tornando-os passíveis de genética manipulação por microinjeção e adultos do zebrafish sexualmente maduros por 3 meses de idade, permitindo a rápida propagação de linhas desejado23.
Existem inúmeros protocolos que descrevem uma variedade de abordagens para gerar e identificar puntuais CRISPR-derivado no zebrafish24,25,26,,27,28,29 ,30,31. No entanto, muitos desses procedimentos são tempo intensivo, requerem acesso a equipamentos caros e podem ser um desafio para laboratórios com experiência limitada. As etapas descritas neste documento fornecem uma simples, robusta e econômica CRISPR/Cas9-estratégia para engenheiro zebrafish nocaute linhas. Este protocolo descreve o uso de um kit altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleotídeos de DNA (oligos), semelhante a outras abordagens que foram anteriormente descritas32. O protocolo descrito inclui duas etapas em particular que simplificar a análise das linhas CRISPR-mutação: passo a passo uso do HMA baseados em PCR33 para determinar facilmente a presença de modificações do genoma e análise de sequenciamento de zebrafish heterozigoto para rapidamente e facilmente determinar a natureza do múltiplo puntuais de forma econômica. Além disso, instruções passo a passo são incluídas para seleção robusta, confiável produção e injeção de guia RNAs. As etapas fornecidas aqui exemplificam um protocolo robusto, relativamente barato que permite que o pessoal de laboratório com uma gama de conhecimentos contribuir para a identificação dos nocautes gene no zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Software de análise de sgRNA</td> <td>CRISPOR</td><td></td><td></td>. http://crispor.tefor.net/</tr> <tr><td>Software de análise de sgRNA</td> <td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td>. https://omictools.com/breaking-cas-tool</tr><tr>Software de <td>análise de sgRNA</td> <td>ChopChop</td><td></td><td></td>. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</tr> <tr>Design de <td>primer de PCR</td> <td>Primer 3</td><td></td><td></td>. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</tr><tr>Técnica <td></td><td></td><td>livre de Rnase</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>água livre de RNase</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Síntese de RNAs guia. Thermo Fisher e Qiagen transportam água adequada.</td></tr><tr><td>Etanol sem Rnase</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>de etanol de grau de biologia molecular é livre de Rnase. Fischer, VWR vendem etanol adequado.</td></tr><tr><td>Proteína Cas9 PNA</td><td>Bio</td><td>CP01</td><td>Proteína Cas9 com sinal de localização nuclear.</td></tr><tr><td>Oligos específicos do alvo</td><td>Tecnologias integradas de DNA (IDT)</td><td></td><td>Sintetizar RNAs guia.</td></tr><tr><td>Primers de PCR flanqueando o local de corte de RNA</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Use para análise heteroduplex, produto de 100-300 pb.</td></tr><tr><td>Primers de PCR guia de flanqueamento Local de corte de RNA</td><td>Tecnologias de DNA Integradas (IDT)</td><td></td><td>Uso para sequenciamento de alelos CRISPR, produto de 300-600 pb recomendado.</td></tr><tr><td>Kit de Síntese de sgRNA EnGen</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>RNAs guia de transcrição in vitro.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>Tampão livre de RNase para eletroforese de ácidos nucleicos.</td></tr><tr><td>6X Carregar Corante</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Carregando DNA para eletroférese.</td></tr><tr><td>5M Acetato de amônio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Reagente de limpeza para purificação de RNAs guia.</td></tr><tr><td>Etanol (200 provas, sem nuclease)</td> <td>Qualquer marca</td><td></td><td>Reagente de limpeza para purificação de RNAs guia. Os materiais de grau molecular são livres de RNase.</td></tr><tr><td>Água sem nuclease</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para síntese e purificação de RNAs guia.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Elimina a contaminação por RNase de superfícies, equipamentos, vidraria.</td></tr><tr><td>Escada de DNA, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Padrões de peso molecular para eletroforese em gel de DNA.</td></tr><tr><td>Escada de DNA, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Padrões de peso molecular para eletroforese em gel de DNA.</td></tr><tr><td>Escada de RNA</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Marcador de RNA de fita simples para verificar se o sgRNA de comprimento total foi sintetizado</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Gel de poliacrilamida de fundição.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Gel de poliacrilamida de fundição.</td></tr><tr><td>40% Poliacrilamida (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Fundição de gel de poliacrilamida desnaturante.</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Fundição gel de poliacrilamida desnaturante.</td></tr><tr><td>Corante de carregamento de gel de RNA (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Guia de carregamento de RNA em gel desnaturante para eletroforese.</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualização de ácidos nucléicos.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Método alternativo ao brometo de etídio para detecção de dsDNA em géis de agarose ou poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA limpa, purificação de PCR.</td></tr><tr><td>MyTaq Polimerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Para amplificação de DNA usando PCR.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>de amplificação de PCR.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>NanoDrop ou produto relacionado para quantificar a quantidade de DNA / RNA.</td></tr><tr><td>Meios de embriões E3</td><td>Feitos em casa</td><td></td><td>Meios para criar embriões e fazer placas de injeção. Receita: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Azul de Metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Adicionado a 1x meio E3 para prevenir o crescimento de fungos em embriões.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Armazenar embriões, placa de injeção fundida.</td></tr><tr><td>Placa</td> de injeção de fundição <td>Agarose Denville</td><td>CA3510-8</td><td>, géis de agarose.</td></tr><tr><td>Molde de microinecção</td><td>Ferramentas científicas adaptáveis</td><td>TU-1</td><td>Para criar poços para conter embriões durante a injeção.</td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Corante para visualização da injeção.</td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Para calibrar o volume de injeção da agulha.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Movendo embriões.</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Agulha de injeção de corte, corte de cauda de peixes adultos.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Manutenção de embriões a 28,5 oC.</td></tr><tr><td>Extrator de pipetas vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Agulhas de geneato para injeção. Instruções adicionais de tração da agulha: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Agulhas de geneato para injeção.</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregadores</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Carregue a solução em agulhas de injeção.</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Injetando embriões.</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td></td><td>Injetando embriões.</td></tr><tr><td>30% Poliacilamida (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Fundição em gel heteroduplex.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricocaína)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Anestesiar peixe-zebra para corte de cauda e extração de gDNA de embriões. Receita: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Placa de injeção de fundição, géis de agarose.</td></tr><tr><td>Escala</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Placa de injeção de fundição, géis de agarose.</td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para expelir líquido do capilar para injeção de embriões.</td></tr><tr><td>1.000 &micro; L&nbsp; dicas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>200 &micro; L dicas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>10 &micro; L dicas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>Tubos de tiras de PCR</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para todos os aspectos do protocolo.</td></tr><tr><td>Plataforma de sequenciamento NGS: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Se sua instituição não oferece este serviço, visite: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Custo externo: $ 35).</td></tr><tr><td>Software para análise</td><td></td><td></td> de seqüência <td>Para seqüenciamento de Sanger de peixes heterozigotos. Visite: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Software para análise</td><td></td><td></td> de sequência, <td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner para análise de sequenciamento NGS.</td></tr></tbody></table>

produção eficiente e identificação de crispr/cas9 gerado pelo gene nocautes no sistema modelo danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Caracterização do cluster, regularmente intercaladas, curto, palíndromo repetir sistema (CRISPR) de Streptococcus pyogenes permitiu o desenvolvimento de uma plataforma personalizável para gerar rapidamente as modificações do gene em uma ampla variedade de organismos, incluindo o zebrafish. Edição baseada em CRISPR genoma usa um guia único RNA (sgRNA) para atingir uma endonuclease CRISPR-associado (Cas) para um destino de DNA (gDNA) genômico de interesse, onde a endonuclease Cas gera uma ruptura da dobro-Costa (DSB). Reparação de DSBs por chumbo mecanismos propenso para inserções e/ou exclusões (puntuais). Isso pode causar mutações frameshift que frequentemente introduzir um códon de parada prematuro dentro da sequência de codificação, criando assim um alelo de proteína-nulo. Baseado em CRISPR genoma engenharia requer apenas alguns componentes moleculares e é facilmente introduzida zebrafish embriões por microinjeção. Este protocolo descreve os métodos usados para gerar os reagentes CRISPR para microinjeção de zebrafish e identificar peixes exibindo germline transmissão de genes CRISPR-modificado. Estes métodos incluem transcrição in vitro de sgRNAs, microinjeção de reagentes CRISPR, identificação de puntuais induzida no local de destino usando um método baseado em PCR, chamado um ensaio de mobilidade doheteroduplex (HMA) e caracterização do puntuais usando uma taxa de transferência baixa e um poderoso sequenciamento de próxima geração (NGS)-com base em abordagem que pode analisar múltiplos produtos PCR coletados de peixes heterozigotos. Este protocolo é aerodinâmico para minimizar o número de peixes necessários e os tipos de equipamentos necessários para realizar as análises. Além disso, este protocolo é projetado para ser favorável para utilização pelo pessoal do laboratório de todos os níveis de experiência, incluindo alunos de graduação, permitindo que esta poderosa ferramenta ser empregado economicamente por qualquer grupo de pesquisa interessado em executar baseado em CRISPR modificação de genômica no zebrafish.

As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a produção eficiente e econômica de linhas de nocaute de zebrafish usando CRISPR/Cas9 tecnologia. As figuras a seguir foram incluídas neste artigo para facilitar a interpretação e solução de problemas dos resultados obtidos usando este protocolo. Após a produção bem sucedida e microinjeção de CRISPR-reagentes, os embriões de peixe-zebra podem ser analisados para fenótipos ostensivos e formação indel usando HMA. Um controle útil para visualizar o sucesso da CRISPR-experiência é o uso do sgRNA descrito na etapa 1.5 para alvejar o gene produtoras de pigmentos tirosinase. Formação induzida por Cas9 indel em tirosinase resulta em perda de pigmentação e é facilmente marcada por 48 hpf (Figura 1). Outro controle útil para assegurar que a preparação dos reagentes-CRISPR para injeção tem sido bem sucedida, é verificar que completos (120 nt) sgRNA tem sido sintetizado usando um gel de polyacrylamide desnaturalização (Figura 2, faixa 1 e 2). Se o RNA foi degradado pode parecer como uma mancha, por exemplo 3 Lane (Figura 2) mostra o RNA degradado que não é adequado para injeção.
Para analisar a frequência de formação indel de genes alvejado de CRISPR-Cas9 que não resultam em fenótipos evidentes, como a tirosinase, HMA análise é um método simples e confiável. sgRNA/Cas9 injetado embriões analisados usar HMA resulta na formação de bandas de doheteroduplex e redução da intensidade da banda homoduplex (Figura 4). A presença de bandas de doheteroduplex é mais utilizada neste protocolo para identificar potenciais peixe fundador de embriões microinjected e como adultos (Figura 4 e Figura 5), para analisar a eficiência de transmissão do germline do fundador ( Figura 6) e para verificar a presença de um indel em um peixe heterozigoto de F1 (Figura 7). Os peixes heterozigotos que contêm um indel são candidatos para NGS para identificar a natureza da indel e determinar se um códon de parada prematuro está presente na região codificante do gene alvo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Figura 1 : Zebrafish embriões apresentam um defeito de pigmento quando injetado com um direcionamento tirosinase na fase de uma célula de sgRNA. (A) selvagem-tipo, uninjected embrião 48 hpf e (B) injetado embrião 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Figura 2 : Transcrição in vitro de sgRNA usando o kit de síntese. Oligos foram sintetizados usando em vitro transcrição de acordo com as instruções de kit de síntese sgRNA. 500 ng do RNA foi executado em um gel de ureia/página conforme descrito. sgRNA carregado nas pistas 1 e 2 mostra uma banda correspondente ao comprimento cheio, intacta 120 nt RNA. O sgRNA na pista 3 mostra um exemplo de RNA degradado que não é adequado para injeção.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Figura 3 : Comparação da saúde de 24 embriões hpf injetado. Um embrião de vida (A) desenvolvido para 24 hpf, facilmente se distingue de um embrião que foi anulada desenvolvimento (B). Embriões que se assemelham a (B) ou tem drasticamente alteraram características para (A), tais como a curvatura da coluna vertebral ou alteraram a cabeça e o desenvolvimento do olho deve ser removido do prato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Figura 4 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de sgRNA-Cas9 injetadas embriões zebrafish. Piscinas de 5 embriões por amostra foram coletadas em 72 hpf e gDNA foi extraído. Doheteroduplex a análise foi realizada conforme descrito, as amostras foram carregadas igualmente com 500 ng de DNA. Pistas: M = 100 marcador bp; 1 = controle uninjected; 2 = injeção amostra 1; 3 = amostra injeção 2. Espera-se tamanho de banda = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Figura 5 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de gDNA extraído do rabo de um adulto CRISPR-injetado zebrafish. Os embriões que foram injetados com um sgRNA e proteína Cas9 foram cultivados à idade adulta (3 meses). Peixe B e C apresentam bandas doheteroduplex e posteriormente foram criados para identificar puntuais germline transmitido; peixe A não foi usado na análise posterior, pois não apresentam uma banda de doheteroduplex positivo. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe A; 3 = peixe B; 4 = tamanho de banda peixe C. esperado = 98 BP <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Figura 6 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de embriões único gerado pela reprodução um zebrafish F0 CRISPR-injetado para um peixe selvagem-tipo para identificar germline transmitido puntuais. Zebrafish foram acasaladas e os embriões de F1, produção de embriões único de 72 h. foram coletados e doheteroduplex análise realizada conforme descrito. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2-10 = um único embrião F1 por faixa. Este gel mostra que 7 de 10 embriões mostram uma banda doheteroduplex positiva, indicando uma taxa de transmissão do germline de 70% da indel. Espera-se tamanho de banda = 98 BP <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Figura 7 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de clipes de cauda adultos F1 zebrafish. Peixes adultos de F1 foram marcados por HMA para identificar puntuais. Peixes que exibiram uma banda doheteroduplex positivos foram PCR amplificados e enviada para análise de sequenciamento de ampla para determinar a natureza da mutação. (A) pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe uma (4 bp exclusão, 1 incompatibilidade de bp). (B) estes F1 peixes foram identificadas a partir do mesmo fundador e ainda mostram diferente doheteroduplex, padronização, indicando transmissão germline de múltiplos alelos modificados de um único fundador. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe B (4 inserção de bp, incompatibilidade de bp 7), 3 = peixe C (4 bp de exclusão, incompatibilidade de bp 4). Cada um destes puntuais criou um códon de parada prematuro na sequência de codificação do gene alvo, conforme determinado pela NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a edição do genoma direcionada usando a tecnologia CRISPR / Cas9 em peixe-zebra para projetar nocautes genéticos de maneira robusta e barata. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o papel biológico de um gene no contexto de um sistema modelo de vertebrados, como a forma como um gene contribui para os processos de desenvolvimento em eucariotos de ordem superior. Com esses procedimentos simples e robustos, o pessoal de laboratório de todos os níveis de experiência, incluindo alunos de graduação, pode realizar modificações genômicas direcionadas no peixe-zebra.Indivíduos novos neste método devem ser capazes de seguir as instruções passo a passo para identificar alvos genômicos ideais para mutagênese CRISPR, realizar microinjeção de embrião de peixe-zebra e identificar alelos modificados. A demonstração visual desse método é crítica, pois esse método se destina a alunos de graduação que podem não estar familiarizados com uma ou mais das técnicas necessárias. Diretrizes para o design de oligos específicos do modelo para produção de RNA guia são fornecidas no protocolo de texto.Para começar, suspenda a proteína Cas9 no tampão para gerar uma solução de um miligrama por mililitro. Conservar esta solução em alíquotas prontas para injeção a 80 graus Celsius negativos para utilização posterior. Em seguida, sintetize o sgRNA com um kit de transcrição in vitro como o sugerido nos materiais deste artigo de acordo com as instruções do fabricante.Purifique o sgRNA sintetizado usando uma precipitação de acetato de amônio livre de RNAse. Adicione 25 microlitros de acetato de amônio de cinco molares ao RNA sintetizado e misture a solução por vórtice. Em seguida, adicione 150 microlitros de etanol livre de nuclease 200 à prova à amostra.E coloque a reação em um freezer de 80 graus Celsius negativos por pelo menos 20 minutos. Em seguida, centrifugue as amostras na velocidade máxima. Use uma pipeta para remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet de RNA.Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 70% e inverta o tubo várias vezes para lavar o sal residual do tubo. Centrifugue novamente na velocidade máxima a quatro graus Celsius por sete minutos. Use uma pipeta P1000 para remover a maior parte da solução.Em seguida, use uma pipeta P200 para remover o máximo da solução restante sem perturbar o pellet. Tomando cuidado para evitar a contaminação por RNAse, seque o pellet em um espaço limpo até que não haja gotas de líquido visíveis no tubo. Ressuspender o pellet em 30 microlitros de água livre de RNAse e utilizar um espectrofotómetro para quantificar o produto.Alíquota a solução para armazenamento de longo prazo a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, misture 300 a 500 nanogramas de sgRNA com um volume igual de corante de carregamento de gel de RNA 2X. Em seguida, usando uma pipeta P1000, limpe cada um dos poços de gel de agarose de detritos com tampão corrente várias vezes.Carregue as soluções nos poços de gel de agarose e execute o gel a 10 volts por centímetro por tempo suficiente para separar as bandas de RNA no gel. O tempo pode variar de acordo com o aparelho de eletroforese. Em geral, a frente do corante deve ser executada até 2/3s do comprimento do gel.Em seguida, use uma coloração de ácido nucleico para visualizar as bandas. O RNA intacto aparece como uma única banda, como nas pistas um e dois mostradas aqui. O RNA degradado é executado como um esfregaço, como na pista três.Primeiro, prepare os peixes-zebra para reprodução na noite anterior à realização das injeções, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, combine a proteína Cas9 e o sgRNA em uma proporção de dois para um. Incube a solução à temperatura ambiente por cinco minutos enquanto o Cas9 e o sgRNA formam um complexo de ribonucleoproteínas.Em seguida, adicione 0,5 microlitros de soluções de vermelho de fenol a 2,5% em água livre de RNAse suficiente para atingir um volume final de cinco microlitros. Para preparar a agulha de injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro de um milímetro. Em seguida, corte a ponta da agulha de vidro resultante com uma lâmina de barbear para obter uma abertura angular.Coloque a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor. Usando um microscópio óptico, ajuste a pressão de injeção até que a agulha injete consistentemente um nanômetro de solução na placa de Petri. Antes de realizar a microinjeção de embriões, pratique a preparação de agulhas e a injeção de embriões de controle usando uma solução apenas de corante e registre a sobrevivência após 24 horas de desenvolvimento.Você deve ser capaz de obter mais de 90% de sobrevivência em comparação com um controle não injetado. Em seguida, selecione de 10 a 15 embriões como uma população de controle e coloque-os em uma placa de Petri rotulada separada. Usando uma pipeta de transferência, alinhe cuidadosamente os embriões restantes em uma placa de injeção em temperatura ambiente.Sob um microscópio de dissecação, injete um nanolitro da solução no saco vitelino de cada embrião. Em seguida, retorne os embriões injetados a uma placa de Petri rotulada e cubra-os com meio 1X E3 com azul de metileno. Coloque os embriões injetados em uma incubadora a 28 graus Celsius por 24 horas.Em seguida, inspecione os embriões injetados para remover indivíduos mortos ou com desenvolvimento anormal. Primeiro, colete dois conjuntos de cinco embriões de 72 horas das placas contendo embriões injetados e um conjunto de cinco embriões de 72 horas do grupo de controle não injetado nos tubos de microcentrífuga. Pipete suavemente a mídia de cada conjunto de embriões e anestesiá-los.Remova o anestésico após dois minutos e adicione 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolar. Em seguida, incube as amostras a 95 graus por 10 minutos. Em seguida, remova as amostras da incubadora e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.Adicione cinco microlitros de um cloridrato de tris de pH molar e vortex as amostras vigorosamente. Em seguida, centrifugue a solução na velocidade máxima à temperatura ambiente durante três minutos. Transfira o sobrenadante que contém o DNA genômico para um novo tubo marcado e armazene o gDNA a menos 20 graus Celsius.Use os primers projetados para amplificar em torno da região alvo do sgRNA, conforme descrito no texto, para amplificar um fragmento de PCR para análise heteroduplex. Use um kit de limpeza de PCR para purificar os produtos da reação de PCR. Diluir as amostras em 30 microlitros de água e usar um espectrofotômetro para quantificar o DNA.Coloque os tubos contendo os amplicons de PCR em um rack flutuante em banho-maria fervente. Em seguida, prepare um gel TBE de poliacrilamida a 15% usando poliacrilamida a 30%. Depois que o gel endurecer, coloque-o em um aparelho de eletroforese com tampão de execução TBE.Em seguida, carregue 500 nanogramas dos produtos de PCR recozidos e carregue um controle próximo a cada conjunto de amostras de sgRNA. Execute o gel a 150 volts por duas horas e meia ou até que a frente do corante esteja na parte inferior do gel. Cresça embriões de peixe-zebra injetados até a idade adulta que mostram bandas heteroduplex no HMA.Para interpretar o HMA, compare a intensidade da banda homoduplex da PCR do controle não injetado do tipo selvagem com as amostras injetadas correspondentes. Se tiver ocorrido um corte suficiente, a intensidade da faixa do peixe injectado deve ser aproximadamente 50% inferior à do controlo de tipo selvagem. Para confirmar a presença de indels em potenciais peixes fundadores fundadores, anestesie os peixes com 0,004% de tricaína e use uma lâmina de barbear limpa para remover 1/2 a 3/4 da barbatana caudal.Em seguida, coloque a cauda em 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares. Retorne o peixe a um tanque de recuperação e execute a extração de gDNA conforme descrito anteriormente. Em seguida, execute um HMA no gDNA do clipe da cauda para determinar se o indivíduo foi modificado com sucesso pela injeção de CRISPR.Em seguida, cruze os adultos que exibem bandas heteroduplex no DNA da cauda com peixes do tipo selvagem. Selecione peixes fundadores para gerar peixes F1 com base na análise HMA de piscinas. Finalmente, sequenciar o gDNA do peixe de interesse para caracterizar a natureza do indel.Após a produção e microinjeção bem-sucedidas de reagentes CRISPR, os embriões de peixe-zebra foram analisados quanto a fenótipos evidentes e formação de indel usando HMA. A formação de indel induzida por Cas9 na tirosinase resulta em perda de pigmentação e é facilmente pontuada 48 horas após a fertilização. A identificação de alelos modificados por CRISPR que não resultam em fenótipos de desenvolvimento evidentes é realizada usando HMA.O direcionamento bem-sucedido do gene de interesse resulta na formação de bandas heteroduplex e redução da intensidade da banda homoduplex, como nas pistas três e quatro. Não se esqueça de que trabalhar com um organismo vertebrado acarreta responsabilidades éticas. Este protocolo descreve estratégias que minimizam o número de zebrafish necessários para obter um nocaute, um objetivo que deve ser levado em consideração durante a realização deste procedimento.Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para gerar e identificar rapidamente peixes-zebra portadores de alelos modificados por CRISPR que serão transmitidos na linha germinativa com alta eficiência. É importante ressaltar que essa técnica foi otimizada para ser uma abordagem de baixo custo acessível a alunos de graduação e outros com pouca experiência anterior. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e implementar facilmente uma abordagem de nocaute genético baseada em CRISPR usando peixe-zebra.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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