Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

O objetivo geral deste procedimento é realizar a edição do genoma direcionada usando a tecnologia CRISPR / Cas9 em peixe-zebra para projetar nocautes genéticos de maneira robusta e barata. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o papel biológico de um gene no contexto de um sistema modelo de vertebrados, como a forma como um gene contribui para os processos de desenvolvimento em eucariotos de ordem superior. Com esses procedimentos simples e robustos, o pessoal de laboratório de todos os níveis de experiência, incluindo alunos de graduação, pode realizar modificações genômicas direcionadas no peixe-zebra.

Indivíduos novos neste método devem ser capazes de seguir as instruções passo a passo para identificar alvos genômicos ideais para mutagênese CRISPR, realizar microinjeção de embrião de peixe-zebra e identificar alelos modificados. A demonstração visual desse método é crítica, pois esse método se destina a alunos de graduação que podem não estar familiarizados com uma ou mais das técnicas necessárias. Diretrizes para o design de oligos específicos do modelo para produção de RNA guia são fornecidas no protocolo de texto.

Para começar, suspenda a proteína Cas9 no tampão para gerar uma solução de um miligrama por mililitro. Conservar esta solução em alíquotas prontas para injeção a 80 graus Celsius negativos para utilização posterior. Em seguida, sintetize o sgRNA com um kit de transcrição in vitro como o sugerido nos materiais deste artigo de acordo com as instruções do fabricante.

Purifique o sgRNA sintetizado usando uma precipitação de acetato de amônio livre de RNAse. Adicione 25 microlitros de acetato de amônio de cinco molares ao RNA sintetizado e misture a solução por vórtice. Em seguida, adicione 150 microlitros de etanol livre de nuclease 200 à prova à amostra.

E coloque a reação em um freezer de 80 graus Celsius negativos por pelo menos 20 minutos. Em seguida, centrifugue as amostras na velocidade máxima. Use uma pipeta para remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet de RNA.

Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 70% e inverta o tubo várias vezes para lavar o sal residual do tubo. Centrifugue novamente na velocidade máxima a quatro graus Celsius por sete minutos. Use uma pipeta P1000 para remover a maior parte da solução.

Em seguida, use uma pipeta P200 para remover o máximo da solução restante sem perturbar o pellet. Tomando cuidado para evitar a contaminação por RNAse, seque o pellet em um espaço limpo até que não haja gotas de líquido visíveis no tubo. Ressuspender o pellet em 30 microlitros de água livre de RNAse e utilizar um espectrofotómetro para quantificar o produto.

Alíquota a solução para armazenamento de longo prazo a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, misture 300 a 500 nanogramas de sgRNA com um volume igual de corante de carregamento de gel de RNA 2X. Em seguida, usando uma pipeta P1000, limpe cada um dos poços de gel de agarose de detritos com tampão corrente várias vezes.

Carregue as soluções nos poços de gel de agarose e execute o gel a 10 volts por centímetro por tempo suficiente para separar as bandas de RNA no gel. O tempo pode variar de acordo com o aparelho de eletroforese. Em geral, a frente do corante deve ser executada até 2/3s do comprimento do gel.

Em seguida, use uma coloração de ácido nucleico para visualizar as bandas. O RNA intacto aparece como uma única banda, como nas pistas um e dois mostradas aqui. O RNA degradado é executado como um esfregaço, como na pista três.

Primeiro, prepare os peixes-zebra para reprodução na noite anterior à realização das injeções, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, combine a proteína Cas9 e o sgRNA em uma proporção de dois para um. Incube a solução à temperatura ambiente por cinco minutos enquanto o Cas9 e o sgRNA formam um complexo de ribonucleoproteínas.

Em seguida, adicione 0,5 microlitros de soluções de vermelho de fenol a 2,5% em água livre de RNAse suficiente para atingir um volume final de cinco microlitros. Para preparar a agulha de injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro de um milímetro. Em seguida, corte a ponta da agulha de vidro resultante com uma lâmina de barbear para obter uma abertura angular.

Coloque a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor. Usando um microscópio óptico, ajuste a pressão de injeção até que a agulha injete consistentemente um nanômetro de solução na placa de Petri. Antes de realizar a microinjeção de embriões, pratique a preparação de agulhas e a injeção de embriões de controle usando uma solução apenas de corante e registre a sobrevivência após 24 horas de desenvolvimento.

Você deve ser capaz de obter mais de 90% de sobrevivência em comparação com um controle não injetado. Em seguida, selecione de 10 a 15 embriões como uma população de controle e coloque-os em uma placa de Petri rotulada separada. Usando uma pipeta de transferência, alinhe cuidadosamente os embriões restantes em uma placa de injeção em temperatura ambiente.

Sob um microscópio de dissecação, injete um nanolitro da solução no saco vitelino de cada embrião. Em seguida, retorne os embriões injetados a uma placa de Petri rotulada e cubra-os com meio 1X E3 com azul de metileno. Coloque os embriões injetados em uma incubadora a 28 graus Celsius por 24 horas.

Em seguida, inspecione os embriões injetados para remover indivíduos mortos ou com desenvolvimento anormal. Primeiro, colete dois conjuntos de cinco embriões de 72 horas das placas contendo embriões injetados e um conjunto de cinco embriões de 72 horas do grupo de controle não injetado nos tubos de microcentrífuga. Pipete suavemente a mídia de cada conjunto de embriões e anestesiá-los.

Remova o anestésico após dois minutos e adicione 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolar. Em seguida, incube as amostras a 95 graus por 10 minutos. Em seguida, remova as amostras da incubadora e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.

Adicione cinco microlitros de um cloridrato de tris de pH molar e vortex as amostras vigorosamente. Em seguida, centrifugue a solução na velocidade máxima à temperatura ambiente durante três minutos. Transfira o sobrenadante que contém o DNA genômico para um novo tubo marcado e armazene o gDNA a menos 20 graus Celsius.

Use os primers projetados para amplificar em torno da região alvo do sgRNA, conforme descrito no texto, para amplificar um fragmento de PCR para análise heteroduplex. Use um kit de limpeza de PCR para purificar os produtos da reação de PCR. Diluir as amostras em 30 microlitros de água e usar um espectrofotômetro para quantificar o DNA.

Coloque os tubos contendo os amplicons de PCR em um rack flutuante em banho-maria fervente. Em seguida, prepare um gel TBE de poliacrilamida a 15% usando poliacrilamida a 30%. Depois que o gel endurecer, coloque-o em um aparelho de eletroforese com tampão de execução TBE.

Em seguida, carregue 500 nanogramas dos produtos de PCR recozidos e carregue um controle próximo a cada conjunto de amostras de sgRNA. Execute o gel a 150 volts por duas horas e meia ou até que a frente do corante esteja na parte inferior do gel. Cresça embriões de peixe-zebra injetados até a idade adulta que mostram bandas heteroduplex no HMA.

Para interpretar o HMA, compare a intensidade da banda homoduplex da PCR do controle não injetado do tipo selvagem com as amostras injetadas correspondentes. Se tiver ocorrido um corte suficiente, a intensidade da faixa do peixe injectado deve ser aproximadamente 50% inferior à do controlo de tipo selvagem. Para confirmar a presença de indels em potenciais peixes fundadores fundadores, anestesie os peixes com 0,004% de tricaína e use uma lâmina de barbear limpa para remover 1/2 a 3/4 da barbatana caudal.

Em seguida, coloque a cauda em 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares. Retorne o peixe a um tanque de recuperação e execute a extração de gDNA conforme descrito anteriormente. Em seguida, execute um HMA no gDNA do clipe da cauda para determinar se o indivíduo foi modificado com sucesso pela injeção de CRISPR.

Em seguida, cruze os adultos que exibem bandas heteroduplex no DNA da cauda com peixes do tipo selvagem. Selecione peixes fundadores para gerar peixes F1 com base na análise HMA de piscinas. Finalmente, sequenciar o gDNA do peixe de interesse para caracterizar a natureza do indel.

Após a produção e microinjeção bem-sucedidas de reagentes CRISPR, os embriões de peixe-zebra foram analisados quanto a fenótipos evidentes e formação de indel usando HMA. A formação de indel induzida por Cas9 na tirosinase resulta em perda de pigmentação e é facilmente pontuada 48 horas após a fertilização. A identificação de alelos modificados por CRISPR que não resultam em fenótipos de desenvolvimento evidentes é realizada usando HMA.

O direcionamento bem-sucedido do gene de interesse resulta na formação de bandas heteroduplex e redução da intensidade da banda homoduplex, como nas pistas três e quatro. Não se esqueça de que trabalhar com um organismo vertebrado acarreta responsabilidades éticas. Este protocolo descreve estratégias que minimizam o número de zebrafish necessários para obter um nocaute, um objetivo que deve ser levado em consideração durante a realização deste procedimento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para gerar e identificar rapidamente peixes-zebra portadores de alelos modificados por CRISPR que serão transmitidos na linha germinativa com alta eficiência. É importante ressaltar que essa técnica foi otimizada para ser uma abordagem de baixo custo acessível a alunos de graduação e outros com pouca experiência anterior. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e implementar facilmente uma abordagem de nocaute genético baseada em CRISPR usando peixe-zebra.