Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

O objetivo geral deste procedimento é isolar a micróglia cortical de recém-nascidos murinos. Isso é realizado pela primeira dissecação de tecido cerebral cortical de recém-nascidos Muren. O segundo passo é cultivar culturas mistas de células gliais por 17 a 21 dias in vitro.

Em seguida, as microglias são isoladas dessas culturas gliais mistas. A etapa final é colocar células microgliais em placas de cultura de células para experimentação posterior. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência e Eliza são usadas para mostrar que este protocolo de isolamento preserva o fenótipo e a funcionalidade do imuno microglial.

A demonstração visual deste método é crítica, pois o SEP envolvido na micromicrodissecção é difícil de realizar. A execução bem-sucedida deste procedimento requer velocidade e precisão. Ou seja, ser muito lento reduzirá o rendimento celular, enquanto a remoção incompleta das meninges contaminará a cultura glial e impedirá o crescimento glial.

Comece preparando a mídia completa da microglia referida como MCM a seguir. Prepare um frasco por filhote e incube-o por pelo menos uma hora. Esta etapa de equilíbrio é essencial para o sucesso.

Em seguida, prepare a alíquota e leve à geladeira. Todos os meios necessários alíquota de seis mililitros de MCM para cada filhote e aquecer em banho-maria a 37 graus Celsius antes da dissecação. Limpe a estação de trabalho de fluxo de ar horizontal e o microscópio de dissecção com etanol a 70%.

Em seguida, coloque as ferramentas cirúrgicas esterilizadas necessárias para o procedimento na área de trabalho. Prepare um prato estéril com meios de dissecção para capturar a cabeça e outro para dissecação. Dispense o meio picador em seu próprio prato para picar o tecido cerebral.

Após a decapitação e extração do cérebro, coloque o cérebro recém-isolado sob um microscópio de dissecação para visualizar as cortesias, certificando-se de manter o lado dorsal para cima e seco. Prenda o cérebro inserindo as pontas das pinças na interseção do mesencéfalo e do córtex. Uma vez no lugar, remova completamente as meninges corticais dorsais.

Em seguida, remova as meninges ventrais para maximizar a pureza e o rendimento da microglia. É essencial remover completamente todo o tecido meníngeo. Separe os córtices do restante do cérebro.

Certifique-se de remover quaisquer meninges corticais residuais que possam estar presentes no lado ventral ou medial dos córtices. Com o tecido meníngeo removido, coloque os córtices na bandeja de picar preparada anteriormente. Trabalhando em um gabinete de segurança biológica de classe dois, use uma tesoura para picar o tecido cerebral.

Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 15 milímetros. Lave a tesoura e a forma de picar com um mililitro de meio picador cada para maximizar os rendimentos. Recolha e distribua estes enxaguantes para o tubo cónico de 15 mililitros que contém o tecido picado.

Deixe a suspensão de tecido intacta por um a dois minutos, permitindo que o tecido picado se deposite no fundo do tubo. Após esse tempo, remova e descarte cuidadosamente dois mililitros do sobrenadante, tomando cuidado para não romper o tecido picado sedimentado. Adicione três mililitros do MCM previamente aquecido ao tecido picado e, em seguida, triture o tecido com força.

Nenhum tecido sólido discernível deve permanecer quando o teste estiver completo. Adicione mais três mililitros de MCM usando a mesma ponta de pipeta para coletar a amostra triturada residual da ponta. Depois de coletado, centrifugue o tecido picado para peletar as células.

Quando terminar, devolva as células peletizadas ao gabinete de segurança biológica. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Gentilmente resus.

Suspenda o pellet celular com dois mililitros de MCM quente e, em seguida, adicione a suspensão de resus celular ao frasco preparado anteriormente. Incube as células por 24 horas. Após 24 horas, bata suavemente o frasco contra a palma da mão para romper os detritos do tecido.

Verifique as células antes e depois de bater para garantir que os detritos sejam completamente removidos. Em seguida, substitua o meio por MCM novo e devolva o frasco à incubadora. Verifique as células diariamente para monitorar o crescimento e a contaminação.

Após aproximadamente 17 a 21 dias, as células microgliais estarão prontas para a colheita para determinar se as células estão prontas, examiná-las em um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia está pronto para a colheita. Quando atingem aproximadamente 40% de fluência, aparecem como células esféricas pequenas e brilhantes crescendo como uma monocamada em cima de outras.

Para isolar, a micróglia bate vigorosamente o frasco contra a bancada do laboratório. Essa agitação ajuda a separar a microglia de outras células gliais devido às propriedades de baixa aderência da microglia. Selar as tampas dos frascos com paraforme e rodar as culturas gliais mistas utilizando um agitador rotativo não humidificado com temperatura controlada durante cinco horas.

Após este tempo, inspecione visualmente se a micróglia se levantou da superfície do frasco. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, as microglias são células flutuantes esféricas brilhantes. Haverá uma camada residual de astrócitos e oligodendrócitos aderidos ao fundo do frasco.

Em seguida, colete o sobrenadante contendo a micróglia em um tubo de centrífuga cônico estéril e palato. Resus. Suspender o sedimento microglial em meio de crescimento microglial quente e determinar a concentração celular utilizando uma placa de hemocitómetro. As células em um formato de placa de 24 poços em plástico ou vidro estéril lamínulas 24 horas depois.

Substitua a mídia por MGM quente para remover células flutuantes e detritos. Esta etapa é crítica para a sobrevivência celular e para manter a microglia quiescente, as células da microglia estão prontas para experimentação imediatamente após esta etapa de realimentação para avaliar a pureza microglial. Culturas de células derivadas de microglia expressando endogenamente GFP foram coradas para o antígeno de macrófagos IBA um e contra-coradas com dapi.

Para visualizar o núcleo celular, mais de 95% das células exibiram colocalização de GFP IBA um e dpi. Depois de desafiar as células com LPS, a microglia adotou uma mudança morfológica acentuada de um pequeno fenótipo bi para uma forma semelhante a um amebóide. A coloração imunofitoquímica para P 65 evidencia que, em condições normais, o P 65 está difusamente localizado em todo o citoplasma.

Considerando que, após uma exposição de duas horas ao Pam P 65, a imunorreatividade mudou drasticamente a localização para o núcleo da célula para confirmar que a microglia isolada manteve sua funcionalidade imunoquímica bioquímica. A secreção da citocina pró-inflamatória TNF alfa foi determinada após exposição ao PAM ou LPS. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a micróglia cortical do espelhamento de neonatos para obter os melhores resultados.

É importante manter a técnica estéril e remover completamente o tecido meníngeo da região cortical dissecada.