Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos
30 de janeiro de 2014
Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
O objetivo geral deste procedimento é isolar micróglias corticais de neonatos murinos. Isso é realizado primeiramente por meio da microdissecação de tecido cerebral cortical de neonatos murinos. O segundo passo é cultivar culturas mistas de células gliais por 17 a 21 dias in vitro.
Em seguida, as microglías são isoladas a partir dessas culturas gliais mistas. O passo final consiste em semear as células microgliais em placas de cultivo celular para experimentações posteriores. Por fim, a microscopia de imunofluorescência e o ELISA são utilizados para demonstrar que este protocolo de isolamento preserva o fenótipo imunológico e a funcionalidade das microglías.
A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos envolvidos na microdissecação são difíceis de realizar. A execução bem-sucedida deste procedimento exige velocidade e precisão. Isso porque ser muito lento reduzirá o rendimento celular, enquanto a remoção incompleta das meninges contaminará o cultivo de gliócitos e dificultará o seu crescimento.
Inicie preparando o meio completo para micróglia, denominado aqui como MCM. Prepare um frasco por filhote e incube-os por pelo menos uma hora. Este passo de equilibracao e essencial para o sucesso.
Em seguida, prepare alíquotas e resfrie em gelo. Aliquote todos os meios necessários, seis mililitros de MCM para cada filhote, e aqueça em banho-maria a 37 graus Celsius antes da dissecação. Limpe a estação de fluxo laminar e o microscópio de dissecação com etanol 70%.
A seguir, coloque as ferramentas cirúrgicas esterilizadas necessárias para o procedimento na área de trabalho. Prepare um recipiente estéril com meio de dissecação para capturar a cabeça e outro para a dissecação. Distribua o meio de picagem em um recipiente separado para picar o tecido cerebral.
Após a decapitação e extração do cérebro, coloque o cérebro recém-isolado sob um microscópio estereoscópico para visualizar as estruturas, certificando-se de manter o lado dorsal voltado para cima e seco. Fixe o cérebro inserindo as pontas da pinça na interseção entre o mesencéfalo e o córtex. Uma vez posicionado, remova completamente as meninges corticais dorsais.
Em seguida, remova as meninges ventrais para maximizar a pureza e o rendimento de micróglias. É essencial remover completamente todo o tecido meningeal. Separe os córtices do restante do cérebro.
Certifique-se de remover todas as meninges corticais residuais que possam estar presentes no lado ventral ou medial dos córtices. Após a remoção do tecido meningeal, coloque os córtices no recipiente para picagem preparado anteriormente. Trabalhando em uma cabine de segurança biológica classe dois, use uma tesoura para picar o tecido cerebral.
Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 15 mililitros. Enxágue a tesoura e o recipiente de pique com um mililitro de meio de pique cada, para maximizar os rendimentos. Colete e transfira esses enxágues para o tubo cônico de 15 mililitros contendo o tecido picado.
Deixe a suspensão de tecido em repouso por um a dois minutos, permitindo que o tecido picado se sedimente no fundo do tubo. Após esse período, remova e descarte cuidadosamente dois mililitros do sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o tecido picado sedimentado. Adicione três mililitros do MCM previamente aquecido ao tecido picado e, em seguida, triture o tecido com força.
Nenhum tecido sólido discernível deve permanecer ao finalizar a triagem. Adicione mais três mililitros de MCM utilizando a mesma ponteira para coletar a amostra triturada residual da ponta. Após o recolhimento, centrifugue o tecido picado para obter o pellet celular.
Quando concluído, retorne as células em pellet para a câmara de segurança biológica. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Resuspenda suavemente.
Suspenda o pellet celular com dois mililitros de MCM morno e, em seguida, adicione a suspensão de ressuspendida ao frasco preparado anteriormente. Incube as células por 24 horas. Após 24 horas, bata suavemente o frasco contra a palma da mão para desagregar os detritos teciduais.
Verifique as células antes e depois da batida para garantir que os detritos foram completamente removidos. Em seguida, substitua o meio por MCM fresco e retorne o frasco ao incubador. Verifique as células diariamente para monitorar o crescimento e contaminação.
Após aproximadamente 17 a 21 dias, as células microgliais estarão prontas para colheita; para determinar se as células estão prontas, examine-as em um microscópio invertido de contraste de fase. As microglias estão prontas para colheita quando atingirem cerca de 40% de confluência, aparecendo como pequenas células esféricas brilhantes que crescem em monocamada sobre outras.
Para isolar, bata vigorosamente o frasco contra a bancada do laboratório para desprender as micróglias. Essa agitação ajuda a separar as micróglias de outras células gliais devido às propriedades de baixa aderência das micróglias. Selle as tampas dos frascos com parafilm e rotacione os cultivos mistos de células gliais utilizando um agitador rotatório controlado por temperatura, não umidificado, durante cinco horas.
Após esse período, inspecione visualmente se as microglias se desprendeu da superfície do frasco. Utilizando um microscópio invertido de contraste de fase, as microglias são células esféricas brilhantes e livres em suspensão. Haverá uma camada residual de astrócitos e oligodendrócitos aderida ao fundo do frasco.
Em seguida, colete o sobrenadante contendo as micróglias em um tubo cônico estéril para centrífuga e palato. Resuspenda o pellet de micróglias em meio de crescimento quente para micróglias e determine a concentração celular utilizando uma placa de hemocitômetro. As células em formato de placa de 24 poços sobre plástico ou lamínulas de vidro estéreis 24 horas depois.
Substitua o meio por MGM fresco e aquecido para remover células flutuantes e detritos. Esta etapa é fundamental para a sobrevivência celular e para manter microglia quiescentes; as células de microglia estão prontas para experimentação imediatamente após esta etapa de reposição do meio, a fim de avaliar a pureza microglial. Culturas celulares derivadas de microglia que expressam endogenamente GFP foram coradas para o antígeno de macrófago IBA1 e contra-coradas com DAPI.
Para visualizar o núcleo celular, mais de 95% das células exibiram colocalização de GFP IBA um e dpi. Após desafiar as células com LPS, as micróglias adotaram uma acentuada mudança morfológica, passando de um fenótipo bi pequeno para uma forma semelhante à de um amebóide. A coloração imunofitoquímica para P 65 evidencia que, em condições normais, P 65 está difusamente localizado por todo o citoplasma.
Enquanto após uma exposição de duas horas à Pam P, a imunorreatividade 65 mudou drasticamente sua localização para o núcleo celular, confirmando que as microglias isoladas mantiveram sua funcionalidade imuno-bioquímica. A secreção da citocina pró-inflamatória TNF alfa foi determinada após exposição à PAM ou LPS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar microglias corticais de neonatos semelhantes para obter os melhores resultados.
É importante manter uma técnica estéril e remover completamente o tecido meníngeo da região cortical dissecada.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para o isolamento de micróglias corticais de neonatos murinos, enfatizando a importância de preservar a imunofunção das micróglias durante o processo. O método de isolamento envolve a microdissecação do tecido cerebral, o cultivo de células gliais mistas e, posteriormente, o isolamento das micróglias para experimentação.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Antecedentes
- As micróglias desempenham um papel crucial no sistema nervoso central (SNC).
- Os métodos de isolamento podem afetar a funcionalidade das células microgliais.
- A preservação da imunofuncionalidade é essencial para resultados experimentais precisos.
- Estímulos pró-inflamatórios são utilizados para avaliar a ativação microglial.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para o isolamento de micróglias de neonatos murinos.
- Garantir que as micróglias isoladas mantenham seu imunofenótipo e funcionalidade.
- Facilitar experimentações futuras sobre a biologia das micróglias.
Métodos Utilizados
- Dissecação microcirúrgica de tecido cerebral cortical de neonatos murinos.
- Cultivo de células gliais mistas por 17 a 21 dias in vitro.
- Isolamento de micróglias a partir de culturas gliais mistas.
- Uso de microscopia de imunofluorescência e ELISA para avaliar a funcionalidade das micróglias.
Resultados Principais
- O protocolo de isolamento fornece culturas de micróglias altamente puras.
- As micróglias mantêm características imunofuncionais após o isolamento.
- A ativação com LPS e Pam 3 CSK 4 demonstra a funcionalidade preservada.
- A imagem fluorescente e a imunocitoquímica confirmam os resultados.
Conclusões
- O método de isolamento descrito é eficaz para obter micróglias funcionais.
- A preservação da imunofunção é fundamental para estudar a biologia das micróglias.
- Este protocolo pode ser aplicado a diversas configurações experimentais envolvendo micróglias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para o Setor Industrial
O isolamento de micróglia funcional de neonatos murinos permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos em neuroimunologia, preservando o imunofenótipo e a resposta a estímulos inflamatórios. Este modelo ex vivo sustenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, mantendo estados quiescentes e ativados relevantes para as vias de doenças do SNC. O método fornece um sistema relevante para doenças, permitindo a triagem de compostos imunomoduladores e a avaliação do engajamento de alvos em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de ativação de micróglias por meio de ensaios com desafio de LPS e Pam3CSK4.
- Valor Operacional: Gera micróglias corticais altamente puras com preservação da translocação nuclear de NF-κB p65 e da funcionalidade de secreção de TNF-α.
- Valor Preditivo: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos ao manter a fidelidade imunofenotípica desde estados quiescentes até estados pró-inflamatórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece um sistema padronizado de monocamada de micróglias para triagem de compostos após 17–21 dias de maturação da cultura de gliócitos.
- Valor Operacional: Permite a quantificação da pureza das micróglias por meio da colocalização IBA-1/GFP (>95%) e leituras funcionais como a liberação de citocinas.
- Prontidão do Ensaio: Micróglias isoladas exibem respostas morfológicas e funcionais a estímulos, permitindo um perfil confiável de dose-resposta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mantém a funcionalidade microglial ex vivo, apoiando a continuidade da descoberta à validação pré-clínica de alvos neuroinflamatórios.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Preserva a funcionalidade bioquímica (sinalização NF-κB, liberação de TNF-α) essencial para avaliar a modulação da via mediada por alvo.
- Relevância para Doenças: Modela estados de microglia quiescente e ativada, aplicáveis à pesquisa de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de isolamento se insere na sequência de descobertas, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, ao fornecer uma plataforma reprodutível de micróglias para estudos de mecanismo de ação e triagem fenotípica em neuroimunologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias por meio de ensaios de translocação de NF-κB e secreção de citocinas após desafio imunológico.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de rendimento, pureza e resposta funcional consistentes de micróglias após isolamento com agitador rotativo.
- Análises: Gera variáveis dependentes quantitativas, incluindo níveis de secreção de TNF-α e localização nuclear de p65, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a função de micróglias ex vivo à relevância in vivo por meio da preservação do imunofenótipo e da cinética de ativação.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável de isolamento de micróglias aplicável a múltiplas campanhas de validação de alvos no SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da preservação do imunofenótipo microglial e da funcionalidade responsiva a estímulos.
- Valor Operacional: Isolamento padronizado por agitação mecânica produz culturas microgliais reprodutíveis com pureza superior a 95% e integridade funcional.
- Valor Estratégico: Reduz a ambiguidade mecanicista em triagens de neuroimunologia ao manter o comportamento microglial ex vivo indicativo de estados in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos imunomoduladores com base no envolvimento comprovado com alvos em ensaios funcionais com microglia.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecidos murinos neonatais e técnicas estéreis de cultivo de células gliais.
- Depende de agitador rotativo com controle de temperatura e microscopia de contraste de fase invertida para o isolamento e verificação de micróglias.
- Necessita padronização da remoção das meninges e da duração do cultivo (17–21 dias) entre as equipes, para garantir o rendimento e a pureza das micróglias.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização do tempo de dissociação e das propriedades de adesão das micróglias.
- Limitação prática: o rendimento de micróglias depende da remoção completa do tecido meníngeo para evitar contaminação do cultivo glial.
